全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(5)：385 390
Journal of Wuhan Botanical Research
红莲型细胞质雄性不育性与线粒体渗透性转换
杨玖英 ，谭艳平 ，夏春皎 ，朱英国 ，刘学群
(1．中南民族大学化学与生命科学学院生物技术国家民委重点实验室，武汉 430074；
2．武汉大学生命科学学院植物发育教育部重点实验室，武汉 430072)
摘 要：以水稻红莲型细胞质雄性不育(HL—CMS)的不育系粤泰 A(YTA)、保持系粤泰 B(YTB)以及杂种 F 代红
莲 2号(HL2)的黄化苗为材料，研究了在不同pH及离子强度下线粒体渗透性转换(MPT)的发生及其差异 。结果表
明，YTA、YTB和 HL2间 MPT的发生均存在差别，不育系 YTA线粒体渗透性转换孑L(PTP)的开启与关闭对 pH
及离子强度的变化较保持系 YTB和 HL2敏感。HL2与 YTA虽然具有相同的细胞质来源，但两者之间 PTP及
MPT的特性明显不同，前者 MPT的变化与具有正常生理功能的 YTB线粒体的 PTP和 MPT的发生特点与特性
相似。这些说明红莲型水稻细胞质雄性不育的发生可能与其 MPT的发生有关。
关键词 ：线粒体；渗透性转换；细胞质雄性不育
中图分类号：Q943；$511 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)05—0385—06
Honglian Cytoplasmic M ale Sterility in Relation to Its M itochondrial
Permeability Transition
YANG Jiu—Ying ，TAN Yan—Ping ，XIA Chun—Jiao ，ZHU Ying—Guo ，LIU Xue—Qun ’
(1．Key Lab．_厂0r Biotechnology of National Committee for Nationalities，College of Chemistry and Life Science，
South—central University for Nationalities，Wuhan 430074。China；2．Key La b．of Ministry of Education for
Plant Developmental Biology，College of Life Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：The paper reports that mitochondrial permeability transition (MPT)may exist in
Honglian cytoplasmic male sterile(HL—CMS)rice．The results also showed that there are signifi—
cant differences of MPT occurrence and characteristics among the sterile line，YuetaiA (YTA)，
maintainer line，YuetaiB (YTB)，and the hybrid，Honglian Number 2 (HL2)derived from the
cross of YTA × 9311．The M PT of YTA iS more sensitive than those of YTB and HL2 to changes
of PH and ion density．Although HL2 has the same origin of CMS as that of YTA．and difference
from the normal cytoplasm of YTB．the occurrence and characteristics of permeability transition
pore(PTP)and MPT of HL2 are obvious different from YTA and much more similar to that of
YTB．It iS suggested that MPT might be involved in the abortive process of HL—CMS．
Key words：M itochondrion；Permeability transition；Cytoplasmic male sterility
植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterili—
ty，CMS)普遍存在于高等植物中，是受细胞核与细
胞质遗传物质双重控制的一种母性遗传现象 引。它
在选育粮食和经济作物强优势 F 代杂种时，具有重
要的意义 。随着杂种优势的广泛利用，对植物
CMS机理的研究显得越来越重要 。水稻 CMS是
应用最广泛的农作物之一，水稻 CMS主要分为野
败型(WA—CMS)、包台型(BT—CMS)和红莲型(HL一
歧穑日期：2003—12—21，修回日期；2004—05—31。
基金项目：国家973计划资助项目(2001CB108806)，湖北省自然基金资助项目(2004ABA132)。
作者简介：杨玖英(1978一)，女，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。
· 通讯作者(E—mal：xqliuw@public．wh．hb．cn)。
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386 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
CMS)三种类型[5]。对不同类型的水稻CMS不育系
与保持系线粒体基因组的比较分析，在 BT—CMS线
粒体基因组中发现的 o 79被认为与 BT—CMS相
关，核恢复基因 1参与非正常 B—atp D 79转
录本的有效加工与编辑L6 ]。在 HL—CMS水稻线粒
体基因组的研究中，同样也找到了与 HL—CMS相关
的特异性核苷酸序列[8 ]。其中orfH79与 BT—CMS
相关的o 79具有很高的同源性[8]。尽管对水稻线
粒体基因组的比较研究找到了可能与水稻 CMS相
关的核苷酸序列，但是不同类型水稻 CMS败育过
程的分子机制仍然不清楚。
线粒体(mitoehondrion，Mt)是由内外双层膜及
其所包含的膜内基质所构成的细胞器，是真核生物
合成 ATP的主要场所。线粒体膜结构的特征、特性
对于线粒体以及整个细胞行使各种正常生理功能关
系密切[1。。在动物线粒体膜上存在渗透性转换孔
(permeability transition pore，PTP)，当 PTP开启
时，线粒体内膜对中低分子量的化合物的渗透性会
突然增加，从而导致 线粒体基 质 中分子 量小于
1．5 KDa的游离物质渗漏进入膜间空间。这一过程
亦称为线粒体渗透性转换 (mitochondrion perme—
ability transition，MPT)[n]。PTP是线粒体 MPT功
能的结构基础[1引。PTP被认为是一种蛋白质复合
物，由线粒体部分蛋白和胞质中蛋白联合构成。其具
体构成可能包括胞液蛋白：己糖激酶(HK)、线粒体
外周蛋白：外周苯并二嗪受体(BPR)和电压依赖阴
离子通道(VDAC)、线粒体内膜蛋白：腺嘌呤核苷酸
转运体(ANT)及线粒体基质亲环蛋白(CphlD)等。
有证据表明，基于 PTP的MPT与细胞凋亡及细胞
程序性死亡等的早期及关键的事件有关[13,14]，MPT
被认为是反映线粒体膜完整性和功能的重要指标。
对动物细胞线粒体的研究表明，MPT常导致线粒体
结构与功能的一系列变化，能导致膜渗透势的破坏、
氧化磷酸化解偶联、膜内离子及代谢产物的渗出，使
线粒体因膨胀而外膜破裂等[u ”]。近年来，在植
物中证实亦有 PTP的存在，植物线粒体基于 PTP
的 MPT发生可能与动物线粒体具有相似的过程和
生理作用 引。
对 HL—CMS花粉发育的细胞学研究证明，HL—
CMS花粉 败育 与线粒体 的结 构及 功能异 常有
关L1 。我们比较研究了HL—CMS不育系粤泰 A
(YTA)、保持系粤泰 B(YTB)、以及具有 YTA不育
细胞质来源 ，但含有核恢复基因的杂种 F 代红莲 2
号 (HL2)线粒体在不同的 pH和离子浓度下 MPT
的变化，证实 HL—CMS的不育性可能与 HL—CMS
水稻线粒体 MPT的变化有关。
1 材料和方法
1．1 实验仪器
上海标本模型厂生产的DS一1高速组织捣碎
机，德国 Eppendorf公司生产的大容量冷冻离心机
5810R 及 美 国 PERKIN—ELMER 公 司 生 产 的
Lambda一35紫外／可见分光光度计。
1．2 实验材料
水稻红莲型不育系 YTA、保持系YTB以及杂
种 F 代 HL2种子(均由武汉大学生命科学学院植
物发育生物学教育部重点实验室遗传研究所提供)
去瘪粒后，先用 2 (W／V)次氯酸钠消毒 1～2 h，然
后在双蒸水中浸泡 48 h后用 0．01 的氯化汞处理
15 min，冲洗干净后再在 30~C 暗室中催芽 48 h，最
后 28℃暗室培养 10 d即得所需黄化苗。
1．3 线粒体的制备及处理
将培养好的黄化苗剪成1～2 am的小段放入组
织捣碎机 中，加入匀浆液 (0．4 mol·L 甘露 醇；
50 mmol·L～ pH7．4 Tris—HC1；10 mmol·L一
Na2EDTA；5 mmol·L KC1；0．1 牛血清 白蛋 白
及 0．05 p一巯基乙醇)于 4℃捣碎，经差速离心后再
用 Shelf buffer(O．6 mol·L 蔗糖；10 mmol·L
pH7．2 Tris—HC1及 20 mmol·L～ Na2EDTA)重悬 ，
收集 10 000 r／min(4℃)下的沉淀即为所提取的线
粒体。将所得线粒体用不加牛血清白蛋白和 f}-巯基
乙醇的匀浆液悬浮，用分光光度计在 500 nm波长
处测其悬浮液的吸光度，使各样品的浓度相等。然后
将它分别与不加牛血清白蛋白和 p一巯基乙醇的不同
pH值和由 Ca。+、K+、Na+、H+、C1一(Ca。+、K+、H+
浓度不变 ，改变 Na+和 Cl一浓度)组成的不同离子强
度( 一1／2∑CiZ )匀浆液按 1 t 2(V／V)混合，即得
到所需 pH值(7．0、7．2、7．4、7．6、7．8)和所需 值
( 1— 0．038 mol·L_。， 一 0．088 mol·L_。， 3—
0．138 mol·L～ ， 4 — 0．188 mol·L～， 5 —
0．238 mol·L )，终体积均为 3 mL。
1．4 指标设定
MPT的测定参照弓景波、Bernardi等[20,21 的方
法。设线粒体在不同溶液中开始的吸光度为 A。，即
时吸光度为 AIli ，△A—A。一AlIi ，△A／1．5 min代表
MPT的能力。在 540 nm波长处记录吸光度的变
化，以每间隔 1．5 min的 A值计算其 A， A随时
间变化的曲线即为 MPT变化曲线。
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第 5期 杨玖英等 ：红莲型细胞质雄性不育性与线粒体渗透性转换 387
2 结果与分析
2．1 不同 pH值对红莲型水稻线粒体 MPT的影响
红莲型水稻线粒体在不同pH条件下，在一定的
反应时间内，线粒体 MPT的变化随时间的延长而增
0．035
0．03O
0．025
< 0．020
司
0．0l5
0．0lO
0．005
0．000
0 5 l0 l 5 20 25 30
Time(min)
0．020
0．0l 5
0．010
0．005
0．000
O 5 lO l5 2O 25 3O
Time(min)
大，此后线粒体MPT的变化趋于平稳(图1)。YTA
线粒体在 20 min左右线粒体 MPT的变化达到最大
值(图 1：A)。YTB和HL2线粒体 MPT随时间的变
化趋势相同(图 1：B，C)，但与 YTA的不同。二者在
25 rain后线粒体 MPT的变化才趋于平稳。
0．025
0．020
0．015
<
司
0．0l0
0．005
0．000
0．5
0．4
0．3
<
q
0．2
0．1
0．0
0 5 lO l 5 20 25 30
Time(min)
7．0 7．2 7．4 7．6 7．8
pH
A．不育系YTA；B．保持系YTB C．杂种Fl代HL2；D．反应时间30min时 MPT变化的比较
A．Cytoplasmic male sterile line YTA ，B．Maintainer line YTB；C．Hybrid rice HL2，D．M PT com—
parison between YTA。YTB and HL2(reaction time 30 rain)
图 1 pH对红莲型水稻线粒体 MPT的影响
Fig．1 Effect of pH on MPT of HL—CMS rice
在pH7．O～7．6范围内，不育系YTA线粒体的
MPT变化随 pH的上升明显增大(图 1：A)。当pH
继续加大时，其 MPT的变化值不再增加，pH7．6时
MPT速率增加较快，达到平衡所需时间短。
不同 pH对保持系 YTB线粒体 MPT的影响
(图 1：B)明显不同于对不育系YTA线粒体的MPT
作 用(图 1)。当 pH7．0时，YTB和 YTA线粒体
MPT均受到抑制。pH7．2～7．8范围内，YTB线粒
体 MPT随 pH变化，在开始 15 min左右无明显差
异，随着时间的延长，pH7．4时的MPT变化值略高
于在pH7．2、7．6、7．8下的变化。图 1：B结果显示，
保持系线粒体 MPT 的变化不及 不育 系线粒体
MPT的变化对环境pH变化那么敏感，具有较宽的
pH适应范围。
HL2线粒体 MPT随 pH的变化(图 1：C)与不
育系YTA(图 1：A)和保持系 YTB(图 1：B)均有所
不同。在 pH7．8时，虽然 HL2线粒体 MPT的变化
灵敏度比在其它 pH值条件下略高，但在 pH7．2～
7．6范围内其差异不显著。尽管 HL2与 YTA具有
相同的细胞质来源，但 HL2线粒体 MPT随 pH的
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388 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
变化趋势与 YTA线粒体差异显著(图 1：A，C)，而
与YTB的更为接近(图 1：D)。具有与 YTA相同细
胞质来源的 HL2线粒体 MPT的变化 ，可能正反映
了在不同核背景下，特别是恢复基因的作用对线粒
体结构与功能的影响。
2．2 不同离子强度对红莲型水稻 MPT的影响
在 YTA、YTB及 HL2线粒体 MPT变化都比
较明显的 pH7．4条件下，研究了不同离子强度对线
粒体 MPT的影响。从图 2可以看出，不同离子强度
下 MPT的变化随时间的延长而增大，此后趋于平
缓。这一变化虽然与不同pH对线粒体 MPT的影响
趋势相近，但三者之间，特别是 YTA与 YTB之间
的差异不及不同 pH值下出现的差异那么明显。在
O．0
O．0
O．0
< O．0
q
O．0
0．0
O．0
O．O
O．1 O
O．O8
< O．06
司
0．04
O．O2
O．OO
O 5 l O l 5 2O 25 3O
Time(min1
0 5 l 0 l 5 2O 25 3O
Time(min1
离子强度 >0．238 tool·L 时，三者线粒体 MPT
值几乎相同(图 2：D)。
由于线粒体孔的开启是全或无的关系，△A表现
为膨胀线粒体部分所占总线粒体的比例[2。。 膨胀得
越多，△A的值就越大。YTB和 HL2的MPT变化达
到最大值所需要的时间比YTA长，前者均在 14 min
以后(图 2：B，C)，而后者在 10 min后 MPT值就趋
于最大(图 2：A)。表明在实验的离子强度范围内
YTA线粒体较 YTB及 HL2线粒体更易于膨胀。
不 育 系 YTA 的线 粒 体，当离 子 强 度 为
0．088 tool·L 时，MPT的变化最明显(图 1：A)，并
与 HL2线粒体的相同(图2：C)。YTB线粒体 MPT
变化幅度在检测的离子强度范围内，随离子强度增
O 5 lO l5 2O 25 3O
Time【min)
0．05 0．10 0．1 5 O．2O O．25
(mol／L)
A．不育系YTA；B．保持系YTB；C．杂种 F1代HL2；D．反应时间 30 min时MPT变化的比较。离子强度
I一0．038 mo卜L～ ； 2—0．088 mo卜L_。； 一 0．138 mo卜L_。； 一0．188 mo卜L_。； s一0．238 mo卜L一
A．Effect of on M PT of YTA ；B．Effect of on M PT of YTB；C．Effect of on M PT of hybrid rice HL2；
D．M PT comparison between YTA，YTB and HL2 (reaction time 30 min)．Ion intensity 1— 0．038 mo卜
L～ ； 2—0．088 mo卜L一 ； 一0．138 mo卜L一 ； 一 0．188 mo卜L～ ； s一0．238 mo卜L一
图 2 离子强度 对红莲型水稻线粒体 MPT的影响
Fig．2 Efleet of on MPT of HL．CMS rice
∞
O O O O O O O O
《日
4 ，一 O 8 6 4 2 O
● ● ● O O O O O
、，日
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第 5期 杨玖英等：红莲型细胞质雄性不育性与线粒体渗透性转换 389
大而变小。在 肛为 0．038 mol·L 时，MPT变化最
大(图 2：B)。HL2线粒体 MPT随时间的变化趋势
与 YTB相似，而随离子强度的变化趋势又与 YTA
线粒体的相近。这表明虽然HL2与 YTA具有相同
的细胞质来源，但在恢复基因存在下，线粒体尽管部
分具有 YTA的线粒体特征，但更类似于正常可育
的YTB线粒体的特性。
3 讨论
自19世纪 70年代在动物中发现 PTP及 PTP
的开启与线粒体基质的中、低分子量化合物的渗出
有关以来，基于 PTP的 MPT在动物细胞中得到了
广泛的研究L1h 引。原初 PTP的开启需要线粒体
基质 Ca。 的积累，许多因素能对 PTP的开启起调
节作用。磷酸、低膜 电位、巯基氧化剂、低 ATP水
平、脂肪酸及阴离子等有利于 MPT，而巯基还原剂、
低 pH、离膜电位以及除 Ca。 以外的其它两价阳离
子的作用则相反，能对 MPT起抑制作用。在植物
中，是否存在基于 PTP的 MPT发生及特性还缺乏
相关的实验证据。但动物细胞凋亡和植物细胞的程
序性死亡早期的关键性事件，如细胞色素 C外漏和
Caspase的激活具有共同的特点[ 引。Jones等[ 曾
讨论了线粒体及 PTP作为协迫感受器及信息传递
体在动物及植物细胞程序性死亡中的可能作用。
Arpagaus等D ]以马铃薯块茎线粒体为材料，首次
证实典型的基于 PTP的 MPT在植物中的存在。我
们的实验证实 MPT也可能在水稻植物中发生。水
稻线粒体在 pH7．0～7．8时，MPT随pH值的上升
而增大，pH低于 7．0时，MPT受到抑制。这一结果
与 Apagaus等[1 ]以马铃薯线粒体为材料所研究的
MPT结果相类似。Bernardi等[zs,z6]在对动物线粒体
MPT的研 究时发现，K 、Na 、Mg抖等离子均与
MPT密切相关。离子浓度高时，会导致线粒体 PTP
的关闭，从而抑制 MPT的发生。我们以水稻线粒体
为材料对水稻线粒体可能存在的 MPT研究时发
现 ，水稻线粒体可能存在的 PTP的开与关也与离子
强度密切相关。离子强度≥0．238 mol·L 时，A 。
测得的 △A明显降低，表明水稻线粒体 MPT受到
明显的抑制。
实验比较了不同 pH及离子强度下红莲型水稻
不育系、保持系及杂种F 代线粒体 MPT发生之间
的差异，结果暗示，红莲型水稻细胞质雄性不育的发
生可能与其 MPT的发生相关。综合图 1和图 2结
果可看出，不育系 YTA线粒体 PTP的开启与关闭
对环境协迫因子pH及离子强度的变化较保持系
YTB和 HL2敏感，这可能正是 YTA线粒体功能在
特定发育时期易于发生异常的主要原因之一。HL2
与 YTA具有相同的细胞质来源，但两者之间 PTP
及 MPT的特性明显不同，前者 MPT的变化确与具
有正常生理功能的 YTB线粒体的 PTP和 MPT的
发生特点及特性相似，这一现象的出现可能正是因
为在具有恢复基因的核背景下，使 HL2线粒体功能
恢复正常的结果。进一步对水稻雄性不育线粒体
MPT发生的其它特性的深入研究将为这一结论提
供更多的证据。
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