全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(６): ８５５~８６０
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ６０８５５
中国特有单种属血水草的微卫星分子标记开发与评价
王 静１ꎬ 胡 菀１ꎬ２ꎬ 阳 亿１ꎬ 肖 昆１ꎬ 范邓妹１∗ꎬ 张志勇１
(１􀆰 江西农业大学亚热带生物多样性实验室ꎬ 南昌 ３３００４５ꎻ ２. 江西农业大学林学院ꎬ 南昌 ３３００４５)
摘　 要: 血水草(Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ Ｈａｎｃｅ)是中国亚热带地区特有的单种属植物ꎮ 本研究采用(ＡＧ) １５、
(ＡＣ) １５ 两种生物素探针及磁珠富集法从血水草基因组中开发并筛选出 １３ 个微卫星位点ꎬ 且在该物种中能进行
稳定的 ＰＣＲ扩增并表现出多态性ꎮ 利用筛选出的 １３ 个 ＳＳＲ 多态性标记对血水草 ４ 个野生居群 ２４ 个个体进行
ＰＣＲ扩增ꎬ 结果显示每个微卫星位点的等位基因数为 ２ ~ ７ 个ꎬ 观测杂合度(ＨＯ )和期望杂合度(ＨＥ )分别为
０􀆰１２５ ~ ０􀆰７９２和 ０􀆰２９９ ~ ０􀆰６９１ꎮ 说明这些 ＳＳＲ标记可用于血水草遗传多样性的后续研究ꎬ 并揭示该物种地理
分布格局形成的原因ꎬ 有助于保护和利用中国亚热带地区的血水草野生资源ꎮ
关键词: 血水草ꎻ 罂粟科ꎻ 微卫星ꎻ 磁珠富集法ꎻ 遗传多样性
中图分类号: Ｑ７５　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０６￣０８５５￣０６
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０６￣１７ꎬ 退修日期: ２０１５￣０７￣１８ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金(３１１６００４３ꎬ ３１１６００８２)ꎻ 国家科技支撑计划项目(２０１２ＢＡＣ１１Ｂ０２)ꎮ
　 作者简介: 王静(１９７５－)ꎬ 女ꎬ 硕士ꎬ 研究方向为系统与进化植物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｊｍｎ＿３１４５６＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄｍｆ􀆰 ６２５＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ
Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａꎬ ａ Ｍｏｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｅｎｄｅｍｉｃ ｔｏ Ｃｈｉｎａ
ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ１ꎬ ＨＵ Ｗａｎ１ꎬ２ꎬ ＹＡＮＧ Ｙｉ１ꎬ ＸＩＡＯ Ｋｕｎ１ꎬ ＦＡＮ Ｄｅｎｇ￣Ｍｅｉ１∗ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ￣Ｙｏｎｇ１
(１. Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４５ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ ｉｓ ａ ｍｏｎｏｔｙｐｉｃ ｓｐｅｃｉｅｓ ｅｎｄｅｍｉｃ ｔｏ ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｈｉｎａ. Ｉｎ ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙꎬ １３ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ Ｅ. ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ ｂｙ
ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔꎬ ｗｉｔｈ ｂｉｏｔｉｎ￣ｌａｂｅｌｌｅｄ (ＡＧ) １５ ａｎｄ (ＡＣ) １５ ｐｒｏｂｅｓ. Ｔｈｅｓｅ ｌｏｃｉ ｗｅｒｅ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ. Ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ｅａｃｈ ｌｏｃｕｓ ｗａｓ
ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｍｏｎｇ ２４ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ａｌｌｅｌｅｓ ｐｅｒ ｌｏｃｕｓ ｖａｒｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｔｏ ｓｅｖｅｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ
ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０􀆰１２５ ｔｏ ０􀆰７９２ ａｎｄ ｆｒｏｍ ０􀆰２９９ ｔｏ ０􀆰６９１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅｓｅ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｌｌ
ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅ. ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｈｅｌｐ
ｃｌａｒｉｆｙ ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｗｉｌｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｅ. ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ ｉｎ ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｈｉｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａꎻ Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅꎻ Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓꎻ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｅｎ￣
ｒｉｃｈｍｅｎｔꎻ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
　 　 血水草(Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ Ｈａｎｃｅ)为罂粟
科(Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ)血水草属多年生草本植物ꎬ 是
我国特有的单种属植物[１]ꎬ 广泛分布在中国亚热
带东部湿润的常绿阔叶林区ꎮ 血水草具匍匐根茎ꎬ
叶心形且全部基生ꎬ 花葶细长、 直立ꎬ 花朵较大、
白色[１]ꎬ 常成片生长于阴暗潮湿环境中ꎬ 可作为
地被观赏植物应用于公园或保护区的水缘造景ꎮ 此
外ꎬ 血水草植株内含有丰富的生物碱ꎬ 具有抗菌、
抑菌和灭螺的功能ꎬ 是一种开发生态型绿色药物的
优良野生植物[２]ꎮ 血水草的适生生境对水分条件
的要求较高ꎬ 再加上长期的人为采挖和移栽ꎬ 导致
现存的野生血水草的生境片段化现象非常严重(张
志勇野外调查资料)ꎬ 其野生种群正呈现逐步缩小
的趋势[３]ꎮ 因此ꎬ 采用合适的分子标记对现有血
水草野生居群的遗传多样性和遗传结构进行评价ꎬ
可深入探讨血水草形成目前分布格局的原因ꎬ 为制
定相应的保护措施提供依据ꎮ
植物谱系地理学和群体遗传学研究中最常用
的分子标记虽是叶绿体基因组片段ꎬ 但因被子植
物叶绿体基因组为母系遗传ꎬ 其只能反映种子
流ꎬ 无法反映花粉流[４] ꎮ 近年来ꎬ 直接获取单拷
贝或低拷贝核基因序列已成为主要趋势[５] ꎬ 但从
杂合子中获得等位基因序列通常需要克隆测序ꎬ
导致实验时间长且花费较高ꎮ 微卫星分子标记
(ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔꎬ ＳＳＲ)是根据已知微
卫星位点(１ ~ ６ 个核苷酸串联重复序列)两侧的
ＤＮＡ序列来设计特异性引物ꎬ 并经 ＰＣＲ 扩增和
电泳检测位点长度多态性[６] ꎮ 由于具有多态性
高、 共显性、 重复性好、 容易筛选和分析等诸多
优点ꎬ ＳＳＲ标记是目前遗传多样性和遗传结构研
究中的首选标记之一[７ꎬ８] ꎮ 随着荧光毛细管电泳
技术在微卫星扩增和检测中的应用ꎬ 微卫星标记
的开发更加高效和廉价ꎮ 本研究拟开发血水草的
微卫星分子标记ꎬ 并利用中国亚热带地区 ４ 个血
水草居群对这些 ＳＳＲ 标记进行筛选和初步检测ꎬ
以期获得适于血水草遗传多样性和遗传结构研究
的微卫星分子标记ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
４个血水草野生居群材料分别来自江西省黎川
县、 芦溪县、 上犹县和修水县(表 １ꎬ 图 １)ꎬ 采集
新鲜、 健康的幼嫩叶片放入置有变色硅胶的采样袋
中迅速干燥ꎬ 带回实验室后于－２０℃冰箱中保存、
备用ꎮ ４个血水草野生居群的采集凭证标本保存于
江西农业大学亚热带生物多样性实验室(ＪＸＡＵ)ꎮ
表 １　 四个血水草野生居群的采样信息
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓａｍｐｌｉｎｇ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ
居群编号
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ｃｏｄｅｓ
采集地点
Ｌｏｃａｔｉｏｎ
样品数
Ｓａｍｐｌｅ Ｎｏ.
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
海拔
Ａｌｔｉｔｕｄｅ
(ｍ)
标本号
Ｖｏｕｃｈｅｒ Ｎｏ.
ＬＣ 江西省黎川县 Ｌｉｃｈｕａｎꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ６ ２７°０４′１０″ １１６°５５′５７″ ６８２ ＪＸＡＵ３５２８６
ＬＸ 江西省芦溪县 Ｌｕｘｉꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ６ ２７°３３′４１′ １１４°１１′３６″ ５２５ ＪＸＡＵ３５２９４
ＳＹ 江西省上犹县 Ｓｈａｎｇｙｏｕꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ６ ２５°５５′０３″ １１４°０３′０３″ ８５２ ＪＸＡＵ３５３０７
ＸＳ 江西省修水县 Ｘｉｕｓｈｕｉꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ６ ２８°４７′１４″ １１４°４４′２０″ ６５１ ＪＸＡＵ３５２５４
XS
LX LC
SY
0 180 360
km
W
N
S
E
右图中红色圆点代表本研究血水草居群的采集地点ꎮ
Ｒｅｄ ｄｏｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｆｉｇｕｒｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｓａｍｐｌｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ.
图 １　 血水草生境及其地理分布图
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｈａｂｉｔａｔ ａｎｄ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ
６５８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＤＮＡ提取
采用改良的 ＣＴＡＢ 法[９]提取血水草干燥叶片
的基因组 ＤＮＡꎬ 并置于－２０℃冰箱保存、 备用ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 微卫星富集文库的构建与克隆筛选
利用 ＦＩＡＳＣＯ(Ｆａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＡＦＬＰ ｏｆ Ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｒｅｐｅａｔｓ)方法[１０]构建血水草
基因组微卫星富集文库ꎬ 其实验操作流程如下:
(１)基因组 ＤＮＡ 酶切与接头连接ꎮ 采用内切
酶 Ｍｓｅ Ｉ(１０ Ｕ / μＬꎬ ＭＢＩꎬ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓꎬ Ｌｉｔｈｕａｎｉａ)
在 ３７℃条件下酶切 ＤＮＡ ３ ｈꎬ 然后置于 ６５℃
１０ ｍｉｎ对内切酶进行灭活处理ꎻ 酶切反应体系为
２５ μＬꎬ 包括 ２􀆰 ５ μＬ ＮＥＢ２、 ０􀆰２５ μＬ ＢＳＡ、 ０􀆰２５ μＬ
Ｍｓｅ Ｉ内切酶、 １０ μＬ ＤＮＡ (５０ ｎｇ / μＬ)、 １７􀆰２５ μＬ
灭菌双蒸水ꎮ 经电泳检测后ꎬ 挑选 ＤＮＡ 片段为
２００ ~ ８００ ｂｐ 的酶切产物与接头连接ꎬ Ｍｓｅ Ｉ 接
头序列分别为 Ｆ: ５′￣ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ￣３′和 Ｒ:
５′￣ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ￣３′ꎮ 连接反应体系为
３０ μＬꎬ 包括 ０􀆰４ μＬ Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ (５ Ｕ / μＬ)、 正
反接头各 ３ μＬ、 ３ μＬ Ｔ４ Ｂｕｆｆｅｒ、 １５ μＬ 酶切后的
ＤＮＡ、 ８􀆰６ μＬ灭菌双蒸水ꎬ ３７℃连接 ２ ｈꎻ 连接完
成后ꎬ 置于 ６５℃ １０ ｍｉｎ对连接酶进行灭活处理ꎮ
(２)连接产物预扩增ꎮ 将连接产物稀释 １０ 倍
后ꎬ 取出 ５ μＬ 作为模板ꎬ 并利用 Ｍｓｅ Ｉ￣Ｎ 引物
(５′￣ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＮ￣３′和 ５′￣ＴＴＡＣＴＣＡＧ￣
ＧＡＣＴＣＡＴＣＮ￣３′)进行 ＰＣＲ扩增ꎻ 然后使用上海生
工 ＳａｎＰｒｅｐ柱式 ＰＣＲ产物回收试剂盒对扩增产物
进行纯化ꎮ ＰＣＲ 反应程序为: ９５℃预变性３ ｍｉｎꎻ
９４℃变性 ３０ ｓꎬ ５３℃退火 １ ｍｉｎꎬ ７２℃延伸 １ ｍｉｎꎬ
２６个循环ꎻ 最后 ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
(３)生物素探针杂交与磁珠富集ꎮ 以(ＡＧ) １５
和(ＡＣ) １５为生物素探针ꎬ ９５℃变性５ ｍｉｎꎬ ４８℃杂交
２ ｈꎮ ２５０ μＬ 杂交体系中包括 ３０ μＬ ＤＮＡ、 ５２􀆰５ μＬ
２０ × ＳＳＣ、 １􀆰７５ μＬ １０％ ＳＤＳ、 １􀆰５ μＬ １００ ｐｍｏｌ / Ｌ生
物素探针、 １６４􀆰２５ μＬ双蒸水ꎮ 采用 Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍａｇ￣
ｎｅＳｐｈｅｒｅ磁珠对微卫星片段进行富集: 将已与生
物素探针杂交的 ＤＮＡ 和制备的磁珠悬浮液混匀ꎬ
室温放置 ３０ ｍｉｎꎻ 在磁场中吸附磁珠并吸取上清ꎻ
非严格洗涤分别采用 ６００ ｍＬ 和 ８００ ｍＬ ＴＥＮ１０００
(１０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣＬ ＋ １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＤＴＡ ＋ １ ｍｏｌ / Ｌ
ＮａＣｌꎬ ｐＨ ７􀆰５)在室温下顺次冲洗磁珠 １ ~ ２ 次ꎬ
每次 ３ ~ ５ ｍｉｎꎬ 严格洗涤则采用 ５００ μＬ 洗脱液
(１０ μＬ ２０ ×ＳＳＣ ＋ １０ μＬ １０％ ＳＤＳ ＋ ９８０ μＬ双蒸
水)在 ４２℃条件下冲洗磁珠 ３ 次ꎬ 每次 ５ ｍｉｎꎻ 加
入 ５０ μＬ ＴＥꎬ ９５℃变性 ５ ｍｉｎꎬ 使目的片段从杂
交复合物上解离下来ꎬ 磁珠吸附并收集上清液ꎬ
同时配置 ５０ μＬ变性液(１２ μＬ １０ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＯＨ ＋
１１􀆰 ５２ μＬ ＨＡｃ ＋ ２６􀆰 ４８ μＬ ＴＥ)加入到磁珠中再一
次变性ꎬ 磁珠吸附后收集上清液ꎮ 取富集回收杂
交产物５ μＬꎬ 以 Ｍｓｅ Ｉ￣Ｎ为简并引物进行 ＰＣＲ扩
增ꎬ 然后利用上海生工 ＳａｎＰｒｅｐ 柱式 ＰＣＲ 产物
回收试剂盒进行纯化ꎮ
(４)克隆筛选与测序ꎮ 采用 ｐＬＢ 零背景快速
克隆试剂盒(Ｔｉａｎｇｅｎ)对已纯化的 ＰＣＲ 产物进行
克隆筛选ꎮ 将 ＰＣＲ产物与 ｐＺｅｒｏＢａｃｋ / ｂｌｕｎｔ载体
连接并转入大肠杆菌感受态细胞中ꎬ 挑取培养皿
中的白色菌斑ꎬ 经液体培养基培养后ꎬ 用引物
(ＡＧ) １０或 (ＡＣ) １０和载体引物 ( ５′￣ＣＧＡＣＴＣＡＣ￣
ＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＧＧＣ￣３′和 ５′￣ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧ￣
ＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧ￣３′)进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ 筛选出
含有微卫星 ＤＮＡ 序列的阳性克隆ꎬ 并送至上海
生物工程有限公司测序ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 微卫星引物设计
采用 Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ Ｆｉｎｄｅｒ 软件对获得的
ＤＮＡ片段序列进行微卫星分析[１１]ꎻ 然后用 Ｏｌｉｇｏ
７􀆰０软件[１２]在微卫星两翼设计引物ꎮ ＳＳＲ 引物由
上海生工生物工程有限公司合成ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 引物检测
在血水草的 ４ 个野生居群中分别随机选取 １
份 ＤＮＡ样品ꎬ 并利用合成的微卫星引物对其进
行 ＰＣＲ扩增ꎮ ＰＣＲ 反应体系为 １０ μＬꎬ 主要包括
２０ ~ ５０ ｎｇ 模板 ＤＮＡ、 ０􀆰５ μｍｏｌ / Ｌ 正、 反向引
物、 ５ μＬ ２ ×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ ( Ｔｉａｎｇｅｎꎻ 含
０􀆰 １ Ｕ / μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ０􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ
ｄＮＴＰ、 ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ [ｐＨ ８􀆰３]、 １００ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＫＣｌ、 ３ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２)ꎮ ＰＣＲ 反应程序为: ９５℃
预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９４℃变性 ４５ ｓꎬ ４５ ~ ６０℃(每对引
物退火温度不同)退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 ４５ ｓꎬ ３２ ~
３５个循环ꎻ 最后 ７２℃延伸 ５ ｍｉｎꎮ 采用 ８％非变性
聚丙烯酰胺凝胶对 ＰＣＲ 扩增产物进行电泳检测ꎬ
７５８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 王 静等: 中国特有单种属血水草的微卫星分子标记开发与评价
其中对能够成功扩增的引物进一步优化其最佳反应
条件ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ５　 多态性引物筛选与分析
选择能够成功扩增的引物对 ４个血水草野生居
群共 ２４个个体(表 １)进行 ＰＣＲ扩增ꎬ 以期从中筛
选出谱带清晰、 扩增稳定性好、 多态性高的 ＳＳＲ
引物ꎮ ＰＣＲ产物经 ８％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离ꎬ 并根据每个个体产生的条带位置确定其基因
型ꎬ 再利用 ＧｅｎＡｌＥｘ Ｖ􀆰６􀆰３ 软件[１３]进行居群遗传
多样性分析ꎬ 计算每个多态性位点的等位基因数
(ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅꎬ ＮＡ)、 观测杂合度(ｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ＨＯ ) 和期望杂合度 ( ｅｘｐｅｃｔｅｄ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ＨＥ)ꎮ
２　 结果与分析
从富集的微卫星文库中挑选 ２５３ 个阳性克隆
进行测序ꎬ 然后对获得的 ＤＮＡ 片段序列比对ꎬ 发
现有 ２２７ 条序列(９０％)含有非同源微卫星片段ꎬ
其中 ２０３条(８９􀆰４％)含 ＡＧ 重复ꎬ ２４ 条(１０􀆰６％)
含 ＡＣ重复ꎮ 去除重复序列和长度较短的序列ꎬ 以
微卫星重复单元位于中部的序列共设计了 １６２ 对
特异性引物１)ꎬ 然后从中挑选 ８２ 对 ＳＳＲ 引物进行
合成ꎮ
用 ４个血水草样本对合成的 ８２对 ＳＳＲ引物进
行初步检测发现ꎬ 有 ５２ 对引物能扩增出与预期片
段大小相同或相近的 ＤＮＡ 条带ꎮ 然后ꎬ 利用初步
筛选的 ５２对 ＳＳＲ引物对 ２４ 个血水草野生居群样
品进行 ＰＣＲ扩增ꎬ 结果显示有 ３３对引物扩增条带
清晰且稳定性较好ꎬ 但其中 １２ 对引物没有检测到
微卫星多态性ꎬ ８对引物呈现非特异性扩增ꎬ 因此
共成功选择出适于血水草野生居群遗传多样性分析
的 １３对多态性较高的 ＳＳＲ引物(表 ２ꎬ 图 ２)ꎮ
表 ２　 血水草 １３对微卫星引物的特征分析
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ １３ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ Ｅｏｍｅｃｏｎ ｃｈｉｏｎａｎｔｈａ
位点
Ｌｏｃｕｓ
引物序列 (５′－ ３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
重复单元
Ｒｅｐｅａｔ
ｍｏｔｉｆ
退火温度
Ｔｍ
(℃)
片段大小
Ａｌｌｅｌｅ ｓｉｚｅ
(ｂｐ)
等位
基因数
ＮＡ
观测
杂合度
ＨＯ
期望
杂合度
ＨＥ
序列号
ＧｅｎＢａｎｋ
ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.
ＸＳＣＯ１１ Ｆ: ＧＣＴＣＧＧＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＴＲ: ＧＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＣＡＡ
(ＣＴ) １６ ５０.５ １８６ ４ ０.５８３ ０.４５５ ＫＰ８９２７３１
ＸＳＣＯ３５ Ｆ: ＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＧＧＣＲ: ＡＣＧＧＴＡＣＧＧＡＡＴＧＡＡＡＧＴ
(ＴＣ) １８ ４８ １７７ ６ ０.４５８ ０.４３８ ＫＰ８９２７３２
ＸＳＣＯ３７ Ｆ: ＡＧＴＴＴＣＡＣＡＴＡＡＴＣＧＧＣＲ: ＧＧＴＣＡＧＧＡＴＴＧＧＧＧＴＡＡ
(ＴＣ) １０ ４６ １１９ ６ ０.７９２ ０.６３９ ＫＰ８９２７３３
ＸＳＣＯ７８ Ｆ: ＴＧＡＡＣＴＣＧＣＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＣＲ: ＣＴＧＡＧＴＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴＴＧＣＧ
(ＣＴ) １０ ５７ １５５ ２ ０.２５０ ０.２９９ ＫＰ８９２７３４
ＸＳＣＶ４２ Ｆ: ＣＴＧＡＧＴＡＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＧＲ: ＣＡＣＡＴＡＡＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＡＡＣ
(ＧＡ) ８ ５１.５ １３１ ４ ０.１２５ ０.３７５ ＫＰ８９２７３８
ＸＳＣＱ１３ Ｆ: ＧＡＴＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＲ: ＧＣＣＣＴＡＣＴＧＡＡＴＧＣＴＴＧＴ
(ＧＡ) １２ ６０ １９９ ７ ０.６２５ ０.６５３ ＫＰ８９２７３５
ＸＳＣＱ２５ Ｆ: ＴＧＡＧＣＧＧＡＴＴＡＧＧＡＴＡＡＧＧＲ: ＣＧＡＴＡＣＴＡＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴ
(ＴＣ) ８ ５３.４ ２１８ ４ ０.４１７ ０.５５６ ＫＰ８９２７３６
ＸＳＣＱ６０ Ｆ: ＡＣＡＧＣＡＴＴＧＡＧＧＴＴＴＡＧＣＡＲ: ＡＴＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＡＴＣＣ
(ＧＡ) ９ ４４.７ ２１８ ４ ０.３３３ ０.３３３ ＫＰ８９２７３７
ＸＳＣＶ３５ Ｆ: ＴＧＡＧＴＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＲ: ＡＴＣＴＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＡＣＣＧＴＣ
(ＡＧ) １１ ６０ １０４ ６ ０.２９２ ０.６９１ ＫＲ７８１５００
ＸＳＣＶ５１ Ｆ: ＴＡＡＣＡＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＡＲ: ＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＴＡＴ
(ＧＡ) ８ ５６.７ １７２ ５ ０.５８３ ０.５７６ ＫＲ７８１５０１
ＸＳＣＶ５４ Ｆ: ＴＧＡＣＡＡＡＴＧＧＡＴＡＧＧＧＡＴＧＣＲ: ＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧ
(ＡＧ) １２ ５１ ２２１ ６ ０.２９２ ０.５５２ ＫＲ７８１５０２
ＸＳＣＱ６２ Ｆ: ＡＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＣＴＲ: ＡＧＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＧＣＡＣＣＡＣ
(ＣＴ)５ 􀆺(ＣＴ)５ ５２.５ ２４３ ５ ０.５５０ ０.５０９ ＫＲ７８１４９８
ＸＳＣＳ７ Ｆ: ＣＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＡＧＲ: ＡＡＴＧＡＣＡＴＡＣＡＣＧＧＡＴＡＣＡＣ
(ＧＴ)１１(ＧＡ)１０ ５４ １１８ ５ ０.３４２ ０.５１８ ＫＲ７８１４９９
　 　 注: ＮＡꎬ 等位基因数ꎻ ＨＯꎬ 观测杂合度ꎻ ＨＥꎬ 期望杂合度ꎮ
Ｎｏｔｅｓ: ＮＡꎬ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎻ ＨＯꎬ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎻ ＨＥꎬ Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ.
　 　 　 １) 设计的 １６２对血水草 ＳＳＲ特异性引物ꎬ 如需查阅请与作者邮件联系ꎮ
８５８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
150 bp
100 bp
150 bp
200 bp
XSCO35
XSCO37
XSCO78
XSCQ13
LC1 LC2 LC3 LC4 LC5 LC6 LX1 LX2 LX3 LX4 LX5 LX6 M SY1 SY4 SY6 SY7 SY8 SY9 XS1 XS2 XS3 XS5 XS6 XS7
　 　 Ｍ: ＤＮＡ ｍａｋｅｒ.
图 ２　 部分微卫星位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｌｏｃｉ ｏｎ ８％ ｎｏｎ￣ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ
　 　 利用 １３ 对多态引物对 ４ 个血水草野生居群
２４个个体进行遗传多样性分析(表 ２)ꎬ 共检测到
６４ 个等位基因ꎬ 每个 ＳＳＲ 位点的等位基因数
(ＮＡ)为 ２ ~ ７ 个ꎬ 平均等位基因数 ５ 个ꎻ 观测杂
合度(ＨＯ)为 ０􀆰１２５ ~ ０􀆰７９２ (均值 ０􀆰４３４)ꎬ 期望
杂合度(ＨＥ)为 ０􀆰２９９ ~ ０􀆰６９１ (均值 ０􀆰５０７)ꎮ
３　 讨论
本研究通过 ＦＩＡＳＣＯ方法成功构建了血水草基
因组微卫星富集文库ꎬ 并且得到微卫星阳性克隆的
比率很高ꎬ 重复率也较低ꎬ 进一步从 ２５３ 个阳性
克隆中筛选出 ２２７ 条富含微卫星的序列ꎬ 效率高
达 ９０％ꎮ ＦＩＡＳＣＯ相对于传统的富集基因组文库方
法更为高效ꎬ 但其仍需进行酶切、 建库、 富集、 克
隆、 筛选等一系列较为繁琐的实验步骤[１０]ꎬ 因此
近年来采用高通量测序技术在植物中开发微卫星标
记的报道[１４ꎬ１５]越来越多ꎮ 高通量测序具有快捷、
高效等优点ꎬ 但其实验成本仍较高ꎬ 更适合于大规
模微卫星引物的开发ꎮ 在进行居群遗传多样性分析
时ꎬ 需要的微卫星位点数量较少ꎬ 目前 ＦＩＡＳＣＯ应
是一种高效且更加经济的微卫星标记开发方法ꎻ 随
着大批快速 ＤＮＡ 连接、 克隆等试剂盒的出现ꎬ
ＦＩＡＳＣＯ的实验方法也将更加快捷、 简便ꎮ
本研究获得的微卫星序列中ꎬ ＡＧ 重复类型所
占比例高于 ＡＣ 重复类型ꎬ 这与前人报道的植物
ＳＳＲ中的优势重复碱基类型一致[１６]ꎮ 一般来讲ꎬ
序列内碱基重复次数越高ꎬ 核心序列越长ꎬ 微卫星
多态性越好[１７ꎬ１８]ꎮ 我们从设计的 １６２ 对特异性
ＳＳＲ引物中挑选出 ８２ 对进行合成和筛选ꎬ 这 ８２
对引物的微卫星序列内碱基重复次数均 > ８ꎬ 有利
于筛选出多态性信息含量高且适于血水草居群遗传
多样性分析的微卫星位点ꎮ
利用筛选出的 １３对多态性 ＳＳＲ引物对血水草
４个野生居群的 ２４ 个个体进行遗传多样性检测发
现ꎬ 每个 ＳＳＲ 位点的平均等位基因数(ＮＡ )为 ５
个ꎬ 平均观测杂合度(ＨＯ)为 ０􀆰４３４ꎬ 平均期望杂
合度(ＨＥ)为 ０􀆰５０７ꎬ 这与罂粟科其他物种如多刺
绿绒蒿 ( ＨＯ ＝ ０􀆰４４２ꎬ ＨＥ ＝ ０􀆰４５８[１９] )、 虞美人
(ＨＥ ＝０􀆰５４７[２０])的遗传多样性参数相近ꎮ 血水草
为典型的异花授粉多年生草本植物[２１]ꎬ 其地理分
布范围广ꎬ 并且为集体开花模式ꎬ 对气候和环境变
化的生殖适应性强[２２]ꎬ 这些特性均有利于血水草
遗传变异的积累ꎻ 同时ꎬ 血水草作为第三纪孑遗物
种ꎬ 在长期进化中也积累了大量的遗传变异ꎮ 此
外ꎬ 笔者所在课题组基于叶绿体和核基因组片段序
列分析发现ꎬ 血水草的遗传多样性较高(未发表数
据)ꎬ 表明血水草资源减少的主要原因很可能是人
类活动的影响ꎬ 如大量采挖和生境破坏ꎮ 当然ꎬ 由
于本研究中的样本数量太少ꎬ 血水草野生居群的遗
９５８　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 王 静等: 中国特有单种属血水草的微卫星分子标记开发与评价
传多样性水平评估还需针对中国亚热带地区范围内
系统取样ꎮ 综上分析ꎬ 本研究开发的 ＳＳＲ 多态性
标记可用于血水草遗传多样性的后续研究ꎬ 进一步
揭示该物种地理分布格局形成的原因ꎬ 有助于保护
和利用中国亚热带地区血水草的野生种质资源ꎮ
致谢: 感谢江西农业大学农学院李波和雷抒情老师在
样品采集中给予帮助ꎻ 感谢呼慧丽、 袁琳和胡妍月同学在
实验中给予帮助ꎮ
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(责任编辑: 刘艳玲)
０６８ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷