全 文 ：第 6 卷
V ol
.
6 N o
第 3 期
3
草 地 学 报
A C I
,
A A C R I万 11A SI N CA
年
19 8
加速老化对高羊茅种子生理生化特性的影响
浦心春 ‘ 韩建国 毛培胜
(中国农业大学草地研究所 , 北京
王 培
(D 四4 )
摘要 : 本研究对未老化与加速老化处理的高羊茅种子进行发芽率 、浸出液电导率 、葡萄糖含
量 、超氧化物歧化酶(so n) 同工酶 、发芽过程中 八)11〕 含量的测定结果表明 , 高羊茅种子随着老化时
间的增加 , 发芽率和发芽势明显下降 , 而发芽势下降速度远大于发芽率。 老化种子浸出液的电导
率明显高于对照 , 并随着老化时间的延长 , 浸出液的电导率逐渐增加 , 浸出液中葡萄糖含量显著高
于对照 。 轻微老化可刺激高羊茅种子中超氧化物歧化酶 (so D )同工酶出现新的酶带 , 防止膜系统
受到破坏 。 与对照相 比 , 老化种子在发芽过程中 AIP 含量均明显地降低 , 严重老化种子在发芽前
期因 A T P利用受到限制 , A rll〕含量较高 , 但随着发芽的延续含量则大幅度降低 。
关键词 : 高羊茅种子 ; 人工加速老化 ; 生理生化变化
1 前言
种子产生劣变时 , 在发芽延迟 、种苗生长势降低 、发芽能力消失之前 , 往往在生理生化反应
上首先表现出来(Alx l日1一 Bak i等 , 197 0) , 这些生理生化变化常在种子吸水后一天或几小时 , 甚
至在未吸水的种子中就可测出 (H eyd e c ker , 19 72 )。 一般认为与种子活力或发 芽率有关 的生理
生化变化有 : ¹ 代谢活性下 降 , 如呼 吸速率降低 、种苗生长势 减弱 、发芽率下降 ( N o n n al l 等 ,
19 91 ; 从洲ltil 一 Bak i , 1% 9 ) 。 º 酶活性 的变化 , 水解 酶类 的活性增加 , 呼吸酶类 的活性 下 降
( Bas av ajap Pa
,
19 1)
。 » 膜透性增大 , 大量的糖分 、无机盐 、氨基酸等渗析 出来 (黄上志等 , 19 87 ;
Ch in g 等 , 19 68 ) 。 本研究以禾本科牧草高羊茅 (Fes t~ a I’u ndi ~ )
种子为材料 , 通过人工加速
老化 ,对不同老化程度的种子进行发芽率 、浸 出液电导率 、浸出液葡萄糖含量的变化 、超氧化物
歧化酶 ( SOD ) 同工酶 、发芽过程 中 AT P含量等生理生化指标测定 , 以揭示牧草种子衰老的机
制 , 为牧草和草坪种子贮藏提供理论依据 。
2 材料与方法
2
.
1 材料
高羊茅种子引 自美国 Jac kl in 种子公司 , 品种为 C~ lo
, 于试验前一年收获。 选择籽粒饱
满大小均匀的种子 , 贮藏于 4℃冰箱中备用 。
2
.
2 加速老化
在 45 ℃和 10 %相对湿度条件下对高羊茅种子进行人工加速老化 。 经过预备实验确定老
化时间为 % 小时 , 每间隔为 12 小时 (韩建国等 , 19 8 ) , 取 出不 同老化程度的种子进行 以 下测
定 。 以未处理的种子作对照 。
浦心春 同志现在 中国种子 集团公司工作
草 地 学 报 19 8 年
2
.
3 发芽率和发芽势测定
各重复 4 次 , 每次 10 粒种子 , 均匀分布在垫两层滤纸的培养皿 中 , 放人光照培养箱 (日飞日
一 15 0 一 G )
,
20
一 3 0℃变温 , 8 小时光照 , 16 小时黑 暗 , 初次计数为 7 天 , 其发芽数作为发芽势指
标 。 末次计数为第 14 天(韩建国 , 1997 ; IST A , 19 9 3 ) , 为发芽率指标 。
2. 4 电导率测定
参照国际种子检验协会 “种子活力测定方法手册 ” (Ham Pt on 等 , 19 5 )中电导率测定方法加
以调整 。 取洗净的烧杯 4 个 , 加人 25 0时 重蒸馏水 , 各放人 50 粒饱满的种子 , 用重蒸馏水冲洗
2 一 3 次后 ,在 20 ℃恒温下浸泡 24 小时 , 用 D D S 一 A l 型电导仪测定种子浸出液的电导率 。
2. 5 渗出液葡萄糖含量测定
用标准葡萄糖母液制成 每毫 升含 0 、 20 、 4O 、60 、 80 、 lo ug 葡萄糖 的标 准溶液各 1而 , 加人
5时 葱酮试剂 (0 . 2 9 葱酮溶解于 10 而 76 %稀硫酸 ) , 置于沸水浴 中煮沸 10 分钟 , 冷却后用 7 51
一 GW 分光光度计在 6 20 nl 处测定其吸光度 , 并制成标准 曲线 。 再将 50 粒种子放子洗净 的烧
杯 中 , 加人 10 耐 重蒸馏水 , 在 20 ℃恒温下浸泡 24 小时 , 吸取其中的 l耐 种子渗出液 , 加人 srul
蕙酮试剂 , 于沸水浴中煮沸 10 分钟 , 冷却后在 620 nl 处读取吸光度 , 根据标准曲线查得相应葡
萄糖浓度 。
2
.
6 超氧化物歧化酶(so D )同工酶测定
采用 垂直 板不连 续 聚丙烯酞胺凝胶 电泳法 。 缓 冲系统为 Tri s 一 HCI , 分 离浓度 为 10 %
(pHS
.
9)
, 浓缩胶浓度为 3 . 75 % (pH 6 . 7 ) , 电极缓冲液组成 : Tri s 0 . 6 9 , 甘氨酸 2 . 8 8 9 , 溶于 l侧1〕而
蒸馏水(pH S . 3 )。 40 mA 稳流电泳 (恒流恒压 D F 一 D 型 电泳仪 )
, 点样量为 70 ul , 电泳 6 小时后
染色 。 分三个步骤 :在 NBT 液中黑暗条件下浸泡 20 分钟 , 转人核黄素液中黑暗浸泡 巧 分钟 ,
最后在 E D T A 液中光照 30 分钟 。
2. 7 A TP含量测定
参照徐本美等 (19 84 )提供的方法 。 选择 老化 0 、 48 和 % 小时的三个种子样品 , 测定其在
12
、
24
、
36
、
4 8
、
60
、
7 2 小时的 ATI 】含量 。 取不 同发芽时间的种子 50 粒 , 重复 3 次 , 用丙 酮固定
后 , 加热 5 分钟 以挥发丙酮 , 加人 5以 蒸馏水 , 继续加热 5 分钟 , 吸取 0 . 25 耐 提取液 , 置于 FG -
2加 型发光光度计中 , 注人 1耐 萤光素酶 , 记录其发光强度 。
3 结果与分析
3
.
1 种子发芽率与发芽势的变化
在不同老化时间的高羊茅种子 , 其发芽率的多重 比较结果表 明 (表 1 ) , 在老化初期 (12 和
24 小时 ) , 种子 的发芽率与对照间差异不显著 (P > 0 . 05 )。 老化 36 小时 , 发芽率与对照间差异
显著(P < 0 . 05 )。 老化 36 小时后 , 发芽率与对照间差异极显著 (P < 0 . 01 ) 。 同时种子老化 0 -
48 小时 , 两个相邻处理间的差异均不显著 (P < 0 . 05 )。 而老化 48 小时后 , 任何两个处理间的差
异均达到极显著水平 (P < 0 . 01 )。 结果表明 , 对于高活力的高羊茅种子 , 在老化初期 , 发芽率下
降较缓慢 , 后期则急速下降 。 该结果与 W o d stoc k (197 3) 的研究结果一致 。
虽然老化 0 一 24 小时高羊茅种子的发芽率间差异不显著 。 但以发芽 7 天的发芽数作 为发
芽势的指标表明 , 老化 24 小时 , 发芽势显著低于对照和老化 12 小 时的种子 (P < 0 . 01 )。 老化
24 小时之后 , 各处理之间 , 除个别外 , 均达差异显著 (P < 0 . 05 )或极显著水平 (P < 0 . 0 1 )。
第 3 期 浦心春等 : 加速老化对高羊茅种子生理生化特性的影响
以上结果说明 , 高羊茅种子在老化初期 , 发芽势 (速度 )的下降速度远大于发芽率 。
表 1 高羊茅种子的发芽率
r
fal d e 1 Ce l刀I n at io n ra te of tal l fe sc u e se ed
老化时间(小时 )
A罗 in g tim e (h )
发芽率
吵AanCcdDeEf瑰几7 天 7
Ge n
llin a tio n ra te
14 天 14 d盯s
AaAabBcCdDeEf凡75097518642250790875431620 0124368团7%
* 同列中不 同大写字母间差异极显著(P < 0 . 01 ) , 不同小写字母间差异显著(P < 0 . 05 )
No t e : Th
e d ife re n t C叩ital an d sm 吐1 le te rs ind ie at e th e 5 1即‘ ean t d ife re nc e s ( p < 0 . 05 ) a lld ob vi ou sly si 即 ifi c an t dif-
fe re n e e s( p < 0
.
0 1 ) in the
~
line re
s详 e tiv e ly
3
.
2 种子浸出液电导率和葡萄糖含量的变化
3
.
2
.
1 随着老化时间的延长 , 高羊茅种子浸出液的电导率逐渐增加 (表 2 ) , 经方差分析和多重
比较 , 在 O 一 24 小时老化初期 , 浸 出液的电导率与对照间的差异显著 ( P < 0 . 05 ) , 老化 36 小时
以后 , 与对照间的差异均达到极显著水平 ( P < 0 . 01 ) , 但任何两个相邻处理间的差异均不显著
( P > 0
.
05 )
。
表 2 高羊茅种子浸出液的电导率及葡萄糖含盘
1
,司〕le 2 EleC tri e al e 。们〔l川 ti vi ty a lld gl u e o s e e o n te n t in tal l fe sc u e se e d
老化时间 (小时 ) 电导率 葡萄糖含量
A罗in g t im e El e e tri e al e o nd u e t iv ity Gl u e o se e o n ten t
( h ) (洲e m ) (阿g )
0 2
.
7 5 F g 22
.
9 F f
12 3
.
25 EF fg 27
.
2 E e
24 3
.
63 DEF
e
fg 39
.
9 B b
36 4
.
13 D E d ef 46
.
1 A a
4 8 4
.
25 CDF de 35
.
4 CD e
印 4 . 63 CD e d 32 . 0 D d
7 2 5
.
3 8 BC 比 37 . 7 BC 玩
84 6
.
13 AB ab 47
.
8 A a
96 6
.
8 8 A a 45
.
9 A a
同列中不同大写字母间差异极显著(P < 0 . 01 ) , 不同小写字母间差异显著 (P < 0 . 05 )
N o t e : Th
e d ife re
n t e 叩ital and s llla ll le te o indi e at e the 5 1邵ifi e an t d漩 re nc e s( p < 0 . 05 )an d ob v io u sly 5 1娜fi e ant d诊
fe re 二 e s(P < 0 . 0 1 ) in the sarn
e line re 卿e tiv e ly
3
.
2
.
2 高羊茅种子浸出液的葡 萄糖含量在老化 0 一 36 小时 , 初始时表现为随着时间的增加而
增加 , 之后则呈下降 , 在老化后期 ( 16 一 48 小 时 )又表现为增加 。 方差分析和多重 比较结果表
草 地 学 报 19 8 年
明 , 老化种子浸出液葡萄糖含量极 显著高于对照 (P < 0 . 01 )。 R ao 和 k滋pah a (1994 )的研究 表
明 , 可溶性糖的含量随着老化时间的增加而下降 。 并指出在木豆 (。乒n o c 记UO n) 种子生活力的
丧失过程 中 , 可溶性糖含量并不起重要作用 , 细胞 内葡萄糖的利用率也影响其外渗量 的数量 。
本研究结果表明 , 随着老化时间的增加 , 种子浸出液葡萄糖含量的波动变化 , 可能也是受 细胞
内葡萄糖利用率不同而产生的结果 。
3
.
3 超氧化物歧化酶(SOD )同工酶的变化
超氧化物歧化酶广泛存在于植物细胞 中 , 并与植物的抗逆性有关 , 它能清除细胞内产生的
氧 自由基 , 防止细胞膜的过氧化 , 使膜系统的损伤受到限制 。 由图 1 可知 , 超 氧化物歧化酶同
工酶在老化 12 、 24 和 36 小时的高羊茅种子 中 , 出现 了新的 RF 二 0 . 41 的一条染色较浅 的酶带
在发芽的第 12 小时和第 36 小时的电泳结果表明 , 这三个轻微老化的处理时间出现同样 的情
况 。 随着老化程度的加深 , 在老化 48 小时后的种子中 , 该酶带消失 。 由此可见 , 轻微的老化刺
激了种子生物化学活性 , 使超氧化物歧化酶同工酶出现新的酶带 , 有效地保护了种子的细胞膜
系统 , 从而使种子 的发芽率下降不致过快 。 吕凤金和马缘生 (19 2 )研究黑麦种子人工加速老
化时曾发现 , 在初期过氧化氢和过氧化物酶 的活性 略有上升 , 并指出是由高温高湿激活 的结
果 , 同时也是种子开始衰老的信号 。
酶带颜色 The 。。l o u r o f e n z y o e b a n d . ) 囚 ) 口
图 1 高羊茅种子 S《〕D 同工酶的变化
l 一 9 : 种子老化 0 一 % 小时 , 发芽第 12 小时的 SO D 同工酶
ro 一 18 :种子老化 0 一 96 小时 , 发芽第 36 小时的 SO D 同工酶
Fig
.
1 Th
e e ll a ll罗 of SO D iso e llz yln e in tal l fe se u e se ed
1 一 9 : Se e d s irnb ibe d for 1 2 h
o ur a t o 一 96 h
o u r a( :e e lerat
e d a g仁ing
10 一 18 : Se e ds ix记〕i阮d fo r 36 ho u r at o 一 96 ho ur ac ee le rat ed ag e in g
3. 4 发芽过程中 AT P含量的变化
高羊茅种子发芽过程 中 , ATP 含量在对照与老化 48 、84 和 % 小时的种子间差异显著 (P <
0
.
0 5 )(表 3) 。 对照 AT P含量随着发芽过程 的延续而快速上升 , 在发芽的第 3 6 ~ 48 小时出现滞
缓期 , 第 48 小时 , 胚根开始露 出 , 第 48 一 72 小 时 , 八们平含量 急速上升 。 老化 48 小 时的种子 ,
A
r
FP 含量在发芽初期上升较慢 , 第 60 小时后上升 速度加快 。 老化 84 小 时的种子 , 在发芽 0 -
第 3 期 浦心春等 : 加速老化对高羊茅种子生理生化特性的影响
7 2 小时期 间 AT P含量维持较低的水平 。 老化严重 (% 小时 )的高羊茅种子 , 在发芽开始阶段
AT I〕含量维持较高的水平 , 并显著高于对照及老化 48 和 84 小 时的种子 , 随着发芽的继续有短
期上升(发芽第 24 一 36 小时 ) , 第 36 小时后开始下降 , 第 72 小时达到最低值 。 Chi ng (1%8) 曾
指出 ,发芽过程 中种子的 A TI 〕含量不仅取决于 A T I〕合成 的速度 , 同时取决于被利用 的速度 。
本研究结果表明 , 老化程度高的种子在发芽初期 A TP 含量较高 , 表明其 AT P 的利用受到 了抑
制 。 随着发芽时间的延续 , 老化严重种子合成 A TP 的能力降低 , 出现 A刀平含量在整个发芽过
程中下降的现象 。
表 3 发芽过程中的 AT P含t 《10 一 ’0发光强度 /邹 粒种子 )
T al 〕le 3 A{rl〕co nte nt of tal fe sc
u e se ed duri
n g ge rmi nati on
发芽时间(小时)
晓丽nat ion tim e (hr )
老化时间(小时 )
劫e e lerat e d 卿i飞 time (hr
48 84
20
.
70 士 1 . 6 1
3 1
.
2 3 土 4 . 30
63
.
0’7 士 5 . 7 5
72
.
33 土 2 . 69
13 1
.
40 土 12
.
17
19 1
.
67 土 2
.
89
巧 . 4() 士 0 . 57
19
.
93 士 2
.以
2 2
.
43 士 3
.
70
28
.
47 士 2
.
8 2
49
.
0 3 土 6 . 93
86
. 《l) 士 9 . 88
4
.
9 士 1
.
08
7
.
20 士 1
.
32
5
.
5 7 土 0 . 98
7
.
3 2 土 1 . 48
9
.肠 士 0 . 49
14
.
1 7 士 0 . 29
5 3
.
13 土 8 . 40
卯 . 87 土 5 .肠
10
.
87 土 4 . 26
5 3
.团 士 4 . 59
8 1
.
6 3 士 10 . 5 3
35
.
67 士 3
.
42
124368印72
4 结论
4
.
1 高羊茅种子随着老化时间的增加 , 发芽率和发芽势明显下降 , 发芽势 的下降速度远大于
发芽率 。
4
.
2 老化高羊茅种子浸出液的电导率明显 高于对照 , 并随着 老化时 间的延长 , 浸出液的电导
率逐渐增加 。 老化种子浸出液中葡萄糖含量显著高于对照 。 葡萄糖含量也有随着老化时间的
增加而增加的趋势 。
4
.
3 轻微的老化可刺激高羊茅种子中超氧化物歧化酶同工酶出现新的酶带 , 以防止膜系统受
到破坏 , 从而使种子发芽率的下降不致过快 。
4
.
4 与对照相 比 , 老化种子在发芽过程 中的 ATP 含量均有明显地降低 , 但严重老化的种子 , 因
Al
,
P 的利用受到限制 , 发芽前期的 AT P含量较高 , 但随着发芽的延续 , 其含量与对照的变化相
反 , 表现为明显下降 。
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wi th the in ere as in g of ac e elerat
e d 是lg e in g time i
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,
an d 罗rm in a tio n s p e e d d e e re as e d fas te r
than ge rm i
n at io n
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Ke y w
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