全 文 ：第 4 卷 第 3 期 草 地 学 报
A C T A A G R E S T IA S IN C A
1 9 9 6
V o l
.
4 N o
.
3
年
1 9 9 6
高羊茅种子生活力丧失过程中遗传物质的降解
浦心春 韩建国 王 培 毛培胜
(中国农业大学草地研究所 , 北京 1 00 09 4)
摘要 : 本文以高羊茅 (Cam ari lo 品种)种子为材料 , 采用人工加速老化的方法 , 对其老化过程中
的 R N A 和 Pol y A + R N A 进行研究 。 结果表 明, 随着老化种子发芽率的下降 , 干种子胚中的 R N A 、
Po ly A
十
R N A 含量均随之下降 。 在严重老化的种子 中, 则丧失其在发 芽过程中新 R N A 、 Po ly A 十
R N A 的合成能力。 同时大分子量的 R N A 降解为小分子量的 R N A , 并丧失其完整性 。 研究结果表
明 , 在高羊茅种子人工加速老化的过程中 , Po ly A + R N A 含量比总量 R N A 对老化种子发芽率的下降
起着更多的作用 。
关键词 : 高羊茅种子 ; R N A ; Pol y A + R N A ; 生活力
1 前言
劣变过程是种子活力变动的重要成因和机制 , 特别是关系到活力下降以至丧失活力 的实
质问题 , 是十分重要的种子生理学问题 , 密切关系到种子贮藏与种质资源的保存 , 也是保持种
子活力的理论基础与依据 。 现代生物技术的发展 , 使得人们能够从分子角度对种子老化与劣
变的实质进行研究 。 H ec k er (1 9 7 4) 指出 , 麦仙翁(A g ros te m m a g ith a go )种子老化时 , 虽然 D N A
和蛋 白质合成 能力下 降 , 但 R N A 的合成不受老化的影响 。 但随后的研究 (Br ay 和 c ho w,
一9 7 6 ; B r ay 和 D a s g u p t a , 1 9 7 6 )表明 , 有生活力的豌豆 (几s u m sa t ivu m )干种子在吸胀 i 小时后
便能合成新的 R N A 和蛋白质 , 而无生活力的种子仅合成很少的 R N A , 并且不能合成蛋 白质 。
G ho sh 和 Chau d h ur i(19 8 4) 的研究发现 , 当水稻 (O 犷y z a sa ti 。 )种子发 芽率下降时 , 胚内的
R N A 总量和 Pol y A 十 R N A 的含量均呈下降。 经进一步将 R N A 的分解产物用电泳法提纯 , 结
果发现 , 随着水稻种子发 芽率 的下降或消失 , R N A 逐渐降解 。 在高活力胚中可获得 25 5 及
18 5 两个高峰以及可能是 4 5 与 5 5 的一些小峰 ;在低活力胚中 25 5 及 18 5 R N A 逐渐降解 , 产
生 2 3 5 与 13 5 的峰 , 在 失去发芽率的胚 中 , 18 5 R N A 的降解 比 25 5 R N A 更显 著。 Sm ith 等
(1 9 86) 的研究也发现 , 高活力的小麦(T ri t icu m 此sti vu m )胚 , 其干种子中存在的 Pol y A + R N A
在吸胀初期逐渐下降 , 在吸胀 2 小时 , 即有新的 Po ly A + R N A 合成 , 而低活力的种子胚中 Pof y
A
十
R N A 的含量随着吸胀的过程而逐渐下降 , 并且没有新的 Pol y A + R N A 合成 。 并指 出 , 小麦
种子发芽能力的丧失 , 部分地是 由于在吸胀过程中失去了 Pol y A + R N A 的合成能力 , 因而导
致蛋 白质合成的受阻 。
高羊茅 (Fe st u ca a ru n di n a cea S ch re b . )为禾本科羊茅属多年生草种 , 适于用作长期放牧草
地的优 良牧草 。 经选育后 , 也是一种适应性很广的优良草坪草种 , 是冷季型草坪草中最耐干旱
和践踏的草种之一 。 与豆科牧草相 比 , 禾本科牧草种子更不耐贮藏 , 在温带地 区常温下贮藏 ,
45 年即失去发芽能力 。 本研究以高羊茅种子为材料 , 通过人工加速老化的方法 , 对不同老化
程度的种子进行 R N A 含量及分子量的测定 , 以揭示牧草种子衰老的机制 。
2 材料与方法
第 3 期 浦心春等 :高羊茅种子生活力丧失过程中遗传物质的降解
2
.
1 供试材料 是由美国 Ja ck h n 种子公司提供的 Ca m ar illo 草坪型高羊茅种子 , 于 1 9 9 4 年收
获。 选择其中籽粒饱满大小均匀的种子 , 贮存在 4℃ 的冰箱中 , 尽可能消除因个体差异而引起
的实验误差 。
2
.
2 人工加速老化 经预备实验确定 , 在 45 ℃ 和 10 % R H (相对湿度 )下对高羊茅种子进行
人工加速老化 , 老化时间为 0 、48 和 96 小时 。 以上述不同老化程度 的种子进行以下测定 。
2
.
3 发 芽率浏定 每个测定共 10 粒种子 , 均匀分布在垫两层滤纸的塑料培养皿中 , 放入光
照培养箱 , 重复四次 。 发芽标准参照国际种子检验规程 , 20 一 30 ℃ 变温 , 8 小时光照 , 16 小时黑
暗 , 末次计数时间为 14 天 。
2
.
4 R N A 含量浏定 经人工加速老化 0 、48 和 % 小时后的三份种子 , 分别经 O、 1 、 2 、 4 、 6 、 8 、
12
、
2 4 小时发芽后 、测定 R N A 和 Pol y A + R N A 含量 。 各取不同时间的发芽种子 50 粒 , 切取其
种胚 , 进行 R N A 总量和 Pol y A 十 R N A 的提取 。
2
.
4
.
1 R N A 总量的提取 R N A 总量提取液的组成 : 0 . 0 2M T r is 一H CI(PH 7 . 6 ) + 0 . 0 5M K C I
+ Zm M M g cl : + 0
.
5 % 硫氰酸钠 + 0 . 05 M p一琉基 乙醇 。 样 品加入 o . sm l总量 R N A 提取液在
冰浴中匀浆 , 然后用苯酚 / 氯仿抽提两次 、加入 lm l冷 乙醇沉淀 , 除去上清液 , 用 70 % 、 10 % 乙
醇各洗一次后干燥 。 干燥样品溶于 2 0 0闪 D E PC一H ZO , 加入不含 R N as e 的 D N ase l除法样品中
的 D N A , 然后用乙醇沉淀 , 并用 70 % 、10 0 % 乙醇再各洗一次后干燥 , 干燥后的样品溶于 2 0 0川
DE PC玩O 待测 。 吸取 10 川待测样品在 2 6 0 n m 处测定其吸光度 。 样品 R N A 的含量按下面公
式计算 :
总量 R N A 体g / g ) = OD2 6 o X 4 0拼g / m lX (1 0 0 0 / 1 00 ) X 2 0 0拜l令 1 0 0 0 分 样品重 (g )
2
.
4
.
2 R N A 分子量测定 采用琼脂糖电泳对 R N A 进行分离提纯 , 胶体浓度为 1 % , 80 V 稳
压电泳 1 . 5 小时 , 点样量 20 川, 用 E B( 澳化乙锭 )染色 , 染色后对凝胶进行扫 描 , 比较峰值的大
小。
2
.
4
.
3 Po ly A
+
R N A 的提取 Po ly A 干 R N A 的分离按 照 P ha r m a e ia 公司的 Q u iek P r e p M ie ro
m R N A p u r ifie a t io n K it 的使用说明 , 最后用 5 0 拼1 R N A 提取液洗脱 p o ly A + R N A . 取其 中 10 拼l
在 2 6 0 n m 下测定其吸光度 , 样品中 Pol y A + R N A 的含量按下面公式计算 :
p o ly A
+
R N A伽g / g ) = OD2 6 0 X 4 0拌g / m lX (1 0 0 0 X 5 0 ) 又 5 0 拼l一 1 0 0 0 一样品重 (g )
3 结果与分析
3
.
1 干种子胚中的 R N A 含量
表 1 不同老化时间的高羊茅干种子胚中 R N A 含t (拜g / g 鲜重 )
T a b
.
1 R N A con
te n t in d琢 ta ll fes e u e em br扣5 w ith d iffer en t ae e e ler a ted ag in g tim e T im es in (拜岁9 fr e sh w e ig h t )
老化时间 (小时 )
A g in g
tim e (h
r
)
发芽率
G er lllin a tio n
r a te (% )
R N A
T o ta l
总量
R N A
多聚腺甘 R N A
Po ly A
十
R N A
Po ly A
+
R N A 占 R N A
总量百分比
Po ly A
十
R N A
p e r ee n t ag e in to t a l R N A (% )
97
.
7 5 士 0 . 96
86
.
7 5 士 3 . 7 7
18
,
7 5 士 2 . 7 5
1 3 2 1
.
1 士 2 4 . 4
1 0 87
.
0 士 3 2 . 5
7 10
.
1 士 3 5 . 8
4 5
.
8 7 土 3 . 12
30
.
4 3 士 2 . 0 7
1 4
.
2 0 士 4 . 3 9
3
.
4 7
2
.
80
2
,
00
048%
在高羊茅种子中 , 随着老化程度的加深和发芽率的下降 , 干种子胚中的 R N A 总含量和
草 地 学 报 1 9 9 6 年
Po ly A
十
R N A 的含量均随之逐渐下降 , 而且 Pol y A + R N A 含量占其 R N A 总量的百分比也随
着老化的加深而下降。 未老化种子干胚中的 Pol y A + R N A 含量占其总量 R N A 的 3 . 4 7 % , 而
加速老化 4 8 、 % 小时 , 种 了 干胚 中 Pol y A + R N A 含量分别占. 其 R N A 总量 的 2 . 80 % 和
2
.
0 0 % (表 1 )。
3
.
2 R N A 的 降解
18 5 4 一 5 ,
侧絮哪东已uo叫侧絮彭翻昌OgN侧嗽彭到尸u09闪
合未老化 种子
N o n a g e 一n g
b 老化 4 8 h r 种子
W ith 48坛 a狱le ra t曰 昭 e l昭 , 目 5
c 老化 96 hl 种子
W 趁th 9 6h r act e lera t司 吧e l吧 , 司 s
图 l 高羊茅不同生活力种子 R N A 总t 的凝胶电泳扫描图
Fig
.
1 G e l e le etro Pho r esis R N A o f ta ll fe se u e w it h d iffe r e n t v ia bility
为了解 R N A 在老化种子 中的降解情况 ,
_ _ _ _
R N A 含量 (拼g / g 鲜重 )
j U U U 【 一——一一— .—一 一 . 一
2 5 0 0
2 0 0 0
⋯
[
1 5 0 0 圆
1 0 0 0
50 0
匕
1 2 16 2 4
(hr )
采 用电泳法对不 同老化程度 (加速老化 0 . 48
和 9 6 小时 )干种子胚中的 R N A 进行提纯 。
从图 1a 、 1b 和 1 。 可以 看 出 , 随着老 化程
度的增加和 生活力 的丧失 , R N A 逐渐降
解 , 而在未老化的高活力种子胚 中 , 则获
得 25 5 和 18 5 两个峰值以及可能是 5 5 的
峰 。 随着生活力的丧失 , 25 5 和 18 5 逐渐
降解 , 并形成 23 5 和 13 5 的峰值 。 在加速
老化 4 8 小时的种子胚中 , 1 8 5 R N A 比 2 5 5
R N A 降解得更快 , 因为 18 5 到 1 3 5 吸光度
的下降速度明显快于 25 5 到 23 5 吸光度的
下降 。 而对于老 化 96 小 时的种子 , 其 胚
中 2 5 5 R N A 的降解 比 一8 5 R N A 的降解更
快 , 因为 25 S R N A 几乎全 部降解 , 从 其
电泳谱带的扫描曲线上可以看出 , 老化 %
小时的种胚 中的 R N A 只 出现 了 13 5 和可一一一一Œ 4 8萌发时间 G e rm in a tin g t im e
图 2
F ig
高羊茅不同生活力种子发芽过程中的 R N A 含量变化 能是 5 5 的两 个较 为 明显 的峰值 , 这 和
2 C h a n g e s o f R N A e o n t e n t o f t a ll fe s e u e s e e d w ith
d iffe r e n t v ia b ilit i e s d u r i n g g erm i
n a t io n
G h o s h 和 Ch a u d h u r i ( 19 8 4 ) 的研究结果相
近 。
第 3 期 浦心春等 : 高羊茅种子生活力丧失过程中遗传物质的降解
3
.
3 R N A 总量在发 芽过程 中的变化
不同老化程度干种子胚中的 R N A 总量差异较大 (图 2 ) , 未老化种子胚中的 R N A 含量
显著高于老化 48 和 % 小时的种子 , 老化 48 小时种子胚的 R N A 含量也显著高于 % 小时的
种子 。 随着吸胀时 间的开始 , 三个不同老化程度的高羊茅种子胚 中的 R N A 总量均 出现增
加 , 但未老化种子的增加速度明显高于老化 48 和 % 小时的种子 。 未老化种子胚 中的 R N A
总量在吸胀 2 小时后开始下降 , 4 小时后出现新的增长 , 此后随着发芽过程的继续而缓慢增
长 。 老化 48 和 % 小时的种子 , 其胚中的 R N A 总含量在吸胀的第 4 小时达到高峰 , 此后随
着发芽过程而缓慢下降 , 而没有出现未老化种子后来新的增长 。 在发芽的第 24 小时 , 老化
_ , _
m R N A 含量 (拼g / g 鲜重 )
乙) U 广-一一一一 - ~一 — 一 一一 - - 一 l
一于 。h r 一
- 莽卜 4 8 h r
叫卜 9 6 h r
l
r
.
rLnU只†21
9 6 小时种子 R N A 总含量分别 只有未老化
种子的 3 5 . 1 4 和 2 6 . 50 % 。
3
.
4 Pol y A
+
R N A 在发 芽过程中的变化
Pol y A
十
R N A 在不同老化程度种子发
芽过程中含量 的变化见图 3 。 未老化种子
在发芽过程中 Pd y A + R N A 含量的变化与
R N A 总量的变化相似 , 在吸胀 0 一 2 小时
的种子 , 其含量呈直线上升 , 此后有短暂
的下降 , 并在吸胀 4 小 时出现新 的增长 。
老化 4 8 小时的种子 , 其 Pol y A + R N A 含
量有所增长 , 并在吸胀 4 小时达到峰值 ,
但其上升速度明显低于未老化种子 。 此后
其含量下降缓慢 , 并在吸胀 12 小时后 稳
定在一定的水平。 而老化 % 小时的种子 ,
在吸胀 的 0 一 4 小时 , 其 Pol y A + R N A 含
量有很轻微的增长 , 此后 又稍有下降 , 并
在吸胀 8 小时后稳定在很低 的水平 。 在本
研究测 定 的吸胀 时 间范 围 内 ( 0 一 2 4 小
时 ) , 其含量 只维持很 低的水平 。 在 吸胀
1 0 0
4
萌发时间 Ge rm in a t ing t im e (h r )
图 3 高羊茅不同生活力种子发芽过程中的
Pd y A
十 R N A 含量变化
F 19
.
3 C ha n g e s o f P o ly A
牛 R N A e o n t e n t o f t a ll fe s e u e
s e e d w it h d i ffe r e n t v ia b ilit ie s d u r in g g e rm i
n a t io n
第 2 4 小时老化 4 8 、 % 小时种子的 Pol y A 十 R N A 含量分别只有未老化种子的 2 . 97 % 和 7 .
% %
, 高于 R N A 总量的下降幅度 。
4 讨论与建议
4
.
1 种子老化 与 R N A 含量及其完整性的关系
结果表明 , 高羊茅未老化的高活力种子 , 吸胀开始时贮存的 R N A 活化很快 , 并在吸胀
4 小时开始合成新的 R N A 。 而老化种子不仅干种子胚 中的 R N A 含量少 , R N A 在吸胀时活
化慢 , 而且吸胀后期的合成 也少 , 这是种子老化的原 因之 一 。 而 从 R N A 的完整性分析 ,
R N A 的降解比 R N A 含量的下降对老化种子发芽率 的下降起着更大 的影 响。 因为大分子 的
R N A 裂解成小分子的 R N A 后 , 尽管在某些情况 (如轻微老化的种子 ) 下 R N A 含量不下降
或下降不多 , 但种子仍不能合成其所需的蛋白质种类 , 从而使之不能成功地发芽 。 Sm ith 等
( 1 9 8 6 ) 也指出 , 丧失 R H A 完整性及发生蛋 白质合成系统损害对种子 的发芽能力有很大的
草 地 学 报 1 9 9 6 年
负效应 。
4
.
2 m R N A 与种子老化的关系
植物种子中的 m R N A 多含有多聚腺昔 (Pol y A 十 ) 的一端 , 因此 Po ly A + R N A 就近似的
反映了种子的 m R N A 水平 。 D u re (1 9 7 9) 提出棉花 (Go ssy Piu m sp . ) 种子发芽期间有关
子叶中蛋 白质合成的几种 m R N A 是 : (1) 残存的 m R N A , 是在种子形成期编码有关蛋 白质
的 m R N A , 是在成熟期受到破坏而残存下来的部分 ; (2) 贮存的 m R N A , 也是在种子形成
期产生 , 并能保存下来 , 而且在发芽时能恢复模板活性作用 , 亦称之为预存或长寿的 m R -
N 八 (3 ) 新 合成的 m R N A 。 D else n y 等 似9 7 7 ) 的研究则发现 , 在萝 卜 (尺a Ph a n u s
sa ti vu
: ) 种子发芽初始的几小时 内 , 贮存 m R N A 将出现损耗过程 , 而蛋白质的合成则逐渐
依赖于新合成的 m R N A 。 本研究也发现 , 高羊茅未老化的高活力种子 , 在吸收胀 2 小时后
m R N A 含量有一个短暂的下降期 , 在吸胀 4 小时的 m R N A 含量又出现新的上升 , 由此说明 ,
高羊茅高活力的种子 , 在吸胀 4 小时即合成新的 m R N A ; 而高羊茅中等程度老化 48 小时的
种子 , 其贮存 m R N A 的活化慢 ; 在吸胀 4 小时达到峰值 , 12 小时后才有缓慢的新 m R N A 合
成 ; 老化 % 小时种子 , 不仅干种子中贮存的 m R N A 含量显著减少 , 而且也很少有新合成的
m R N A
。
C u m in g 和 Lan e (19 7 9) 发现 , 在大多数情况下 , 种子开始 吸胀时即有蛋 白质的合
成 。 由此推测 , 贮存 的 m R N A 至少部分地与发 芽早期的蛋 白质合成有关 。 Br ay 才 Sm ith
(19 85 ) 也指出 , 小麦胚的发芽依赖 (至少是部分地) 于 Po ly A + R N A 种类 的完整性 , 因为
它是胚在发芽初始阶段启动蛋白质合成的关键 。 S m it h 等 (19 8 6) 强调指出 , 发芽的完成需
要新的 Pol y A + R N A 转录的合成 , 以支持发芽后期的蛋白质合成 。 因此 , 在人工加速老化
高羊茅种子时 , 老化种子发芽率下降的原 因之一是由于干种子胚 中 m R N A 含量的下降以及
丧失了合成新 m R N A 的能力 。
本研究结果还表明 , 在老化的高羊茅种子中 , 不仅 m R N A 的含量减少 , 而且 m R N A 占
R N A 总量的比例也减少 , 即老化种子中 m R N A 的下降幅度高于 R N A 总量 的下降 , 由此说
明 , 高羊茅种子在人工加速老化过程中 , m R N A 比 R N A 总量对老化种子发芽率的下降起更
多的作用 。
参 考 文 献
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,
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.
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Phyt oc h
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Ph ysio l
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Pla n t
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B r e a k d o w n o f R ib o n u c le ie A c id w ith th e L o s s o f V ia b ility o f
T a ll Fes c u e (万飞stu c a a r u n d in a eea ) S e e d
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a n g Pe i M ao P e ish e n g
(In s tit u te o f G r as la n d Sc i
e n e e A g r ie u ltu ra l U n iv e r s ity
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B e ijin g 1 0 0 0 9 4 )
A b st r a e t :
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n a t io n le v el a n d th e p hys io fo g ie al q u a lity
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se e d 即p u la t io n , o r s e e d lo t . T he g erm in a tio n le v el o f a lo t a n d th e v ig o r o f t he g e rm in a b le s e e d s
in te ra e t w ith 50 11 co n d it io n s e v e n tu a lly to d e term i
n e w he the r o r n o t a e ro P w ill b e e s t ab lishe d s u e
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n a t io n in a g in g s e e d s tha n n o n
一 a g in g se e d s 二 G e l ele e tro p h o r e s is o f R N A
sh o w e d t ha t e n ha n e e d b r e akd o w n o f bo th 2 5
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n a t io n r a t e o f t all fe s e u e a g in g se e d w a s m o r e d u e t o th e le v el o f Po ly
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+ R N A t ha n t he le v e l o f t o ta l R N A
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K e y w o r d s
: 于b zu c a a r u n d in a eea ; R N A ; Po ly A 十 R N A ; V iab ility