全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：565～568
Journa／of Wuhan Botanical Research
邓氏马先蒿遗传多样性的 ISSR分析
夏婧，郭友好
(武汉大学生命科学学院植物系统与进化生物学研究室，武汉 430072)
摘 要：运用 ISSR．PCR分子标记技术对邓氏马先蒿(Pedicularis dunniana)云南中旬以及四川木格措两个 自然居群
的遗传分化以及遗传多样性进行研究。结果表明：物种水平上邓氏马先蒿遗传多样性水平较高 (PP8=62％)，但
居群平均水平很低，云南中旬居群多态性位点百分率只有 23％。四川居群也仅仅是 27％，AMOVA分析结果表明，
居群间基因分化系数 t=0．7462，即遗传变异绝大部分来源于两居群间，居群间表现出强烈的遗传分化。自交的
交配方式以及小居群产生的遗传漂变效可能是造成邓氏马先蒿 目前遗传结构的主要原因。
关键词：邓氏马先蒿(Pedicularis dunniana)；遗传分化；遗传多样性；ISSR
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000-470X(2006)06-0565-04
ISSR Analysis for Genetic Diversity Pedicularis dunniana
XIA Jing，GUO You-Hao’
(Laboratory ofPlant跏tematics andEvolutionaryBiology，Colege ofti／e Sciences，Wuhan 矗 ，Wuhan 430072，China)
Abstract：ISSR markers was used to measure genetic diversity and genetic structure of tle 40 individuals
from two natural populations of Pedicularis dunniana，one autogamous perennial herb．A total of 100 DNA
fragments were scored from 8 ISSR primers，of which 62％ were po lymorphic． A low level of genetic
diversity within populations was detected(PPB=27％，23％，respectively)．An analysis of Molecular
Variance(AMOVA)was used to apportion the variation within and among populations．Results indicated
that most of the variation(74．62％)resided among the populations，while only a small amount of vaxia-
tion(25．38％)within the populations．Selfing is likely the factor resulting in the low level of genetic
diversity wi thin the po pulations．Genetic drift in small po pulations an d probably founder efects might also
be the most important reasons that may explain the current genetic structure of P．dunniana．
Key words：Pedicularis dunniana；Ge netic diferentiation；Ge netic diversity；ISSR
邓氏马先蒿 (Pedicularis dunniana Bonati)为多
年生高大草本，高可达 2 m，是我国特有种，分布于
云南西北部和四川西部海拔 3400～3700 m的草坡
与树林中。具 2O～30 cm长的穗状无限花序，黄色
的小花分泌少量的花蜜。花冠萎蔫之后并不马上脱
落，仍然附着在植株上，此后盔部连同盔部内包裹的
花药以及散落到盔内壁的花粉因花冠萎蔫的作用而
开始慢慢下垂，最终使柱头“回缩”到盔部小室。在
这个过程中，仍具可授性的柱头便与小室内散落的
大量花粉接触完成滞后 自交 ’引。这为邓氏马先蒿
在传粉者缺乏的生存环境下提供了有利的生殖保障
作用。
进化的基本单位不是个体而是居群，一个物种
或居群的进化潜力在很大程度上取决于其遗传变异
水平的高低以及遗传变异的分布格局，即居群的遗
传结构。居群的遗传结构反映了居群进化过程并将
决定未来的发展，它受突变、迁移、选择和遗传漂变
的共同作用，同时还和物种的进化历史和生物学特
性有关 J。交配系统就是影响植物居群遗传结构
的一个重要因素，因为它控制着基因由配子体在两
个时代间的传递和延续。遗传变异的分布模式在 自
交和异交植物中存在很大差异，近交特别是 自交促
进居群间 的分化，异交则趋 于消除居群 间 的分
化 一引。
马先蒿属植物在一狭窄的遗传基础上表现出巨
大的形态多样性，是研究 自然界中植物传播和物种
形成的一个模式种属 J。然而到 目前为之，对马先
蒿居群遗传学的研究并不多。并且研究的物种均来
自近北极地区 。’ J，生境中潜在的传粉者较少，在
地址历史上又曾遭受第四纪冰川的强烈影响，因此
收稿日期：20064)4-03，修回日期：2006-09-21。
基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)资助项 目(G2000046804)。
作者简介：夏婧(1980一)，女，博士研究生，从事植物系统与进化生物学研究。
· 通讯作者(E—mail：yhguo@whu．edu．cn)。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
该分布区马先蒿属植物遗传变异分布格局应不同于
我国横断山区——马先蒿属分布演化中心。除李文
丽研究了云南大王马先蒿的居群遗传结构 外，我
国尚未有其他有关该属植物居群遗传多样性的研究
报道，要弄清楚我国西南横断山区马先蒿属植物的
分化机制，我们还需要对涵盖不同生活史类型、不同
分布范围以及不同繁育系统的该属植物进行详细的
居群生物学研究。本文作为其中的一小部分，选择
ISSR标记对邓氏马先蒿云南和四川两个居群进行
遗传多样性分析，以期揭示该自交种的遗传分化程
度，并对邓氏马先蒿繁育系统和分布模式对其居群
遗传变异分化的关系有更全面的理解。
1 材料与方法
1．1 植物材料
实验材料采集于20o2年7月，选取邓氏马先蒿
(Pedicularis dunniana)云南中甸及四川木格措两个
居群作为研究对象。中甸居群仅含有25株开花植
株，全部作为取材对象；四川居群大约 5O株开花个
体，随机选取其中15株采样。取材方法是每株采集
适量新鲜无虫蛀叶片材料迅速放入封口袋中硅胶干
燥保存。
1．2 DNA提取
叶片材料 的总 DNA提取采用改 良的 CTAB
法 引。
1．3 引物和 PCR扩增
用加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列，赛
百胜公司合成的 ISSR引物，2个居群中各选 2个模
板，在25 反应体系中进行扩增筛选。从 65个引
物(UBC801～UBC865)中选出8个扩增条带较多、
信号强、背景清晰的引物用于全部 2个居群 DNA样
品的扩增(表 1)。
ISSR扩增反应体系经选择和优化确定为25
PCR 反 应 液，内 含：17．5}xL双 蒸 水，2．0 IxL
(2．5 mmol／L)dNTPs，2．0 IxL 10×PCR bufer(含
10 mmol／L Tris—HC1，1．5 mmol／L MgCl2，50 mmol／L
KC1)，0．5 (2 U／ )Taq酶，1 引物(25 pmo1)，
2}xL DNA模板(约 60 ng)。PCR反应在 PTC一100TM
扩增仪上进行，经优化后确定其扩增条件为：94℃
预变性 5 min，然后进行 35个循环：94℃变性 30 8，
5O℃复性 1 min，72oC延 伸 1．5 min，循环结束后
72℃ 7 min，最后在 4℃保存。PCR产物在含有 EB
的1．5％琼脂糖凝胶中电泳，以200 bp DNA ladder(武
汉天源生物公司)作为标准分子量对照，8O V稳压
电泳后凝胶成像系统照相，然后将图像存人计算机
待分析。
表 1 邓氏马先蒿2个居群4o个个体进行扩增的
ISSR引物特点
Table 1 Atributes of ISSR primers used for generating
ISSR markers from 40 individuals ofPedicularis
dunniana sampled from two populations
1．4 统计分析
电泳图谱中的每一条带均视为一个分子标记
(marker)，并代表一个引物的结合位点。按凝胶同
一 位置上 DNA带的有无进行统计，有带(包括弱
带)记为 “1”，无带 的记为 “0”。采用 POPGENE
1．31版软件 对全部居群和各单个居群分别计算
了多态位点百分率(尸P 、Nei’8基因多样性( )、
Shannon’8信息指数(Jr)。本研究利用 WINAMOVA
1．55软件 对邓氏马先蒿居群内和居群间的分子
变异进行了分析，计算出居群间基因分化系数F耵以
及居群每代迁移数 Ⅳ (estimation of gene flow from
t，Ⅳ =0．5(1一 t)／F,t)。
2 实验结果
2．1 居群和物种水平的遗传多样性水平
从65个引物中筛选 出的 8个 ISSR引物(表
1)，对 2个居群的4O个 DNA样品进行 PCR扩增共
产生了100个可统计的条带，其中具多态性的条带
62个 ，占62％。云南中甸、四川木格措 2个居群的
多态性位点百分率分别为27．0o％、23．0o％，居群
平均水平为25％(表 2)。两个居群的 Nei’8基因多
样性 ( )分别为 0．0564与 0．0683，平均值为
0．0628；Shannon’8信息指数(，)分别为0．0937与
0．1059，平均值为 0．0998。在物种水平上 Nei’S基
因多样性(日 )为 0．2156，Shannon’8信息指数(，)
为0．3173。
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第6期 夏 婧等：邓氏马先蒿遗传多样性的ISSR分析 567
表 2 邓氏马先蒿自然居群遗传多样性分析
Table 2 Statistical analysis ofgenetic variation
inthe two populations of P．dunniana
摇 警 窍
Notes：PPB- Percentage ofpolymorphie bands； 一 Nei’8 gene
diversity；／- Shannon’8 information inde~
2．2 居群间遗传分化程度
对邓氏马先蒿两个 自然居群进行 AMOVA分
析，结果表明居群问基因分化系数 Fn=0．7462，即
在总的遗传变异中有 74．62％的变异发生在居群
问，居群内遗传变异占总遗传变异的25．38％，居群
问和居群内变异均极显著(p<0．001)(表3)。根据
计算出居群每代迁移数 ^为0．1701。
表 3 居群间和居群内分子变异的 AMOVA分析结果
Table 3 Analysis of molecular variable(AMOVA)
within／among populations
变
So urce of
一
Varianc
量
e p
SSD Vari8 。 component 篙
3 分析与讨论
本研究从居群遗传学角度，对中国特有种邓氏
马先蒿 自然居群——云南中甸与四川木格措两个居
群的遗传变异进行了 ISSR—PCR分析，结果表明邓
氏马先蒿在物种水平的 PPB为 62．oo％，Nei’S基
因多样性 ( )为 0．2275，Shannon’S信息指数(，)
为0．3173。与类似生活型、分布范围以及繁育系统
的平均水平相比，邓氏马先蒿在物种水平上的遗传
多样性较高【3 J，这说明它能适应当前的环境。然而
就单个特定居群而言，邓氏马先蒿的多态位点百分
率很低，两个居群分别为27．0o％(云南)与23．0o％
(四川)，遗传多样性则处于较低的水平。ISSR结果
还表明邓氏马先蒿居群问已产生了强烈的分化，其
居群间的遗传变异高达74．62％，居群间基本上没
有基因流存在(Ⅳm=0．1701)。邓氏马先蒿的这种
遗传变异分布模式与其地理隔离可能有关，同时更
与其 自交的繁育系统以及零星小居群分布的习性相
一 致。
被子植物多样化的演化过程中不停地重复着从
异交到 自交的转变，这个转变通常有两个前提条件：
第一，自交与异交相比具有 自动选择优势(3：2)，但
是近交衰退(inbreeding depression)和花粉折损(10ol—
len discounting)作用往往抵消了自交基因的这种传
递优势；第二，自交的另一个优势在于其在传粉者缺
乏或异交花粉不可得的情况下可以提供生殖保障，
理论模型研究表明在该种情况下自交的生殖保障作
用就可以抵过并补偿近交衰退 的不利之处Ⅲ 。
由于人为活动和干扰以及 自然灾害的影响，邓氏马
先蒿的生境非常脆弱，很多居群甚至可能是临时的、
不稳定的。这种生境的可变性和不可预知性使得邓
氏马先蒿自然居群缺少传粉者访问，滞后自交就被
自然选择作用保留下来成为生殖成功以及拓殖新生
境的重要保障⋯。然而 自交种与异交种相比能减
少种群内遗传变异、增加种群问遗传分化。本研究
表明74．62％的遗传变异存在于邓氏马先蒿居群
间，而同在滇西北分布以异交为主的管花马先蒿
(P．siphonatha)以及蒙氏马先蒿 (P．monbeigiana)，
仅有12．96％和21．66％的遗传变异分布于居群间
(未发表数据)。由此看来，邓氏马先蒿目前的遗传
变异分布模式可能是其自交繁殖的遗传后果。交配
系统对居群的遗传结构有如此巨大的作用，自交率
的差异就可能很大程度地影响马先蒿属植物相互之
问趋异分化的方式 ¨ 。自交者因为突变积累而灭
绝概率加大，其降低了遗传变异使得对自然选择反
应能力下降。然而通过长期的演化过程，有害突变
也有可能已经被自然选择所清除，相反有利的或中
性基因的固定则可以引起同一物种对不同环境的适
应，再通过拓殖新生境而形成物种的微进化，进一步
增大居群问的异质性，成为新物种形成的基础。
如果说交配系统是影响居群遗传结构的重要内
因的话，那么居群生态特征(如居群大小)则是影响
居群遗传结构的重要外因之一。邓氏马先蒿多以小
居群的形式存在于自然界中，该种呈岛屿状的小居
群散布于非常狭窄的区域，小居群间的空间隔离很
可能限制了居群问个体的相互基因交流。在漫长的
进化过程中适应新的微生境的遗传变异体得以保存
下来，致使小居群问在遗传多样性上愈来愈呈现出
明显的趋异性，或许这就从一方面解释了邓氏马先
蒿居群间多态位点百分率高达 62．0o％的原因。然
而小居群增强了遗传漂变的作用而造成一些等位基
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
因的丢失和另一些等位基因的固定并最终导致两个
遗传结果——居群内遗传多样性的降低以及居群问
分化的增加。居群内纯合度升高使得有害基因在小
的居群内更趋向于固定而不是因遗传漂变而丢失，
这就更加增加了居群的脆弱性。对于邓氏马先蒿而
言，其 自交的习性同小居群的分布模式相结合，有害
等位基因通过纯合而表达的可能性就更大，最终发
生“灾难性突变(mutation meltdown)”而导致居群灭
绝 ¨ 。与此同时，对邓氏马先蒿的小居群的分布模
式以及居群内低的遗传多样性水平还存在另一种可
能的解释一 “建立者效应”，即这种小居群是由单
一 的或少数几个亲本繁殖而来，因为建立者事件直
接决定着新建立居群的遗传变异水平。
在欧美地区生境片断化等诸多因素导致部分马
先蒿物种处于濒危，但中国分布的马先蒿属植物并
没有被列入濒危植物。尽管如此，随着旅游开发和
生态破坏的13益加剧以及农耕放牧的干扰，经过多
年的野外调查我们发现部分马先蒿属植物(例如管
花马先蒿、邓氏马先蒿)的居群遭到严重破坏甚至
消失。而邓氏马先蒿在自然界更是以零落的小居群
形态分布，并且其居群内遗传多样性程度很低但物
种水平上遗传多样性水平较高。基于此，我们认为
邓氏马先蒿的保护策略应以居群为单位进行原地保
护，如有可能可以进行居群间混合繁殖 J。
致谢 ：孙土国博士、杨春峰博士在野外工作中给予了无
私帮助，陈进明博士对文章初稿提出了宝贵意见，本科生李
静、陈容在实验过程中给予了帮助，特此谢忱。
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