全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 5) : 406～410
Journal of Wuhan Botanical Research
转基因鱼腥藻 7120适宜生长条件的初步研究
欧阳叶新1, 2, 3 , 施定基3, 梁承邺2 , 胡鸿钧1
( 1.中国科学院武汉植物研究所/武汉植物园, 武汉 430074; 2.中国科学院华南植物研究所, 广州 510650;
3.中国科学院植物研究所, 北京 100093)
摘 要: 以前的研究报导了将人肿瘤坏死因子基因( T NF-)成功转入鱼腥藻 7120 中,这项研究在实验室小规模范
围内探讨了其转 TNF-基因鱼腥藻 7120 的适宜生长条件。结果表明,转基因鱼腥藻 7120 最适生长温度在 25～
30℃, 最适pH 7. 0～7. 5。不同光照强度下的净光合放氧速率测定结果表明, 转基因鱼腥藻 7120 与野生型具有一致
的光饱和点和光补偿点, 且适合在 10～700 Em- 2s- 1下生长。外加有机碳源( 4 g / L 葡萄糖)一定程度上可以增
加转基因鱼腥藻 7120 生长速度。对不同藻龄转基因鱼腥藻 7120 中 T NF-的累积量的检测发现: 生长 8 d 左右时
转基因鱼腥藻 7120 中T NF-累积量达到最大值。这将为产业化生产、适时收获转基因蓝藻提供理论指导,同时讨
论了葡萄糖对转基因鱼腥藻 7120 代谢的调节。
关键词: 转 TNF-基因鱼腥藻 7120; 光强; 温度; pH; 藻龄; 葡萄糖
中图分类号: Q945. 3 文献标识码: A 文章编号: 1000-470X ( 2003) 05-0406-05
Preliminary Studies on Optimal Growth Conditions for
Transgenic Microalgae Anabaena sp. PCC7120
OUYANG Ye-Xin
1, 2, 3
, SHI Ding-Ji
1
, LIANG Cheng-Ye
2
, HU Hong-Jun
3
( 1. Wuhan B otanical Gar den / Wuhan I nst itut e of Botany , T he Chinese A cademy of Sci ences, Wuhan 430074, China;
2. S outh Ch ina I nstitute of B otany, T he Chinese A cad emy of S cience s, Guan gzhou 510650, China;
3. I nst itu te of Botany , T he Chinese A cademy of Sc iences, Beijing 100093, China)
Abstract: Our prev ious w ork pr esented the const ruct ion of transgenic micro algae Anabaena sp.
PCC7120 ( A . 7120) w ith human tumor necrosis factor-( hTNF-) gene. We cur rent ly described
the prelim inary studies on opt imal g row th condit ions for t ransgenic A . 7120 in the labor ato ry-
scale. T he data w e pr ovided here show ed that the optimal grow th temperature and pH are at 25
30℃, and pH 7. 0 7. 5, respect iv ely ; the net photosynthet ic oxygen elution rates of the t rans-
genic A . 7120 under different photon f lux densit ies measured her e suggested that both the satu-
rated and compensated light densit ies of the t ransgenic A . 7120 are similar to those of the w ild
type of A . 7120, and the t ransgenic and w ild type A . 7120 are able to grow normally under 10
700 Em - 2s- 1 with a r ange of dif ferent cell densit ies. But addit ion of glucose ( 4 g / L ) into
BG11 culture medium increases the grow th rates of the t ransgenic A . 7120 in contrast to the w ild
type. T he contents of T NF-in the dif ferent culture ages of the t ransgenic A . 7120 determined in
this invest igat ion suggested that the accumulat ions o f T NF- in the t ransgenic A . 7120 cultures
reached the max ima at about the eighth day. T his pro vides a helpful message for product ion of
TNF-. We proposed here that gluco se might play a possible role in controlling the metabo lism of
收稿日期: 2003-02-27,修回日期: 2003-05-12。基金项目: 得到国家海洋 863项目资助( 819-04-11) ;中国科学院武汉植物研究所所长基金支持。本工作主要在中国科学院植物研究
所光合作用中心完成。
作者简介: 欧阳叶新( 1965- ) ,男,博士,主要从事遗传学和藻类分子生物学研究。现通讯地址: Dept . of Biology & M icrobiolog y,
University of W iscons in, Oshkosh 54901 USA.
t ransgenic A . 7120.
Key words : T ransgenic A nabaena sp. PCC7120; L ight density ; T emperatur e; pH; Cultur e age;
Glucose
目前已有多种生产重组蛋白的异源表达系统,
这些系统在重组蛋白质产量、操作的简便性以及生
产成本等方面各具优势 [ 1 3]。具有光合放氧活性的
微藻能利用水和二氧化碳生产制造有机物质,同时
还具有一些对人类和动物有益的营养成分 [ 4]。转基
因微藻作为一种生物反应器表达外源蛋白, 具有生
物量大、生长迅速、成本低廉、下游工程简单等独特
优势 [ 4, 5]。以前我们曾报道了转人肿瘤坏死因子
( TNF-)基因鱼腥藻 7120 的构建[ 5, 6] ,为生产口服
重组蛋白药物带来了可能性。光照、温度、pH 和营
养条件是影响微藻生长的重要因素,为了给产业化
生产奠定理论基础, 我们在实验室小规模范围内研
究了转基因微藻的适宜生长条件, 同时还检测了不
同藻龄的转 T NF-基因鱼腥藻 7120中重组蛋白
( T NF-)的累积量, 希望为产业化生产、适时收获转
基因蓝藻提供有用的信息。通过有机碳源葡萄糖
( 4 g / L)对转 TNF-基因鱼腥藻 7120生长的影响
研究, 我们提出葡萄糖可能参与了转基因微藻代谢
调控。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 蓝藻品系 丝状蓝藻鱼腥藻 7120野生型
( A nabaena sp. PCC 7120)来自法国巴斯德研究所;
构建的转基因鱼腥藻 7120来自于中国科学院植物
研究所光合作用中心[ 5, 6]。
1. 1. 2 培养基和培养条件 丝状蓝藻鱼腥藻 7120
[野生型( WT )和转基因型 ( T T ) ]采用 BG-11(无
氮)培养基 [ 7] , 置于 Gallekampe 光照控温旋转培养
箱中培养, 转速为 120 r/ m in, 培养温度 20～45℃,
光照强度约为10～700 Em- 2s- 1。转基因型中加
入链霉素( Sm)浓度为 5～50 g/ mL。
1. 2 方法
1. 2. 1 不同生长因子对转基因鱼腥藻 7120生长的
影响 选取对数生长期的细胞培养物,接种于新鲜
BG-11(无氮)培养基中,起始 OD750达 0. 1左右。分
别检测不同浓度的链霉素( Sm , 5～50 g/ mL ) 、不
同温度范围( 20～45℃) 、不同 pH ( 6. 5～9. 0)下的
生长速率,并绘制生长曲线 [ 8 10]。
1. 2. 2 转基因鱼腥藻 7120的光合速率测定 参照
文献[ 8 10] 。在光照强度为10～1 400 Em - 2s- 1
范围内测定,用英国产 HansT ech DW / 1型氧电极测
定,温度 25℃, pH7. 5。
1. 2. 3 葡萄糖对转基因鱼腥藻 7120生长的影响
取对数生长期的细胞培养物进行光合作用放氧活性
测定,初步确定合适浓度的葡萄糖( 4 g/ L )葡萄糖,
据此浓度培养转基因鱼腥藻 7120 后绘制生长曲
线[ 8 10]。
1. 2. 4 藻龄与转基因鱼腥藻 7120中 TNF-累积
的关系 选取不同藻龄的转基因鱼腥藻 7120细胞
培养物,分别检测细胞中 T NF-的累积量。利用放
射性免疫分析( RIA ) 检测 TNF-含量, 参照文献
[ 5]。离心收集细胞培养物,冰水浴中超声波破碎细
胞(光学显微镜下镜检细胞破碎程度) , 4℃离心取
上清。测试时做不同浓度梯度稀释。采用中国人民
解放军总医院生产的 TNF-作为标准 TN F 用于
RIA kit 检测。标准 TNF 用125I 标定,测定的有关参
数包括样品浓度及标准曲线绘制方法均预先编制程
序(详细操作见试剂盒说明)。通过液相竞争法,在自
动 计数器上测定放射活性, 可溶性蛋白质含量测
定参照文献[ 11]。
2 结果和分析
2. 1 链霉素( Sm)浓度对转基因鱼腥藻 7120 生长
的影响
为了了解外加的抗生素是否影响转基因鱼腥藻
7120 生长状况, 我们研究了不同浓度的链霉素
( Sm , 5～50 g / mL) 下的生长速率(图 1)。结果表
明: 野生型鱼腥藻 7120( WT )中加入 5 g / mL 的
Sm 后, 细胞会逐渐死亡; 在转基因鱼腥藻 7120
(T T )中, 与不加链霉素 (对照)相比, 以 5 g / mL
Sm 作为筛选压,对转基因鱼腥藻 7120 生长几乎没
有影响,同时又具有筛选作用。而当增加 Sm 浓度
时, 对转基因鱼腥藻 7120 生长有一定的抑制作用,
且随着浓度增加,抑制作用增强。不同方法得到的转
基因鱼腥藻表现出同样的规律(数据未显示)。另外,
由于 Sm 长期置于液体 BG-11(无氮)培养基中光照
培养时可能会失效。据此, 我们使加入的 Sm 最终浓
度为 5 g / mL, 同时定期补加相同浓度的 Sm 作为
持续筛选压,较好的解决了Sm 失效问题。以下检测
407 第 5 期 欧阳叶新等: 转基因鱼腥藻 7120适宜生长条件的初步研究
显示了在这一浓度下测定的生长状况。
图 1 链霉素( Sm)浓度对转基因鱼腥藻 7120 生长的影响
Fig. 1 T he effect o f str eptomycin concentr ations on
g rowt h r ates o f transgenic A . 7120
2. 2 温度对转基因鱼腥藻 7120生长的影响
图 2 显示了不同温度下转基因鱼腥藻 7120的
生长曲线,结果表明,转 T NF-基因鱼腥藻 7120在
25～30℃下生长最快, 而 20℃ 和 35℃细胞生长明
显变慢,长时间置于 45℃下, 细胞最终会发黄至死。
这与我们以前报道 45℃短期诱导可引起鱼腥藻
7120形成短藻丝体时观察到的现象一致 [ 9]。由此说
明转 T NF-基因鱼腥藻 7120, 其最佳生长温度范
围为 25～30℃。这与野生型鱼腥藻 7120表现出同
样的规律[ 10]。
图 2 温度对转基因鱼腥藻 7120生长的影响
Fig . 2 T he eff ect o f tempera tur es on the g rowt h
r ates of t ransgenic A . 7120
2. 3 pH对转基因鱼腥藻 7120生长的影响
图 3显示了不同 pH 下转基因鱼腥藻 7120的
生长曲线,结果表明,转 TNF-基因鱼腥藻 7120在
pH 7. 0～7. 5下生长最快,而低于 pH 7. 0以下和高
于 pH 7. 5细胞生长明显变慢。由此说明转 T NF-
基因鱼腥藻 7120同野生型一样,其最佳生长 pH 应
为 7. 0～7. 5。这与野生型鱼腥藻 7120表现出同样
的规律[ 10]。
图 3 pH对转基因鱼腥藻 7120 生长的影响
Fig . 3 The effect o f pH on the g row th rat es o f
tr ansgenic A . 7120
2. 4 转基因鱼腥藻 7120在不同光照强度下的光合
速率
图 4 显示了不同光照强度下转基因鱼腥藻
7120的净光合作用放氧速率,即转T NF-基因鱼腥
图 4 转基因鱼腥藻 7120 对光照强度的响应曲线
( WT : 野生型鱼腥藻 7120; TT -R 和 TT -H: 2种不同方法获得的转基因鱼腥藻 7120[ 5] )
Fig . 4 T he net phot osynthetic rates o f transgenic
A . 7120 responsible to differ ent pho ton flux density
( PFD , Em- 2s- 1) at pH 7. 5 and 25 ℃
( WT : w ild type A . 7120; T T-R and T T-H:
tw o t ransgenic A . 7120 by t he differ ent methods [5] )
408 武 汉 植 物 学 研 究 第 21 卷
藻 7120在最佳 pH 7. 5、最佳温度( 28 ± 2)℃下的
光合作用响应曲线,结果表明,转基因鱼腥藻 7120
与野 生型具有 大致相 同的 光饱和 点 ( 约为
700 Em- 2s- 1 ) 和光补偿点,光合放氧速率也基
本一致。由此看来,在随细胞密度逐渐增加时, 光照
强度约在 10～700 Em- 2s- 1下较为适宜于转基
因鱼腥藻 7120的生长。这些生长条件与野生型鱼腥
藻 7120相比变化不大。
2. 5 葡萄糖对转基因鱼腥藻 7120生长的影响
通过光合作用放氧活性测定过程中加入不同浓
度的葡萄糖, 确定合适的外加葡萄糖浓度。图 5显示
的是外加有机碳源( 4 g / L 葡萄糖)后的生长曲线。
结果表明, 与未加入葡萄糖相比较, 4 g/ L 葡萄糖一
定程度上加快了转基因鱼腥藻 7120生长速度, 而野
生型则没有表现出这种现象(数据未显示)。
图 5 葡萄糖对转基因鱼腥藻 7120 光合活性的影响
F ig . 5 T he effect of g lucose concentrat ions on the
phot osynthetic activities of tr ansgenic A . 7120
2. 6 藻龄对转基因鱼腥藻 7120 中 TNF-累积的
影响
为了研究转基因鱼腥藻的生长状况是否影响
TN F-基因的表达, 以及了解收获转基因鱼腥藻
7120的最佳时机,需要明确外源基因表达与藻龄之
间的关系。我们测定了不同藻龄的转基因鱼腥藻
TN F-基因表达量。鱼腥藻7120在OD 750= 0. 7时,
检测发现其代时约为 1. 5 d ( 36 h) (结果未显示) ,
选取在这一时间段前后 4 d 左右的转基因鱼腥藻
7120培养物,检测 T NF-的累积量。结果表明,约
在第 8 d 时, 其 T NF-的累积量便达到了最大值
(图 6)。
图 6 藻龄对转基因鱼腥藻 7120(TT-R)中 TNF-
累积的影响( A : 生长曲线 B: TNF-累积量)
Fig. 6 The effect o f culture a ges on the accumulations
o f hTNF-in tr ansgenic A . 7120 ( T T-R )
( A . G rowt h curve; B. T he contents of
hTNF-accumulated)
3 讨论
藻类是一类能进行光合自养的初级生产者, 在
有光的条件下, 仅利用廉价的无机物便可以生长制
造有机物。为了获得较高产量的重组蛋白,寻找转基
因微藻的适宜生长条件是一项有意义的工作。我们
在实验室小规模的培养中研究了转基因微藻的生长
条件,可以看出: 转基因鱼腥藻 7120与野生型生长
条件类似,说明外源重组蛋白的表达,没有从根本上
改变鱼腥藻 7120的生长和生理状况。
有趣的是可以作为有机碳源的葡萄糖的加入,
一定程度上加快了转基因鱼腥藻 7120 的生长,而野
生型则没有表现出这种现象(数据未显示)。为何会
出现这种现象呢?显然,葡萄糖的吸收必须通过跨膜
转运完成。因此,这迫使我们思考鱼腥藻 7120中是
否存在葡萄糖转运蛋白。由于鱼腥藻 7120全序列已
测定完毕( ht tp: / / www . kazusa. or. jp) , 通过搜寻
409 第 5 期 欧阳叶新等: 转基因鱼腥藻 7120适宜生长条件的初步研究
Genbank 发现鱼腥藻 7120中虽未发现特异性的葡
萄糖转运蛋白存在, 但却存在有一种称之为糖类
ABC 转运蛋白( Sugar ABC transporter , 基因进入
号: al l4824) , 这是一种与膜结合的透性酶蛋白
( Permease pr otein) ,参与糖类的转运。该酶与集胞
藻( Synechocy stis sp. PCC 6803)中的相关基因(基
因进入号: D90910)具有很高的同源性。因此,这很
容易使我们推测,可能是这种转运蛋白在转基因鱼
腥藻 7120中参与了葡萄糖的吸收。由于重组蛋白的
表达势必增加宿主细胞代谢负荷, 可能通过某种机
理激活了这种糖类 ABC转运蛋白对葡萄糖的转运,
从而导致对外源的葡萄糖的吸收; 而在野生型中则
很可能是因为细胞具有一种自主调控机理, 致使该
酶未被激活所致。是否是该酶在起作用、以及其机理
如何,有待进一步的实验证实。同时,近年来在硅藻
中通过转基因技术转入转运蛋白基因后, 致使其异
养型改变自养型获得成功 [ 12] , 这可能对本实验现象
的解释提供有益的启示。另外,重组蛋白的表达与宿
主细胞的合成代谢——如光合作用的调控究竟有何
关系,也是十分有趣的问题,值得进一步探索。
致谢: 中国人民解放军总医院的钟晖、董晓军和李振甲帮助
测定 T NF-放射免疫活性; 中国科学院武汉植物研究所罗
立明女士在论文写作过程中提供了具体帮助,特此致谢!
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