全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (6) : 475～ 479
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
A tdad 1 的超量表达抑制烟草细胞凋亡
华 玮1, 周德宝1, 2, 吕应堂1Ξ
(1. 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉　430072; 2. 包头师范学院生物系, 内蒙古包头　014300)
摘　要: 以A td ad 1 基因保守区为探针进行N o rthern 杂交, 检测到烟草也存在 d ad 1 的同源基因, 并且在叶和花中
表达量较大, 而随着叶片的衰老, d ad 1 的表达量明显降低。进一步以过量表达A td ad 1 基因的烟草悬浮细胞为材
料, 研究A td ad 1 基因与细胞凋亡的关系。结果发现 48℃热激 4 h 或 75 ngömL 放线菌素D 处理 48 h 均可诱导正常
细胞产生凋亡 (产生DNA ladder) , 而相同处理条件下过量表达A td ad 1 基因的烟草悬浮细胞并没有发生凋亡 (无
DNA ladder) , 说明转基因细胞具有一定抵抗凋亡的能力。同时检测到野生型非转基因悬浮细胞凋亡的诱导产生过
程中, d ad 1 基因表达量逐步降低。上述结果提供了较直接的证据表明在烟草细胞中 d ad 1 基因可能参与了细胞凋
亡的负调控。
关键词: A td ad 1; 转基因烟草; 细胞凋亡
中图分类号: Q 942. 5　　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0620475205
Overexpress ion of A tdad 1 Gene Could Repress the Apoptos is in Tobacco
HUA W ei1, ZHOU D e2Bao 1, 2, LU·· Y ing2T ang1Ξ
(1. K ey L ab of M O E f or P lan t D evelopm en t B iology , W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina;
2. D ep artm en t of B iology , B aotou N orm a l S chool, Bao tou, Inner M ongo lia　014300, Ch ina)
Abstract: N o rthern b lo t analyses revealed there is a homo logue of A td ad 1 in tobacco and the ex2
p ression is mo re in leaf and flow er. Bu t w ith the senescence of leaf, the exp ression reduced gradu2
ally. U sing tran sgen ic tobacco w ith 35S2A td ad 1,w e studied the connect ion of A td ad 1 and apop to2
sis. T he resu lts show ed 48℃ heat 4 hou rs o r 75 ngömL act inom ycin D trea t 48 hou rs cau sed the
no rm al cell apop to sis, bu t under the sam e condit ion, the tran sgen ic cell show ed no change. A nd
du ring the p rocess of apop to sis of no rm al cell, the exp ression of d ad 1 reduced step by step.
Key words: A td ad 1; A pop to sis; T ran sgen ic cell
　　细胞凋亡是一个广泛存在于生物界且具有积极
生物学意义的细胞死亡现象, 它与医学如人类疾病
的预防与治疗等有着极为密切的关系而倍受重视。
早在 1972 年 Kerr 等[1 ]观察到一种与细胞坏死形态
特征截然不同的细胞死亡的现象, 称之为细胞凋亡。
近 30 年来, 动物学和医学有关细胞凋亡的研究取得
了长足的进展。从最初的形态学描述, 到生化机理的
探讨, 以至凋亡相关基因的克隆, 动物细胞凋亡的研
究均取得了许多突破性进展[2, 3 ]。植物中细胞凋亡的
研究要晚于动物, 但最近十年也取得了一些可喜进
展。1994 年 Greenberg [4 ]最先提出植物中也存在细
胞凋亡现象, 随着近年来对植物细胞凋亡研究的深
入, 人们发现细胞凋亡贯穿于植物个体发育过程之
中。例如, 木质部的分化、花药的发育、绒毡层的退
化、子房和配子体的发生、性别决定, 以及胚乳发育
等[5 ]。对植物细胞凋亡的基本形态学及生化特征, 人
们有了较清楚的了解, 并发现植物细胞凋亡与动物
细胞凋亡有一定的相似性[6, 7 ]。Ξ 收稿日期: 2003203230, 修回日期: 2003206216。基金项目: 国家自然科学基金 (30070078 和 3023005)。作者简介: 华玮 (1977- ) , 女, 在读博士生, 现从事植物分子生物学研究。通讯作者 (E2m ail: yingtlu@w hu. edu. cn)。
目前, 人们的重点越来越集中于植物细胞凋亡
机理的研究, 推测植物细胞凋亡过程中可能也存在
类似动物细胞凋亡中的核酸内切酶的激活及 cas2
pase 蛋白酶的参与。不管是内源性因素还是外源性
因素诱导细胞凋亡, 都必须通过特定基因而发挥作
用。现已分离出许多与植物细胞凋亡相关的基因, 如
acd [4 ]、P to[8 ]、ben [9 ]、d ad [10 ]等等, 其中 d ad 基因是一
个进化过程中高度保守的凋亡抑制基因, 最先从人
分离得到, 它的缺失引起细胞凋亡的产生 [11 ]。
A pete 等[10 ]在水稻基因组中发现了 d ad 1 基因同源
物, 它与小鼠、仓鼠、线虫和人类 d ad 1 基因同源性
很高。Gallo is 等[12 ]从拟南芥 cDNA 文库中分离了
A td ad 基因, 其产物与哺乳动物细胞中阻止细胞凋
亡的蛋白DAD 1 非常相似。将该基因转入在严格温
度控制下发生凋亡的仓鼠突变体 t sBN 7 细胞中, 发
现其产物与人DAD 1 一样可以阻止细胞的凋亡。与
哺乳动物不同, Sou thern 杂交和基因组数据显示拟
南芥中可能有 2 个A td ad s 基因。N o rthern 杂交分
析表明A td ad s 基因存在于所有组织中, 尽管在种
子成熟和干化过程中该基因的转录水平下降。近年
来苹果、大豆、番茄中也分离到 d ad 1 同源基因, 但
目前对其功能研究还不深入, 仅限于通过 N o r2
thern, 原位杂交分析研究其表达模式, Sou thern 杂
交研究其拷贝数。
笔者为了深入探讨DAD 1 在植物细胞凋亡中
的可能作用机制, 利用A td ad 1 基因保守区为探针,
通过N o rthern 杂交实验发现烟草根、茎、叶、花中均
有表达信号, 说明在烟草中也存在A td ad 1 同源基
因, 并在叶和花中的表达量较大, 但随着叶片的衰
老, d ad 1 的表达量明显降低。将 35S2d ad 1 转化烟
草, 发现转基因植株的悬浮细胞具有一定的抗凋亡
能力, 而且在野生型细胞凋亡过程中 d ad 1 表达是
逐步降低的。以上结果表明植物 d ad 1 基因同动物
d ad 基因有相似的细胞凋亡抑制功能。
1　材料与方法
(1) 植物材料　烟草 (N icotiana tabacum L.
SR 1 ) 种子以 70% 乙醇消毒 30 s, 无菌水洗, 5%
N aC lO 溶液浸泡 20 m in, 无菌水洗 5 遍。种子平铺于
M S 培养基上, 置光照培养箱 (25℃) 中生长, 无菌苗
备用。
(2) 载体的构建　A td ad 1 基因构建于载体
pB luescrip t SK2上, 由法国 Perp ignan 大学 Patrick
Gallo is 教授馈赠。插入片段通过Xho É 酶切回收,
连接入载体 pB I121 中。
(3) 烟草的转化　连接产物经测序分析证实
后, 通过农杆菌 (A g robacterium tum ef aciens st ra in
LBA 4404)介导的转基因方式将目的基因导入到烟
草无菌苗叶盘中, 经 kanam ycin 250 ΛgömL 抗生素
筛选的转基因植株移入土钵, 并在温室中生长。
( 4 ) Northern 杂交　RNA 的分离提取及
N o rthern 杂交方法按照本实验室以前的方法[13 ]进
行。探针A td ad 1 通过随机引物延伸的方式32P标记,
杂交在高严谨条件下完成。
(5) 转基因烟草悬浮细胞系的建立　按马力耕
等人的方法[14 ]进行。
(6) 悬浮细胞的处理及细胞凋亡的检测　热激
处理按文献 [ 15 ]进行, 选用48℃处理4 h, 再培养
48 h; 放线菌素D 处理按文献 [ 16 ] 进行, 选用
75 ngömL 处理48 h。细胞凋亡的检测按如下方法进
行: DNA 梯状条带分析法检测核DNA 断裂情况, 烟
草细胞总DNA 的提取参照M itt ler等[17 ]的方法进行,
将约5 Λg提取的总DNA 加入115% 琼脂糖凝胶 (含
5 ΛgömL 溴化乙锭) , 电泳缓冲液为1×TA E, 恒压
90V 下电泳2 h, 于紫外观测仪上观察结果。
2　实验结果
2. 1　烟草A tdad 1 同源基因的检测
分别提取烟草根、茎、叶、花的总 RNA , 利用
A td ad 1 基因保守区为探针进行N o rthern 杂交, 结
果表明在烟草根、茎、叶、花中均有A td ad 1 同源基
因的表达, 大小约 600 bp (图 1: a) , 在不同生长阶段
的叶片 (幼叶- 成叶- 衰老的叶片)基因表达量也不
同, 衰老的叶片表达量最低 (图 1: b)。
2. 2　转基因植株的鉴定
烟草经含A td ad 1 基因的农杆菌转化后, 得到
30 棵独立植株, 经 PCR 鉴定 (载体两端的引物) , 株
系 1、4、5、6、9 扩出 600 bp 带 (图 2: a) , 表明A td ad 1
基因已成功转入这些烟草株系。N o rthern 鉴定 (A t2
d ad 1 为探针)显示,A td ad 1 基因在株系 1、4、5、9 中
过量表达 (图 2: b) , 并选用表达量较高的株系 9 建
立悬浮细胞系。
2. 3　D NA 梯状条带分析检测凋亡
DNA 梯状条带分析已成为检测细胞凋亡的最
重要的生化指标之一。对照和转基因细胞 48℃热激
处理后, 再正常培养 48 h 的基因组DNA 梯状条带
分析的检测结果显示, 正常细胞总DNA 为 1 条完
整的带, 而热激处理4 h的细胞, 其总DNA 被降解产
674 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
( a) 各组织器官的 d ad 1 同源基因表达及 RNA 电泳图: 1. 根, 2. 茎, 3. 叶, 4. 花, 5. 种子; (b) 不同生长阶段叶片的
d ad 1 同源基因表达及 RNA 电泳图: 1. 幼叶, 2. 成熟叶, 3. 衰老叶
(a) T he exp ression of d ad 1 homo logue gene in o rgans: 1. roo t, 2. stem , 3. leaf, 4. flow er, 5. seed; (b) T he exp ression
of d ad 1 homo logue gene in leaf of differen t phases: 1. young leaf, 2. m ature leaf, 3. senescene leaf
图 1　Northern 杂交检测烟草各组织 dad 1 同源基因的表达
F ig. 1　N o rthern analysis the exp ression of d ad 1 in tobacco o rgans
(a) PCR 检测: 0. 对照, 1～ 9. 转基因株系; (b)N o rthern 检测: 0. 对照, 1～ 9. 转基因株系
(a) PCR: 0. Contra l, 1- 9. T ransgen ic p lan t; (b)N o rthern: 0. Contra l, 1- 9. T ransgen ic p lan ts
图 2　转基因烟草株系的检测
F ig. 2　T he iden tify of the transgen ic tobacco
(a) 热激处理: 1. 分子量标准Ol X174öH ae III, 2. 对照正常细胞, 3. 处理的正常细胞, 4. 处理的转基因细胞; (b) 放线
菌素D 处理: 1. 分子量标准Ol X174öH ae III, 2. 对照正常细胞, 3. 处理转基因细胞, 4. 处理正常细胞
( a) H eat stress: 1. M arker, 2. N o rm al cell, 3. N o rm al cell after stress, 4. T ransgen ic cell after stress; (b ) A ctino2
m ycin D treatm ent: 1. M arker, 2. N o rm al cell, 3. T ransgen ic cell after treatm ent, 4. N o rm al cell after treatm ent
图 3　烟草细胞D NA 的琼脂糖凝胶电泳分析
F ig. 3　DNA electropho resis analysis
774　第 6 期　　　　　　　　　　　　　　华 玮等: A td ad 1 的超量表达抑制烟草细胞凋亡
生 180～ 200 bp 整数倍的断裂, 形成明显的DNA 梯
状条带, 而转基因细胞热激处理4 h后总DNA 仍为
1 条完整的带 (图 3: a)。琼脂糖凝胶电泳分析对照和
转基因烟草细胞放线菌素D 处理48 h后的基因组
DNA , 结果显示, 正常细胞总DNA 为 1 条完整的
带, 而放线菌素D 处理48 h的正常细胞总DNA 被
降解产生 180～ 200 bp 整数倍的断裂, 形成明显的
DNA 梯状条带, 而转基因细胞放线菌素D 处理48 h
后总DNA 仍为 1 条完整的带 (图 3: b)。以上结果表
明, 正常细胞热激 4 h 或放线菌素D 处理48 h都会
发生凋亡, 而转基因细胞几乎未发生凋亡。
2. 4　Northern 检测细胞凋亡过程中 dad 1 的表达
热激和放线菌素D处理的正常细胞随处理时间
的增加, d ad 1 基因表达降低 (图 4: a) , 说明在细胞
凋亡过程中 d ad 1 基因表达受到抑制, 而转基因细
胞 d ad 1 基因表达一直维持在一个高水平 (图 4: b)。
(a)细胞 48℃热激处理不同时间　1: 1 小时, 2: 2 小时, 3: 3 小时, 4: 4 小时; 放线菌素D 处理不同时间　5: 12
小时, 6: 24 小时, 7: 36 小时, 8: 48 小时; 下图为RNA 电泳图。 (b)转基因细胞 48℃热激处理不同时间　1: 1 小
时, 2: 2小时, 3: 3 小时, 4: 4 小时; 放线菌素D 处理不同时间　5: 12 小时, 6: 24 小时, 7: 36 小时, 8: 48 小时;
下图为RNA 电泳图
(a) Normal cell under heat stress for d ifferen t time　1: 1 h, 2: 2 h, 3: 3 h, 4: 4 h; Actinomyc in D treat for d if -
feren t time　5: 12 h, 6: 24 h, 7: 36 h, 8: 48 h. (b) Tran sgen ic cell under heat stress for d ifferen t time　1: 1 h,
2: 2 h, 3: 3 h, 4: 4 h; Actinomyc in D treat for d ifferen t time　5: 12 h, 6: 24 h, 7: 36 h, 8: 48 h
图 4　杂交检测不同正常烟草细胞和转基因细胞不同处理不同时间的 dad 1 同源基因的表达
F ig. 4　T he exp ression of d ad 1 of cell under treatm ents fo r differen t t im e　
3　讨论
细胞凋亡不仅存在于动物细胞中, 也发生于植
物个体发育中, 并起着重要作用。由于植物和动物的
细胞凋亡具有许多相同的形态学和生化特征, 因此
人们猜测细胞凋亡机制在植物和动物中是保守的。
一些动物细胞凋亡相关基因虽然在某些植物中发现
有同源序列, 但它们功能的保守性还有待于进一步
探讨[18 ]。某些植物中已分离出一些动物细胞凋亡相
关基因的同源基因, 并证明它们的功能在植物中也
相当保守[19, 20 ]。这说明以异源凋亡相关基因为探针
去寻找植物中相应的同源基因, 并进一步研究它们
的表达是完全可行的。当然, 也发现有些动物凋亡相
关基因在植物中并没有同源的功能[21 ]。d ad 1 基因
最先从动物中分离出, 是个高度保守基因, 并参与抑
制凋亡作用。虽然在多种植物中也分离出 d ad 1 基
因的同源序列, 与动物不同的是植物 d ad 1 基因是
双拷贝, 而动物 d ad 1 基因是单拷贝。目前 d ad 1 基
因在植物体内的功能还不清楚, 研究只局限于其表
达上, 发现不同物种 d ad 1 基因表达模式也不尽相
同, 拟南芥和柑橘 d ad 1 基因是随着花和叶片的衰
老表达量逐步减少[12, 22 ] , 而苹果 d ad 1 基因是随着
花和叶片的衰老表达量逐步增加[23 ]; 同时人们针对
d ad 1 基因还进行了原位表达方面的分析, 推测
d ad 1 基因在植物体内功能也与细胞凋亡有关。本文
深入探讨了植物体内 d ad 1 与细胞凋亡的关系, 首
先证实烟草也存在 d ad 1 的同源基因, 并在叶和花
有大量表达, 而且随着叶片的衰老, d ad 1 的表达量
明显降低, 表达模式类似于拟南芥和柑橘 d ad 1 基
因。将 35S2d ad 1 转化烟草发现转基因植株的悬浮
细胞具有一定的抑制凋亡能力, 说明植物DAD 1 可
能具有动物DAD 相似的功能。我们将转基因细胞
诱导凋亡处理的时间加长, 结果细胞也发生了凋亡,
说明凋亡是由多个基因共同调控的,DAD 1 单独不
874 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
能完全抑制凋亡, 但在一定程度可增加细胞抗凋亡
能力。
参考文献:
[ 1 ]　Kerr J F R ,W ylllie A H , Currie A R. A pop to sis: a ba2
sic b io logical phenom enon w ith w ide ranging imp lica2
t ions in tissue k inetics [J ]. B ri J Cancer, 1972, 26:
239 257.
[ 2 ]　Jacobson M D ,W eil M , R aff M C. P rogramm ed cell
death in an im al developm ent [ J ]. Cell, 1997, 88:
347 354.
[ 3 ]　Carl D Bo rtner, John A C idlow sk i. Cellu lar m echa2
nism s fo r the rep ression of apop to sis [J ]. A nnu R ev
P harm acol T ox icol, 2002, 42: 259 281.
[ 4 ]　Greenberg J T , Guo A , K lessig D F, et a l. P ro2
gramm ed cell death in p lan ts: A pathogen2t riggered
response activated coo rdinately w ith m ult ip le defense
functions[J ]. Cell, 1994, 77: 551 563.
[ 5 ]　N ing S B ,W ang L , Song Y C. P rogramm ed cell death
in p lan t——A new em erging research field [J ]. D ev
R ep B iol, 1999, 8: 71 100.
[ 6 ]　Greenberg J T. P rogramm ed cell death: A w ay of life
fo r p lan ts [J ]. P roc N atl A cad S ci U SA , 1996, 93:
12 094 12 097.
[ 7 ]　Kuriyam a H , Fukuda H. D evelopm ental p rogramm ed
cell death in p lan ts [J ]. Cu rr Op in P lan t B iol, 2002,
5: 568 573.
[ 8 ]　Keller S W , K im H 2N ,M allouk T E. L ayer2by2layer
assem bly of in tercala t ion compounds and hetero s2
t ructu res on surfaces: tow ards mo lecu lar“beaker”ep i2
taxy. [J ]. J A m Chem S oc, 1994, 116: 8 817 8 818.
[ 9 ]　 Ich ino se I, T aaw a H ,M izuk i S, et a l. Fo rm ation p ro2
cess of u ltra th in m ult ilayer film s of mo lybdenum
oxide by alternate adso rp tion of octamo lybdate and
linear po lycation [J ]. L angm u ir, 1998, 14, 187 192.
[10 ]　A p te S S,M atteiM G, Seldin M F, et a l. T he h igh ly
conserved defender against the death 1 (DAD 1) gene
m ap s to hum an ch romo som e 14q11- q12 and mouse
ch romo som e 14 and has p lan t and nem atode
homo logs[J ]. F EB S L ett, 1995, 363: 304 306.
[11 ]　N akash im a T , Sek iguch i T , Kuraoka A , et a l. M o lecu2
lar clon ing of a hum an cDNA encoding a novel p ro2
tein DAD 1 w ho se defect causes apop to tic cell death
in ham ster BH K21 cells[J ]. M ol Cell B iol, 1993, 13:
6 367 6 374.
[12 ]　Gallo is P,M ak ish im a T , H ech t V , et a l. A n A rab idop2
sis thaliana cDNA comp lem enting a ham ster apop to2
sis supp resso r m utan t [J ]. P lan t J , 1997, 11: 1 325
1 331.
[13 ]　W ang L , L iang S P, L u Y T. Characterizat ion, physi2
cal location and exp ression of the genes encoding cal2
cium öcalmodulin2dependen t p ro tein k inase in m aize
(Z ea m ay s L. ) [J ]. P lan ta , 2001, 213: 556 564.
[14 ]　马力耕, 周君莉, 张素巧, 等. 细胞外钙调素对转基因
烟草悬浮细胞 rbsS2GU S 基因表达的促进作用 [J ].
科学通报, 2000, 45 (19) : 2 075 2 080.
[15 ]　陈浩明, 颜长辉, 姜晓芳, 等. 热激诱导烟草悬浮细胞
的调亡[J ]. 科学通报, 1999, 44 (2) : 196 200.
[16 ]　K leeff J , Kovnm ann M , Saw hney H , et a l. A ctino2
m ycin D induces apop to sis and inh ib its of pancreatic
cancer cells[J ]. In t J Cancer, 2000, 86, 399 407.
[17 ]　M itter R , L am E. Iden tificat ion, characterizat ion, and
purificat ion of a tobacco endonuclease activity in2
duced on hypersensit ive response cell death [J ]. P lan t
Cell, 1995, 7: 1 951 1 962.
[18 ]　Geo rgieva E I, L opez2Rodas G, L o idl P. M aize em b2
ryo germ ination II: P ro teins rela ted to nuclear p ro to2
oncogene- and tumo r supp resso r gene2p roducts[J ].
P lan ta , 1994, 192: 125 129.
[19 ]　D ion M , Cham berland H , P lan te S M M , et a l. D etec2
t ion of a homo logue of bcl22 in p lan t cells [ J ].
B iochem Cell B iol, 1997, 75: 457 461.
[20 ]　R yals J ,W eym ann K,L aw ton K, et a l. T he A rabid op 2
sis N IM 1 p ro tein show s homo logy to the m amm alian
transcrip t ion facto r inh ib ito r L kB [ J ]. P lan t Cell,
1997, 9: 425 439.
[21 ]　D angl J L , D ietrich R A , R ichberg M H. D eath don’t
have no m ercy: Cell death p rogram s in p lan t2m icrobe
in teractions[J ]. P lan t Cell, 1996, 8: 1 793 1 807.
[22 ]　M o riguch i T , Kom atsu A , K ita M , et a l. M o lecu lar
clon ing of a homo logue of d ad 21 gene in citrus: dis2
t inct ive exp ression during fru it developm ent [ J ].
B ioch im B iop hy s A cta, 2000, 1 490: 198- 202
[23 ]　Dong Y H , Zhan X C, Kvarnheden A , et a l. Exp res2
sion of a cDNA from app le encoding a homo logue of
DAD 1, an inh ib ito r of p rogramm ed cell death [J ].
P lan t S ci, 1998, 139: 165 174.
974　第 6 期　　　　　　　　　　　　　　华 玮等: A td ad 1 的超量表达抑制烟草细胞凋亡