全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21( 5) : 375～384
Journal of Wuhan Botanical Research
钙和钙离子载体 A23187对水稻早期胚胎离体发育的影响
吴娟子, 赵 洁

(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉大学生命科学学院, 武汉　430072)
摘　要: 研究了不同浓度的钙( Ca2+ )和钙离子载体 A23187 对水稻早期胚胎离体发育的影响。结果表明: ( 1) Ca2+
对授粉后 3～5 d 水稻胚胎离体发育的调控具有时间和浓度效应。培养基中不含 Ca2+或 Ca 2+ 浓度较高 ( 10- 1 mo l/
L )时, 3 d 原胚离体分裂和生长完全受到抑制; 4～5 d 早期分化胚受到一定程度的影响 ;而 Ca2+ 浓度为 10- 3 mol/ L
时, 不同时期的水稻胚胎均表现出最佳的生长速度和最高的离体胚胎发生频率; 在相同的钙浓度条件下, 胚龄越
大, 胚胎发生频率及总诱导频率越大。( 2) A23187 影响水稻胚胎的离体生长和形态发生:胚胎越小, 影响越大;浓度
越高, 抑制作用越强。
关键词: 水稻; Ca2+ ; Ca 2+ 载体 A23187; 早期胚胎; 离体发育
中图分类号: Q944. 46; S511　　　　　文献标识码: A　　　　　文章编号: 1000-470X( 2003) 05-0375-10
Effects of Calcium and Ionophore A23187 on in vitro Development
of Early Embryo in Rice ( Oryza sativa L. )
WU Juan-Zi, ZHAO Jie


( K ey Laboratory of MOE f or P lant De ve lop mental B iology, Col leg e of L if e S ciences, Wuhan Univ ersi ty, Wuhan　430072, C hina)
Abstract: T he effects of calcium and ionophore A23187 on in vitr o development of early embryo in
rice( Ory z a sativ a L. ) w ere studied. The main r esults w er e as fo llow s: ( 1) the inf luence of Ca2+ on
the in vit ro development o f 3 to 5-day-old embryo s w as related to the concentrat ion o f Ca2+ and
the age o f embryos. Without Ca2+ or with the high concentrat ion of Ca2+ ( 10- 1 mol/ L ) , the grow th
of 3-day-old embr yos w as inhibited completely and the development of 4 to 5-day-old embryo s
w as af fected in certain deg ree. With 10- 3 mol/ L Ca2+ , 3 to 5-day-old embryos g rew rapidly and
the highest f requency of embryogenesis appeared. In the same concentration o f Ca2+ , the older the
embr yos w ere, the higher the f requency of embryogenesis and the total induct ion appeared. ( 2)
A23187 inf luenced in vitro embryo development and morphosis. With increasing A23187 concen-
tr at ion, the in v itro development of the embryos in rice w as inhibited mor e violent ly . The younger
embr yos w ere, the more obvious inhibition.
Key words : Rice; Ca
2+
; Ca
2+
io nophore A 23187; Early embryo ; I n vit ro development
　　钙是植物体内一种重要的元素,它在植物生命
活动中起着重要的作用。多年来,有关钙在植物体内
的功能一直是一个非常活跃的研究领域[ 1 4]。钙在
植物有性生殖过程中的重要性也一直受到研究者的
关注,研究表明钙参与了从授粉到受精以及胚胎发
育的全过程[ 5 8]。在植物有性生殖系统中,研究最多
和最深入的是离体萌发的花粉管,其它方面则较为
薄弱。


收稿日期: 2003-04-09,修回日期: 2003-05-21。
基金项目:国家自然科学基金项目( 30170091) ;国家重大基础研究前期专项项目( 2002CCA 00100)资助。
作者简介:吴娟子( 1977- ) ,女,硕士研究生,研究方向为植物发育生物学。
通讯作者( E-mail: jzh ao@ w hu. edu. cn )。
卵细胞经受精形成的合子是高等植物新生命的
开始,继而进行一系列的胚胎发育过程。以细胞工程
技术为基础的实验胚胎学方法是研究植物胚胎发育
的重要方法之一。由于合子胚的发育是在胚囊中进
行,对合子胚尤其是早期的胚胎进行直接操作存在
困难。离体培养系统中的体细胞胚胎发生为研究植
物胚胎发育提供了良好的实验系统。Timmers 等[ 9]
曾应用金霉素( Chloro tet racyclin, CTC )和氟奋乃静
( Fluphenannize, FPZ)荧光探针观察胡萝卜体细胞
胚胎发生过程中膜钙和活化钙调素的分布变化。
Overvoor de 和 Gr imes [ 10]发现钙和钙调素对胡萝卜
体细胞胚诱导起着重要的作用。Ett iene 等[ 11]也认
为钙在三叶胶( H evea br asiliensis L. )体细胞胚胎的
形成和发育过程中起着重要的作用。适当浓度的
Ca2+促进了长期继代培养的三叶胶愈伤组织体细胞
胚胎发生, Ca2+不仅影响了体细胞胚胎的发生频率,
而且影响了胚胎的进一步发育。
尽管植物体细胞胚胎发生的离体实验系统为研
究植物胚胎发育提供了一个良好的研究体系,但是
由于不同植物、不同器官和组织诱导体细胞胚胎形
成的条件差异较大, 利用该系统探讨胚胎发生的机
理所提供的资料仍相当有限;加之,体细胞胚胎的变
异很大,且为间接诱导和非合子胚胎。因此,体细胞
胚胎并非能完全代替体内胚胎的发育。我们直接利
用合子胚进行体外培养实验, 为研究和探讨胚胎发
育过程中的诸多事件及调控机理提供更为直接可靠
的证据,并具有体细胞胚胎发生系统不可替代的优
越性。
我们利用已建立的水稻原胚分离、培养的实验
操作系统[ 12] , 在培养基中加入不同浓度的钙
( Ca
2+ )、钙离子载体 A23187, 研究了它们对水稻合
子胚离体发育的影响。此研究成果填补了外源钙对
植物早期合子胚离体发育调控的研究空白, 为探讨
植物胚胎发育过程中的诸多调控因子的作用提供了
理论依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
以水稻( Ory z a sativa L. )品种春江05(早粳)为
实验材料,材料种植于本实验室温室内。
1. 2　分离与培养
取授粉后3～5 d的水稻子房,用 75%的乙醇消
毒 0. 5～1 min, 0. 05%升汞消毒 12～15 min, 无菌
水清洗 4～5 次, 浸入 8%的甘露醇中备用。在
Olympus CK2倒置显微镜下, 用微针解剖出水稻
3～5 d的胚胎,接种入培养基中。接种后 0～6 d, 每
3 d添加等量的渗透压减小的同种培养基。胚胎在恒
温培养箱中暗培养 6～9 d。尔后, 转入弱光下培养。
温度为( 28±2)℃。
1. 3　培养基
基本培养基: 无钙盐的 N 6基本培养基, 附加
300 mg / L LH (水解乳蛋白) , 10%CM (椰乳汁, Sig-
ma) , 610 mg / L 14 种氨基酸, 7%麦芽糖, 1 mg/ L
IAA 和 1 mg / L 6-BA , pH 调节至 5. 8～6. 0。培养基
用 0. 45
m 微孔滤膜过滤灭菌。
添加培养基: 用于在胚胎发育过程中逐渐减小
培养环境中的渗透压。无钙盐的 N6基本培养基, 附
加 4%麦芽糖, 其他附加成分与基本培养基中相同,
其中的Ca2+ 及 A23187浓度与梯度实验一致。
胚状体成苗培养基: 含钙盐的N 6基本培养基,
附加 0. 2 mg / L 6-BA, 1 mg / L IAA, 3%蔗糖和
0. 8～1. 0%琼脂。
愈伤组织增殖培养基: 含钙盐的 N6基本培养
基, 附加 2. 0 mg/ L 2. 4-D, 0. 5 mg / L KT, 3%蔗糖
和 0. 8～1. 0%琼脂。
根和芽分化培养基: 含钙盐的N 6基本培养基,
附加 0. 5 mg / L 6-BA, 0. 2 mg / L IAA, 3%蔗糖和
0. 8～1. 0%琼脂。
Ca
2+ 梯度实验: 共分 4个实验组, 基本培养基
中分别加入 10- 5、10- 3和 10- 1 mo l/ L Ca2+ 作为处理
组,以不加 Ca2+ 作为对照组。每组实验重复 3～5
次。
钙离子载体 A23187 梯度实验: 共分 4个实验
组, 基本培养基中加入 10- 3 mol/ L Ca2+ , 再分别加
入 10- 6、10- 5和 10- 4 mol/ L A23187 ( Sigma ) 作为
处理组,以不加 A23187作为对照组。每组实验重复
3～5次。
实验中所用器皿均用双蒸水和超纯水分别清洗
3次,所有试剂及溶液均用超纯水配制。
1. 4　观察与记录
接种后,在显微镜下用测微尺测量胚胎的长度
和宽度; 培养后第 3、6和 9 d,用相同的方法测量生
长胚胎的长度和宽度; 接种后第 9 d统计并计算胚
胎离体发育中不同发育途径的百分率。在 LEICA
DMIRB 倒置显微镜和 OLYMPUS SZX12体式显
微镜下观察, 用 CCD ( M icroMAX Princeton In-
str ument , Inc) 和 MetaM or ph Sof tware ( Univ er sal
Imag ing , Crop ) 及 RSImage ( Roper scient ific,
376 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
Inc. ) 软件摄影。
2　结果
2. 1　Ca2+对水稻 3～5 d胚胎离体发育的影响
水稻授粉后3 d胚胎为未分化的梨形胚; 4 d为刚
出现胚芽生长锥的早期分化胚; 5 d为分化出胚芽生
长锥、胚芽鞘和盾片的早期分化胚(图版Ⅰ: a～c)。
2. 1. 1　Ca2+ 对水稻 3～5 d 胚胎离体生长的影响
Ca
2+ 对水稻早期胚胎离体生长具有时间和浓
度效应。无 Ca2+ 或高浓度 Ca2+ ( 10- 1mol/ L )时, 3 d
原胚离体分裂和生长完全受到抑制; 4～5 d早期分
化胚则受到一定程度的抑制, 且 Ca2+ 浓度为
10- 1 mo l/ L 时抑制作用更强。当 Ca2+ 浓 度为
10- 5 mo l/ L和 10- 3 mol/ L 时, 3 d 原胚有一定程度
的生长,但较为缓慢; 4～5 d 早期分化胚细胞分裂
旺盛, 生长迅速。培养基中外加10- 3mol/ L Ca2+时,
不同时期的水稻胚胎均表现出最佳的生长速度(图
1～图 3)。
胚胎接种总数为 51～68个。在图 1: B 中无 Ca2+ 和 Ca2+ 为 10- 1 m ol/ L 的 2条线重叠
The tot al number o f embryos inoculated var ied betw een 51 and 68. In fig . 1: B, the lines
o f w ithout Ca2+ and w ith 10- 1 mol/ L Ca2+ over lap
图 1　Ca2+ 对水稻 3 d胚胎离体生长的影响
Fig. 1　Effects of Ca2+ on the in v itr o development of 3-day-o ld embryos in r ice
胚胎接种总数为 52～60 个
T he t otal num ber of embryo s inoculated va ried betw een 52 and 60
图 2　Ca2+ 对水稻 4 d胚胎离体生长的影响
Fig. 2　Effects of Ca2+ on the in v itr o development of 4-day-o ld embryos in r ice
377　第 5 期　　　　　　　　　吴娟子等: 钙和钙离子载体 A23187 对水稻早期胚胎离体发育的影响
胚胎接种总数为 53～57 个
T he t otal num ber of embryo s inoculated va ried betw een 53 and 57
图 3　Ca2+ 对水稻 5 d胚胎离体生长的影响
Fig. 3　Effects of Ca2+ on the in v itr o development of 5-day-o ld embryos in r ice
2. 1. 2　Ca2+ 对水稻3～5 d胚胎离体形态发生的影响
形态学特点: 培养 1 d后, 3～4 d胚胎的大小和
形状几乎无变化;而 5 d胚胎边缘细胞变得疏松,胚
体增大,色泽变深(图版Ⅰ: d)。培养 3 d后, 3 d 原胚
胚体稍增大; 4～5 d早期分化胚胚体增大,部分胚
胎的胚芽生长锥和胚芽鞘分化明显(图版Ⅰ: e) , 部
分胚胎的胚体边缘形成愈伤组织(图版Ⅰ: g )。培养
6 d后, 3 d原胚生长仍较慢,部分原胚中部一侧出现
一个小凹陷, 分化出胚芽原基,在胚的另一端分化出
胚根原基;部分原胚愈伤组织化。4～5 d 早期分化
胚离体生长和形态发生比 3 d 原胚迅速; 此时已形
成较大的胚状体(图版Ⅱ: a) ,有些已开始萌发(图版
Ⅰ: f ) ,或部分胚胎继续愈伤组织化(图版Ⅰ: h)。培养
9 d 后, 3 d 原胚部分进一步形成胚状体, 部分继续
愈伤组织化, 但体积较小; 4～5 d早期分化胚形成
的胚状体或愈伤组织(图版Ⅰ: i)继续生长,形态多种
多样。9 d后, 胚状体(图版Ⅱ: a)转入胚状体成苗培
养基并萌发成小植株(图版Ⅱ: b, c)。在诱导和萌发
过程中出现少数异常胚状体, 有的仅萌发出丛生芽
(图版Ⅱ: d) , 有的仅有芽无根(图版Ⅱ: e)。愈伤组织
转入愈伤组织增殖培养基, 15 d 后再转入根和芽分
化培养基,诱导形成小植株。
诱导频率: Ca2+ 对水稻 3～5 d胚胎离体形态发
生途径具有一定的浓度效应。Ca2+浓度为 10- 3mo l/
L 时,表现出不同发育时期的水稻胚胎离体胚胎发
生频率均最高。在相同的钙条件下,胚龄越大,胚胎
发生频率及总诱导频率越高(表 1)。3 d 原胚在无
Ca
2+ 或高浓度 Ca2+ ( 10- 1 mol/ L )时均不能发育, 但
在适合的外源钙浓度条件下( 10- 3 mo l/ L ) ,总诱导
频率可高达 71. 3%, 其中, 胚胎发生和愈伤组织诱
导的比例约为 1∶1。4～5 d 早期分化胚在不同的
Ca
2+ 浓度条件下,总诱导频率为 72. 2%～100%。当
Ca
2+ 浓度为 10- 3 mol/ L , 总诱导频率最高( 100% )。
Ca
2+ 浓度从 0、10- 5mol/ L 到 10- 3 mo l/ L ,随着钙浓
度的升高,胚胎发生频率逐渐增大, 但 Ca2+ 浓度升
高到 10- 1 mol/ L 时,胚胎发生频率却下降(表 1)。
表 1　Ca2+ 对水稻 3～5 d胚胎离体形态发生的影响
T able 1　Effects o f Ca 2+ on the in v itr o morphosis o f 3 to 5-day-o ld embryos in r ice
Ca 2+ 浓度( mo l/ L )
Ca2+ concen-
trat ion
授粉后天数( d)
Days after
pollinat ion
胚胎接种数(个)
Number s o f
embryo s
胚胎发生频率( % )
F requency o f
embryogenesis
愈伤诱导频率( % )
Frequency
o f callus
induction
总诱导频率( % )
Tot al
induction
fr equency
3 68 0 0 0
0 4 54 31. 3±1. 8 40. 9±2. 0 72. 2±3. 4
5 53 58. 5±12. 2 37. 8±9. 8 96. 4±3. 2
3 51 11. 7±3. 7 31. 4±3. 5 43. 1±7. 0
10- 5 4 52 50. 0±7. 8 42. 2±7. 7 92. 2±4. 4
5 54 66. 0±6. 1 34. 0±6. 1 100
378 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
　　　续表 1　
Ca 2+ 浓度( mo l/ L )
Ca2+ concen-
trat ion
授粉后天数( d)
Days after
pollinat ion
胚胎接种数(个)
Number s o f
embryo s
胚胎发生频率( % )
F requency o f
embryogenesis
愈伤诱导频率( % )
Frequency
o f callus
induction
总诱导频率( % )
Tot al
induction
fr equency
3 53 34. 2±4. 2 37. 1±10. 8 71. 3±11. 7
10- 3 4 52 64. 6±7. 6 35. 4±7. 6 100
5 53 76. 5±4. 8 23. 5±4. 8 100
3 64 0 0 0
10- 1 4 60 43. 9±3. 6 48. 1±4. 3 92. 0±6. 3
5 57 47. 1±10. 4 51. 2±11. 4 98. 3±1. 7
注: 表中数据为平均值和标准差。
Note : Datas in t he t able r epr esent the mean values ± S. D.
2. 2　钙离子载体 A23187对水稻 3～5 d 胚胎离体
发育的影响
2. 2. 1　A23187对水稻3～5 d胚胎离体生长的影响
在培养基中加入 A23187抑制了水稻胚胎的离
体生长,其对不同发育时期的胚胎作用强度不一, 胚
胎越小, 抑制作用越强。随着 A 23187浓度的增加,
抑制作用增强。当A23187浓度达到 10- 4 mol/ L , 几
乎完全抑制 3 d原胚的离体生长(图 4～图 6)。
基本培养基中附加 10- 3 mol/ L Ca2+、10% CM 和 14 种氨基酸。胚胎接种总数为 53～64 个
Basal medium supplemented with 10- 3 mo l/ L Ca 2+ , 10% CM and 14 amino acids. T he tota l
number o f embryos inoculated var ied bet ween 53 and 64
图 4　A23187 对水稻 3 d胚胎离体生长的影响
Fig . 4　Effects of A23187 on the in v itr o developm ent o f 3-day-o ld embryos in r ice
基本培养基中附加 10- 3 mol/ L Ca2+、10% CM 和 14 种氨基酸。胚胎接种总数为 53～64 个
Basal medium supplement ed w ith 10- 3 mol/ L Ca2+ , 10% CM and 14 amino acids. The to tal
number o f embryos inoculated var ied bet ween 53 and 64
图 5　A23187对水稻 4 d早期分化胚离体生长的影响
Fig . 5　Effects of A23187 on the in v itr o developm ent o f 4-day-o ld embryos in r ice
379　第 5 期　　　　　　　　　吴娟子等: 钙和钙离子载体 A23187 对水稻早期胚胎离体发育的影响
基本培养基中附加 10- 3 mol/ L Ca2+、10% CM 和 14 种氨基酸。胚胎接种总数为 52～56 个
Basal medium supplemented with 10- 3 mo l/ L Ca 2+ , 10% CM and 14 amino acids. T he total
number o f embryos inoculated var ied bet ween 52 and 56
图 6　A23187对水稻 5 d早期分化胚离体生长的影响
Fig . 6　Effects of A23187 on the in v itr o developm ent o f 5-day-o ld embryos in r ice
2. 2. 2　A23187 对水稻 3～5 d 胚胎离体形态发生
的影响
形态学特点: 培养基中加入A 23187后, 3～5 d
胚胎离体发育的形态与仅含 Ca2+ 的培养基中的形
态几乎没有差别, 不同的是胚胎生长速率的差异。
诱导频率: A23187 影响水稻胚胎的离体发育
亦有浓度效应。随 A23187浓度升高, 3 d原胚的胚
胎发生、愈伤组织及总诱导频率均逐渐降低; 4 d早
期分化胚的胚胎发生及总诱导频率均逐渐降低,而
愈伤组织诱导频率变化趋势有所改变。当 A23187
浓度从 0增加到 10- 5 mol/ L 时, 愈伤组织诱导频率
逐渐升高;当 A23187浓度继续增加到 10- 4 mol/ L
时, 其频率又有所下降。5 d 早期分化胚, 随着
A 23187浓度的升高, 总诱导频率几乎不变,而不同
的是胚胎发生频率逐渐降低, 愈伤组织诱导频率逐
渐增高。上述结果表明, A23187的浓度越高, 对离
体胚胎发生的抑制作用越强烈(表 2)。
表 2　A23187 对水稻 3～5 d胚胎离体发育途径的影响
T able 2　Effect s o f A23187 on the in v itr o morphosis o f 3 to 5-day-old embryos in rice
A23187 浓度( mol/ L )
A23187
concent ration
授粉后天数( d)
Day s a fter
po llination
胚胎接种数(个)
Numbers
o f embryos
胚胎发生频率( % )
Frequency of
embryogenesis
愈伤诱导频率( % )
F requency
of callus
induct ion
总诱导频率( % )
To tal
induction
fr equency
3 53 34. 2±4. 2 37. 1±10. 8 71. 3±11. 7
0 4 52 64. 6±7. 6 35. 4±7. 6 100
5 53 78. 1±3. 2 21. 9±3. 2 100
3 58 19. 0±4. 0 25. 3±3. 4 44. 4±4. 5
10- 6 4 52 56. 4±11. 1 39. 6±13. 7 96. 0±3. 6
5 52 76. 5± 4. 8 23. 5±4. 8 100
3 64 8. 2±1. 7 16. 2±5. 2 24. 5±6. 1
10- 5 4 53 37. 8±5. 9 43. 1±4. 5 80. 9±6. 8
5 56 60. 4±5. 9 39. 6±5. 9 100
3 56 0 0 0
10- 4 4 51 31. 9±2. 9 37. 9±6. 9 69. 9±6. 6
5 52 44. 5±3. 0 53. 6±5. 7 98. 1±1. 8
注: 表中数据为平均值和标准差。
Note : Datas in t he t able r epr esent the mean values ± S. D.
380 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
3　讨论
3. 1　Ca2+在植物胚胎离体发育中的作用
植物胚胎发育是胚胎细胞不断分裂、生长及分
化的过程, Ca2+ 在其中起着十分重要的作用。研究
表明:胞质 Ca2+通过影响有丝分裂器的行为参与有
丝分裂的调控,后期的启动和染色体的运动需较高
水平的 Ca2+ ,但超出正常的生理范围则抑制正常的
分裂过程[ 13, 14]。曾有研究表明Ca2+的增多达到一定
的限度时会导致内质网的解体, 释放的水解酶会破
坏细胞骨架。因此, Ca2+通过影响胚胎细胞的分裂
和生长参与胚胎离体发育的调控。
我们在实验中发现Ca2+对 3 d原胚比对4～5 d
早期分化胚的离体发育影响更明显。这可能是因为
4～5 d 早期分化胚较 3 d原胚具有更强的钙调节能
力,即贮存钙和游离钙之间的相互转化能力较强。在
培养基中外加 10- 3 mo l/ L Ca2+时,不同时期的水稻
胚胎均表现出最佳的生长速度。培养基中无 Ca2+或
高浓度 Ca2+ ( 10- 1 mol/ L )时, 3 d 原胚离体分裂和
生长完全受到抑制; 4～5 d早期分化胚则受到一定
程度的抑制。这表明一定浓度的 Ca2+ 是水稻早期胚
胎离体生长所必需的, 10- 3 mol/ L Ca2+比较适合水
稻早期胚胎的离体发育,过低或过高均会抑制水稻
早期胚胎的离体发育。
Overvoor de 和 Grimes[ 10]也曾利用胡萝卜体细
胞胚胎培养系统探讨钙和钙调素在体胚诱导过程中
的作用,发现胡萝卜体细胞胚胎诱导过程中, Ca2+的
临界值为 200
mol/ L , 等于或高于此值时,体细胞
胚胎诱导频率均较高; 等于或低于 100
mol/ L 时,
体胚诱导频率显著下降。Montoro 等 [ 15]在三叶胶体
细胞胚胎的诱导中发现:当培养基中的 Ca2+ 浓度为
0～9 mmo l/ L 时, 胚性愈伤的诱导频率无明显变
化,当 Ca2+ 浓度高于此范围时,胚性愈伤的诱导频
率下降。Ett iene等 [ 11]通过一系列的 Ca2+ 梯度试验
发现: 在长期继代培养的三叶胶愈伤组织向胚胎发
生转化的过程中, 9 mmol / L 的 Ca2+ 是协调愈伤组
织细胞增殖与胚胎发生之间的最适 Ca2+ 浓度, 在此
条件下三叶胶愈伤组织获得了最适的胚胎发生频率
及胚胎进一步发育的能力。在小麦体细胞胚胎的诱
导中, Ca2+浓度一般在 0～24 mmol/ L 范围内[ 16]。
我们在实验中发现, Ca2+ 浓度在 0～10- 3 mol/
L 范围内, 随着钙浓度的升高, 水稻 4～5 d早期分
化胚的胚胎发生频率逐渐增大,但 Ca2+浓度升高到
10
- 1
mol/ L 时,胚胎发生频率却下降。Ca2+ 浓度为
10
- 3
mo l/ L 时, 不同时期的水稻胚胎均出现最高的
离体胚胎发生频率。这表明水稻早期胚胎离体培养
中诱导胚胎沿类似于体内发育途径继续发育需要适
当的 Ca2+水平,过高或过低均不适合其继续发育。
因此,无论是植物体细胞胚还是合子胚的离体发育
均需要适当的 Ca2+水平。
植物胚胎发育过程中的形态发生是指器官原基
和器官的形成过程,这是一个伴随着胚胎细胞分裂
和生长, 并在胚胎内产生一系列区域化和功能化的
细胞分化过程。钙是一种影响细胞分化的重要调节
因子 [ 17, 18] , 它必然会影响到植物胚胎发育的根芽分
化过程。
赵洁等[ 19]在小麦分离的合子胚中发现接近分
化的梨形胚中仅即将分化形成胚芽、胚根的部位含
有较强的 CTC 荧光,这表明胚芽和胚根分化时含有
较高的膜钙。在本实验中,在一定浓度范围内,随着
Ca
2+ 浓度的增高, 水稻胚胎的离体胚胎发生频率逐
渐增高。这暗示着 Ca2+与合子胚的体内和离体发育
有着密切的关系。
Ca
2+ 对水稻不同发育时期胚胎的离体形态发生
有着明显的差异。3～5 d原胚随着胚龄的增加, 其
总诱导频率、胚胎发生频率逐渐增高,其原因: 一方
面是因为已分化的 4～5 d 水稻胚胎较3 d原胚具有
更强的生长和分化能力; 另一方面是因为 Ca2+ 影响
了胚胎细胞的分裂、生长和分化速度,进而影响了胚
胎的形态发生。
3. 2　Ca2+ 载体 A23187在植物胚胎离体发育中的
作用
A 23187是一类被称为抗生素离子载体的化合
物,它能与二价阳离子以 2∶1的比例形成中性复合
物。由于它对 Ca2+ 具有较高的选择性,因此常被用
作研究 Ca2+ 跨膜运输的重要工具 [ 20]。A23187 与
Ca2+ 形成的中性复合物溶解进入细胞膜,增强了细
胞膜对Ca2+ 的渗透性,形成了胞内的高钙环境。
当培养基中加入 A23187时, 抑制了水稻胚胎
的离体发育,且呈现出规律性的变化。其一, 胚胎越
小, 抑制胚胎离体生长的作用越明显; 其二, 随着
A 23187浓度的升高,抑制作用增强。这可能是因为
A 23187促进了培养基中 Ca2+ 内流, 形成胞内高钙
环境,从而直接或间接的影响了细胞的生理生化过
程,进而影响胚胎的离体生长和发育。
Overvoorde 和 Grimes [ 10]曾指出: 胞质钙浓度
一般维持在 nmol/ L 水平,微量的 Ca2+内流和外流
对建立和维持胞内的离子梯度起着十分重要的作
381　第 5 期　　　　　　　　　吴娟子等: 钙和钙离子载体 A23187 对水稻早期胚胎离体发育的影响
用。这一梯度在细胞分化或胚胎发生方式的调控中
起着十分重要的作用。Ca2+ 载体 A23187促进Ca2+
跨膜运输, 破坏胞内的 Ca2+ 梯度,从而抑制细胞的
生长。我们发现 A23187影响水稻3～5 d 胚胎的离
体形态发生, 浓度越高,抑制作用越强。因此,我们推
测 A23187可能通过影响胚胎细胞的胞内 Ca2+ 梯
度,从而影响胚胎的离体发育。
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382 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
吴娟子等: 图版Ⅰ WU Juan-Zi et al .: Plate Ⅰ
383　第 5 期　　　　　　　　　吴娟子等: 钙和钙离子载体 A23187 对水稻早期胚胎离体发育的影响
吴娟子等: 图版Ⅱ WU Juan-Zi et al .: Plate Ⅱ
图版Ⅰ: 水稻 3～5 d 胚胎的离体发育。a. 示刚分离的水稻 3 d 胚; b. 示刚分离的水稻 4 d 胚; c.示刚分离的水稻 5 d 胚。箭表示
胚芽鞘, 箭头表示生长锥; d.示水稻 5 d 胚培养1 d 后的生长状况; e.示水稻 5 d 胚培养 3 d 后的生长状况; f.示水稻5 d 胚培养
6 d 后形成的胚状体开始萌发; g .示水稻 4 d 胚培养 3 d 后胚体边缘愈伤组织化; h. 示水稻 4 d 胚培养 6 d 后愈伤组织化; i.示
水稻 5 d 胚培养 9 d 后愈伤组织化。比例尺分别为: a. 25
m; b. 66
m ; c. 52
m; d. 116
m ; e. 185
m ; f. 667
m ; g . 79
m;
h. 164
m; I. 357
m
图版Ⅱ:水稻 3～5 d 胚胎培养中胚状体的形成及植株再生。a. 示胚状体群体; b. 示萌发的胚状体; c. 示小植株的生长情况;
d.示仅具丛生芽的胚状体; e.示仅具芽无根的胚状体。比例尺分别为: a. 720
m; b. 282
m; c. 13 571
m; d. 323
m; e . 337
m
Plate Ⅰ: The in v itr o development o f 3 t o 5-day-old r ice embryo s. a . A 3-day-old embryo of r ice; b. A 4-day-o ld embryo of
rice; c. A 5-day-o ld embryo o f r ice. An arr ow indicates coleoptile and an arr ow head indicat es g r ow th cone; d. A 5-day-old em-
bryo of r ice after 1 day o f culture ; e. A 5-day-o ld em bryo o f rice after 3 day s o f culture . An ar rowhead indicat es coleoptile. f. A
bourg eoning embryoid derived from 5-day-o ld embryo o f r ice after 6 days of cultur e; g . The callus der ived from 4-day-o ld em-
bryo of r ice aft er 3 days o f culture; h. The callus derived fr om 4-day-o ld embryo of rice after 6 day s of cultur e; i. The callus de-
rived fr om 5-day-o ld embryo of r ice after 9 day s of culture. Scale bar s, 25
m in( a ) ; 66
m in ( b) ; 52
m in ( c) ; 116
m in
( d) ; 185
m in ( e) ; 667
m in ( f ) ; 79
m in ( g) ; 164
m in ( h) ; 357
m in ( i)
PlateⅡ: The embryo ids and plants r eg ener ation o f 3 to 5-day-old rice embryos in in vitr o cultur e. a. Embryoids; b. A bour-
geoned Embryoid; c. Regenerat ion plant lets fr om em bryo s; d. A Embryoid w ith clustered buds; e . A Embryoid w it h a bud but
no r oo t. Scale ba rs, 720
m in ( a) ; 282
m in ( b) ; 13 571
m in ( c) ; 323
m in ( d) ; 337
m in ( e)
384 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷