全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (4) : 299～ 302
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量
提取和纯化藻蓝蛋白的研究
胡一兵1, 2 胡鸿钧1Ξ 李夜光1 耿亚红1
(1. 中国科学院武汉植物研究所, 武汉 430074; 2. 湖北民族学院生物科学与技术学院, 恩施 445000)
摘 要: 采用新鲜藻丝为原料和分段梯度盐析分离纯化钝顶螺旋藻 Sp (N S) 290020 的藻蓝蛋白 (PC) , 经羟基磷灰
石一次层析, 能使提取的 PC 的纯度大于普遍认可的标准。由于该工艺流程较为简单, 适合藻蓝蛋白的大量生产。藻
胆蛋白经 Sephadex 凝胶过滤后的可达电泳纯度标准。经 SD S2PA GE 测得 PC, A PC 的分子量分别约为 38, 33 kD。
关键词: 钝顶螺旋藻; 藻蓝蛋白; 别藻蓝蛋白; 分离纯化
中图分类号: Q 946; Q 949. 22 文献标识码: A 文章编号: 10002470X (2002) 0420299204
Study on M ass Production of Phycob il in s from
PC R ich Stra in of Sp iru lina p la tens is
HU Y i2B ing1, 2, HU Hong2Jun1Ξ , L I Ye2Guang1, GEN G Ya2Hong1
(1. W uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, W uhan 430074, Ch ina;
(2. S chool of B iolog ica l S cience and T echnology , H ubei Institu te f or N a tiona lities, Ensh i 445000, Ch ina)
Abstract: F resh algal m ateria l of the phycob ilin s2rich st ra in of S p iru lina p la tensis SP (N S290020)
w as u sed to separa te and pu rify PC by m ean s of gradien t sa lt ing ou t. P recip ita tes of ex tracts w ere
p rocessed by ch rom atographying on hydroxylapat ite (HA ). T he p rocedu re of ex tract ion and pu2
rif ica t ion w as p roved to be simp le and eff icien t, su itab le fo r m ass p roduct ion of PC. D ata of SD S2
PA GE show ed that the mo lecu lar w eigh t of PC and A PC w ere abou t 38 kD and 33 kD , respec2
t ively.
Key words: S p iru lina p la tensis; C2phycocyan in; A llophycocyan in; Separa t ion and pu rif ica t ion
螺旋藻是丝状的多细胞蓝藻, 因含有多种对人
体有益的营养物质而受到广泛的关注, 其突出特点
是氨基酸种类齐全且蛋白质含量高, 其中含量最高
的藻蓝蛋白 (PC) 和别藻蓝蛋白 (A PC) 一直是基础
研究的热点, 因为它们不仅在光合作用的原初反应
机理的探索方面有重要意义[1 ] , 而且可以作为生物
体内的荧光示踪物质, 作为天然的色素蛋白也具有
十分广阔的应用前景[2 ]。但由于分离纯化的困难, 现
有的藻胆蛋白商品价格昂贵, 使它的应用受到了一
定的限制。
螺旋藻 Sp (N S) 290020 是经过自然筛选得到的
一个富含藻蓝蛋白的品系[3 ] , 其藻胆蛋白含量高达
干重的 22163% , 明显高于美国 Earth rise Farm s 公
司生产的螺旋藻藻胆蛋白 (15% ) , 这一品系在武汉
地区已实现工厂化生产, 为商业化生产藻胆蛋白提
供了优质原料。由于已报道的藻胆蛋白分离纯化方
法复杂, 导致生产成本太高无法大量制备以满足潜
在的市场需求。本研究的目的就是探讨一种简单有Ξ 收稿日期: 2001212227, 修回日期: 2002205209。作者简介: 胡一兵 (1968- ) , 男, 硕士, 讲师, 研究方向为藻类生理及生化。通讯作者。
效的适合大量制备的分离纯化藻胆蛋白的方法, 并
对藻胆蛋白性质作初步的分析。
1 材料和方法
1. 1 藻种
钝顶螺旋藻 Sp (N S) 290020 由中国科学院武汉
植物研究所经济微藻藻种库提供。
1. 2 培养和收集
用 Zarrouk 培养基通气培养, 待藻液的OD 值
(A 560)达 112 左右时, 过滤收集藻丝, 洗涤干净后移
入三角瓶中。
1. 3 细胞破碎
在三角瓶中加适量的直径 015 cm 的玻璃球, 电
磁搅拌器搅拌。搅拌过程中保持低温, 并用超声波处
理破碎细胞。
1. 4 水溶性蛋白的提取
将破碎的细胞悬液在高速冷冻离心机上离心,
弃去沉淀。上清液在 25 000 g 下离心 60 m in, 弃去
沉淀。上清液即为水溶性蛋白溶液。
1. 5 盐析
将上清液加入固体 (N H 4) 2SO 4 使之达到 25%
饱和, 充分搅拌, 10 000 g 冷冻离心 10 m in。弃去离
心管底部沉淀。上清液中继续加入 (N H 4) 2SO 4 使之
达到 55% 饱和, 充分搅拌, 10 000 g 下离心 10 m in,
弃去上清液, 沉淀为藻蓝蛋白 (C2Phycocyan in, PC)
和别藻蓝蛋白 (A llophycocyan in, A PC ) 的混合物。
沉淀用 0101 mo löL 的磷酸缓冲液 ( PBS ) 溶解
(含 0102 mo löL N aC l 及 01001 mo löL ED TA ) , 定
容至一定体积, 加入固体 (N H 4 ) 2SO 4 使达 27% 饱
和, 充分搅拌, 10 000 g 离心 10 m in, 弃去沉淀, 继
续加入 (N H 4) 2SO 4使达 33% 饱和, 10 000 g 下离心
10 m in, 沉淀即为 PC。上清液继续加入 (N H 4) 2SO 4
使达 50% 饱和, 离心 10 m in, 沉淀为A PC。两次沉淀
分别用 0101 mo löL PBS 溶解, 再以 28%～ 32% 和
35%～ 48% 的硫酸铵饱和度沉淀 PC 和A PC。所得
沉淀用少量 0101 mo löL PBS 溶解、透析, 以备层
析。离心时温度保持在 4℃以内。
1. 6 羟基磷石灰层析
按 Siegelm an 的方法[4 ]制备羟基磷石灰 (HA ) ,
层析柱规格为 3 cm ×35 cm , 带筛板。将透析过的
PC 加到 HA 层析柱上, 然后用 01001 mo löL PBS
(含 012 mo löL N aC l) 洗脱, 逐渐增加 PBS 的浓度,
PC 被洗脱下来, 紫外分光光度计检测。分部收集纯
度比 (最大吸收值与普通蛋白质的最大吸收值之
比)大于 415 的部分透析脱盐、浓缩以备进一步纯
化。同样的方法处理A PC, 收集纯度比大于 217 的
部分。
1. 7 凝胶层析
Sephadex G2100 过滤后分部收集纯度比大于
510 的部分, 浓缩、透析、冷冻干燥, 以备电泳。同样
的方法处理A PC。收集浓缩纯度比大于 411 的部
分。
1. 8 SD S-PAGE 电泳
标准分子量为 Pharm acia 公司的产品。采用垂
直板状不连续电泳系统, 分离胶浓度为 1216% , 浓
缩胶浓度为 317% , 恒流 40 mA。
2 结果
2. 1 藻胆蛋白的提取
新鲜藻丝经破碎, 离心, PC 的纯度比为 1120;
A PC 的纯度比为 0133 (表 1)。
表 1 PC、APC 纯化结果
T able 1 D ata of purificat ion of PC and A PC
纯化步骤
P rocedure of purificat ion
PC 纯度比
(A 620öA 280)
A bso rp tion
rat io of PC
A PC 纯度比
(A 650öA 280)
A bso rp tion
rat io of A PC
初提液
Extracts
1. 2
0. 35
(N H 4) 2SO 4 盐析
Salt ing ou t
3. 7
1. 1
HA 层析
Ch rom atographed on HA
4. 8
2. 8
Sephadex 层析
Ch rom atographed on
Sephadex G2100 5. 1 4. 3
2. 2 盐析及 HA 层析
初提液经分段梯度盐析, PC 和A PC 纯度比达
到 3173、111, 对 PC 而言, 这是一个比较理想的结
果。
PC 和A PC 经 HA 层析, 其纯度比分别提高到
418, 317。
2. 3 Sephadex 层析
PC 和A PC 经 Sephadex 层析, 其纯度比分别提
高到 511 和 413。其吸收光谱扫描如图 1、图 2。
从图 1 中可以看出 PC 在 620 nm 处有最大吸
收峰, 图 2 中A PC 在 650 nm 处有最大吸收峰。
003 武 汉 植 物 学 研 究 第 20 卷
图 1 Sephadex G-100 过滤后的 PC 扫描图片
F ig11 A bso rp tion spectra scan of PC after
been p rocessed on Sephadex G2100
图 2 Sephadex G-100 过滤后的APC 扫描图片
F ig12 A bso rp tion spectra scan of A PC after
been p rocessed on Sephadex G2100
2. 4 SD S-PAGE
SD S2PA GE 电泳图谱中 (图 3) , 标准分子量的
谱带 (第 2, 5, 6 列)从上到下依次为: 磷酸化酶 b , 清
蛋白, 卵清蛋白, 碳酸酐酶, 胰蛋白酶抑制因子, Α2乳
清蛋白, 分子量分别为: 1414、2011、30、43、67、
94 kD。电泳显示: PC (第 3, 4 列) 和A PC (第 1, 7, 8
列)各由两个亚基组成。根据待测样品的R f 值计算
出 PC 两个亚基的分子量约为 21 kD 和 17 kD。A PC
两个亚基的分子量约为 17 kD 和 16 kD。
图 3 PC、APC 的 SD S-PAGE 扫描图片
F ig13 SD S2PA GE of purified PC and A PC
3 讨论
3. 1 实验材料的选择及藻胆蛋白的提取
以新鲜材料提取能有效提高水溶性蛋白的得率
(3612% ) , 并且能使 PC 纯度比达到 110 以上, 以藻
粉为原料提取水溶性蛋白的得率只有 2816% , 原因
是鲜藻经喷雾干燥时部分蛋白质会因温度升高而变
性, 而且 PC 提取液的纯度比也只能达到 017 左右。
大规模制备时细胞破碎以机械破碎加超声波破碎效
果较好。
3. 2 盐析
藻胆蛋白的盐析过程中, 文献报道[4 ]采用 30%
(N H 4) 2SO 4沉淀出藻蓝蛋白, 50% (N H 4) 2SO 4 沉淀
出别藻蓝蛋白的比较多。也有报道采用 50%
(N H 4) 2SO 4 一次沉淀 PC 和A PC [5 ] , 但这种分离方
法需要很高的离心速度 (50 000～ 110 000 g ) , 大量
制备难以达到。这些方法一般能将纯度比提高 2 倍
左右。
本实验采用分段梯度盐析法, 即先用 25%
(N H 4) 2SO 4 饱和度沉淀除去杂质, 55% (N H 4) 2SO 4
沉淀 PC 和A PC, 沉淀溶解以后第 2 次和第 3 次盐
析时逐渐收窄沉淀范围, 这样既达到了较高的纯度
比 (3 倍以上) , 又保证了较高的得率, 使盐析后的
PC 只需经过 1 次HA 层析就可以达到一般认可的
纯度标准。文献报道一般要经过 2 次HA 层析, 因
HA 层析在整个分离纯化过程中是最耗时的步骤, 2
次HA 层析会使产品成本太高。本实验探索的经分
段梯度盐析这种相对简单的方法可使纯化步骤简
化, 适合大规模生产要求, 有实用价值。
3. 3 羟基磷灰石层析
采用将 PC 和A PC 分开分别上柱以及 PC 和
A PC 混合上柱 2 种方式, 其分离效果都不错。混合
上柱工作量小, 但由于HA 吸附容量是一定的, 所以
洗脱下来的 PC 和A PC 相对量就要少一些, 而且需
103 第 4 期 胡一兵等: 从一种富含藻胆蛋白的螺旋藻中大量提取和纯化藻蓝蛋白的研究
要的洗脱时间比较长, 容易引起蛋白质变性, 故大规
模的生产制备以分开上柱比较合理。此外, 由于离子
交换层析技术的发展, 采用离子交换层析代替HA
层析, 将使整个分离过程更加简捷高效。
3. 4 藻蓝蛋白溶液的浓缩干燥
用超滤浓缩比传统浓缩方法节省时间, 有利于
提高提取效率。
综上所述, 本实验得到的适用于大规模生产藻
蓝蛋白的工艺流程如下所示。
洗净的鲜藻
机械破碎, 超声波处理
破碎细胞悬液
离心除去不溶杂质
水溶性蛋白混合液
分段梯度盐析
粗
藻胆蛋白
离子交换层析或HA 层析 纯藻蓝蛋白溶液
超滤浓缩, 冷冻干燥
纯藻蓝蛋白 (成品)
参考文献:
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159.
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