全 文 ：植物科学学报　 ２０１６ꎬ ３４(３): ４３０~４３８
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ.ｃｎ
ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１６􀆰 ３０４３０
郭晓荣ꎬ杨新兵ꎬ王怀琴ꎬ明方琳ꎬ佘旭ꎬ曹晓燕. 丹参ｍｉＲ４０８基因前体序列的克隆及表达分析[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１６ꎬ ３４(３): ４３０－４３８
Ｇｕｏ ＸＲꎬ Ｙａｎｇ ＸＢꎬ Ｗａｎｇ ＨＱꎬ Ｍｉｎｇ ＦＬꎬ Ｓｈｅ Ｘꎬ Ｃａｏ ＸＹ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉＲ４０８ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｓａｌｖｉａ
ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１６ꎬ ３４(３): ４３０－４３８
丹参ｍｉＲ４０８基因前体序列的克隆及表达分析
郭晓荣ꎬ 杨新兵ꎬ 王怀琴ꎬ 明方琳ꎬ 佘 旭ꎬ 曹晓燕
(药用资源与天然药物化学教育部重点实验室ꎬ 西北濒危药材资源开发国家工程实验室ꎬ 陕西师范大学ꎬ 西安 ７１００６２)
摘　 要: ＭｉＲ４０８是植物中一类高度保守的 ｍｉＲＮＡꎬ 其靶基因编码含铜蛋白ꎬ ｍｉＲ４０８ 的表达受植物生长发育和
环境条件的显著影响ꎮ 拟南芥中 ｍｉＲ４０８在 ＨＹ５￣ＳＰＬ７基因网络中起着关键作用ꎬ 而 ＨＹ５￣ＳＰＬ７基因网络可介导
拟南芥对光照和铜离子的协调应答ꎬ 进一步表明 ｍｉＲ４０８在植物对环境的响应中发挥了核心作用ꎮ 本研究基于丹
参基因组 Ｓｕｒｖｅｙ数据库ꎬ 从中搜索并克隆得到 ３６６ ｂｐ的含有稳定茎环结构的 ｍｉＲ４０８前体序列及其上游 ７２３ ｂｐ
片段的启动子区ꎬ ＧｅｎＢａｎｋ 登录号分别为 ＫＵ３６０３８４ 和 ＫＵ３６０３８５ꎬ 并将 ｍｉＲ４０８ 的前体序列命名为 Ｓｍ￣
ＭＩＲ４０８ꎮ 生物信息学分析结果显示: Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 上游启动子序列与模式植物拟南芥 Ａｔｈ￣ＭＩＲ４０８、 水稻 Ｏｓａ￣
ＭＩＲ４０８启动子区具有许多相同的顺式作用元件ꎬ 如 Ｇ￣ｂｏｘ、 ＣＧＴＣＡ￣ｍｏｔｉｆ、 ＴＧＡＣＧ￣ｍｏｔｉｆ、 ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆ等ꎬ 而
ＨＳＥ、 ＣＡＴＴ￣ｍｏｔｉｆ作用元件仅存在于丹参启动子区ꎻ ｍｉＲ４０８ 成熟序列在不同物种中具有很高的保守性ꎻ 基于
不同物种 ｍｉＲ４０８ 前体序列构建的系统进化树显示ꎬ 来源于单子叶植物的 ｍｉＲ４０８ 前体序列聚为一支ꎬ 来源于
双子叶植物的 ｍｉＲ４０８ 前体序列聚为另一支ꎮ 实时定量 ＰＣＲ 分析结果显示: Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 在丹参的根、 茎、
叶、 花中都有表达ꎬ 其在花中的表达量最高ꎬ 根中最低ꎻ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 的表达受茉莉酸甲酯和伤害的抑制ꎬ 黑
暗和持续光照也可抑制该基因的表达ꎮ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 基因的克隆与表达分析为今后研究丹参 ｍｉＲ４０８ 的功能奠
定了基础ꎮ
关键词: 丹参ꎻ ｍｉＲ４０８ꎻ 前体序列ꎻ 表达分析
中图分类号: Ｑ７８　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１６)０３￣０４３０￣０９
　 　 　 收稿日期: ２０１６￣０１￣０７ꎬ 退修日期: ２０１６￣０２￣０１ꎮ
　 基金项目: 陕西省自然科学基金项目(２０１４ＪＱ３１０７)ꎻ 中央高校基本科研业务费专项资金项目(ＧＫ２０１３０２０４３)ꎻ 陕西师范大学勤助
科研创新基金项目(ＫＹ２０１５ＺＤ０５)ꎮ
Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｆｕｎｄｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ (２０１４ＪＱ３１０７)ꎬ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｆｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ (ＧＫ２０１３０２０４３)ꎬ ａｎｄ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｏｒｋ￣Ｓｔｕｄｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ￣
ｎｏｖａｔｉｏｎ Ｆｕｎｄ (ＫＹ２０１５ＺＤ０５) .
　 作者简介: 郭晓荣(１９９０－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物次生代谢调控机理(Ｅ￣ｍａｉｌ: ６９４０２３７８８＠ｑｑ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃａｏｘｉａｏｙａｎ＠ｓｎｎｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉＲ４０８ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ
ＧＵＯ Ｘｉａｏ￣Ｒｏｎｇꎬ ＹＡＮＧ Ｘｉｎ￣Ｂｉｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｈｕａｉ￣Ｑｉｎꎬ
ＭＩＮＧ Ｆａｎｇ￣Ｌｉｎꎬ ＳＨＥ Ｘｕꎬ ＣＡＯ Ｘｉａｏ￣Ｙａｎ∗
(Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｃｒｕｄｅ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ ｏｆ Ｃｈｉｎａꎬ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｘｉ’ａｎ ７１００６２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＭｉＲ４０８ ｉｓ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｍｉＲＮＡ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ｃｏｐｐｅｒ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ
ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｏｐｐｅｒ￣ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ
ｂｙ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ. ＭｉＲ４０８ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＹ５￣
ＳＰＬ７ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒꎬ
ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｉｔｓ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓｕｒｖｅｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂꎬ ａ ３６６ ｂｐ ｍｉＲ４０８ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｎａｍｅｄ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８. Ｔｈｅ ７２３ ｂｐ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ. Ｔｈｅ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ
ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｒｅ ＫＵ３６０３８４ ａｎｄ ＫＵ３６０３８５ꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ
ｓａｍｅ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｓ ｔｈｏｓｅ ｏｆ Ａｔｈ￣ＭＩＲ４０８ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ Ｏｓａ￣ＭＩＲ４０８ ｉｎ
Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａꎬ ａｎｄ ｉｎｃｌｕｄｅｄ Ｇ￣ｂｏｘꎬ ＣＧＴＣＡ￣ｍｏｔｉｆꎬ ＴＧＡＣＧ￣ｍｏｔｉｆ ａｎｄ ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆꎬ ｗｈｅｒｅａｓ
ＨＳＥ ａｎｄ ＣＡＴＴ￣ｍｏｔｉｆ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｅｘｉｓｔｅｄ ｏｎｌｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ. Ｍａｔｕｒｅ ｍｉＲ４０８
ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ａ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｍｉＲ４０８ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｍｉＲ４０８ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｍｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｏｎ
ｏｎｅ ｂｒａｎｃｈ ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｆｒｏｍ ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｏｎ ａｎｏｔｈｅｒ. Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓꎬ ｓｔｅｍｓꎬ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｓ.
ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８
ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅꎬ ｗｏｕｎｄｉｎｇꎬ ａｎｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｌｉｇｈｔ ｏｒ ｄａｒｋｎｅｓｓ. Ｔｈｅ
ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈａｓ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ４０８ ｉｎ Ｓ. ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅꎻ ＭｉＲ４０８ꎻ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 植物 ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ(ｍｉＲＮＡｓ)是转录后水平调
控其靶基因表达的一类长度为 ２０ ~ ２４ｎｔ 的小
ＲＮＡ[１]ꎬ 主要来源于基因间隔区或编码蛋白基因
的内含子区ꎬ 具有独立的转录单元ꎮ 植物中 ｍｉＲ￣
ＮＡ基因首先在 ＲＮＡ 聚合酶Ⅱ的作用下转录成几
百个核苷酸的初级转录产物 ｐｒｉ￣ｍｉＲＮＡꎬ 然后进一
步被加工成含有茎环结构的前体 ｍｉＲＮＡ(ｐｒｅ￣ｍｉＲ￣
ＮＡ)ꎬ 最终释放出的ｍｉＲＮＡ整合到 ＲＮＡ诱导的沉
默复合体中发挥负调控功能ꎮ 植物中很多 ｍｉＲＮＡｓ
由基因家族编码ꎬ 成熟的 ｍｉＲＮＡｓ 通常有多个靶
基因ꎬ ｍｉＲＮＡ具有与其靶标基因的 ｍＲＮＡｓ 几乎
完全互补的序列[２ꎬ３] ꎬ ｍｉＲＮＡｓ 识别并结合靶标
ｍＲＮＡꎬ 从而导致其降解[４]或者抑制其翻译过
程[５] ꎮ ｍｉＲＮＡｓ在植物的生长发育及响应非生物
胁迫过程中发挥着重要的调控作用ꎬ 如参与植物
生殖器官发育、 激素信号传导、 叶片与茎的发育
等[６ꎬ７]ꎬ 同时也在营养缺乏、 干旱、 寒冷、 高温等
限制植物生存的环境中起着一定作用[８]ꎮ
ＭｉＲ４０８是由 ２１ 个核苷酸组成的高度保守的
ｍｉＲＮＡ分子ꎬ 在拟南芥中首次发现[９]ꎮ 目前为止ꎬ
来源于 ３８ 个物种的 ４９ 个 ｍｉＲ４０８ 已被提交到
ｍｉＲｂａｓｅ 数据库 ( ２１􀆰０ꎬ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｍｉｒｂａｓｅ.
ｏｒｇ / )ꎮ ＭｉＲ４０８ 的表达受植物生长发育阶段和
环境条件变化的影响 [１０] ꎬ 如 ｍｉＲ４０８ 参与磷酸
盐、 钙离子及金属胁迫的应答ꎻ 植物在失水[１１]、
机械损伤[１２]ꎬ 活性氧胁迫[１３]等条件下也会诱导
ｍｉＲ４０８的表达ꎻ 衰老的拟南芥叶片中 ｍｉＲ４０８ 的
表达量上升[１１]ꎮ 但是ꎬ 不同物种中 ｍｉＲ４０８ 对环
境的响应也是不同的ꎬ 如ꎬ 经干旱胁迫处理后ꎬ 苜
蓿[１４]和大麦[１５]ｍｉＲ４０８ 的表达量上升ꎬ 而桃树[１６]
和水稻[１７] ｍｉＲ４０８ 的表达量下降ꎬ 推测不同物种
ｍｉＲ４０８响应环境变化的机制是不同的ꎮ 研究显
示: ｍｉＲ４０８过表达的拟南芥幼苗的花青素含量是
对照的 ７ ~ ８倍[１８]ꎬ ｍｉＲ４０８ 过表达可提高拟南芥
抗盐、 抗冻和抗氧化能力ꎬ 同时增强对干旱和渗透
压的敏感性[１９]ꎬ 证实 ｍｉＲ４０８ 参与了植物的非生
物胁迫响应及次生代谢调控ꎮ
丹参(Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ Ｂｕｎｇｅ)的根是我国传
统道地药材ꎬ 对于心脑血管疾病具有很好的疗
效[２０]ꎮ 目前有关丹参 ｍｉＲＮＡ 的研究较少ꎬ 仅有
Ｘｕ等[２１]通过小 ＲＮＡ 测序和生物信息学分析鉴定
了丹参不同组织中的 ｍｉＲＮＡꎬ 但 ｍｉＲＮＡ前体序列
(Ｐｒｅ￣ｍｉＲＮＡ) 尚未见报道ꎮ ＭｉＲ４０８作为一个保守
的 ｍｉＲＮＡ在丹参中是否也参与植物的非生物胁迫
响应及次生代谢调控? ＭｉＲ４０８ 在丹参中还有哪些
新的功能? 基于这样的思考ꎬ 本研究利用成熟的
ｍｉＲ４０８序列从丹参基因组 Ｓｕｒｖｅｙ 数据库中搜索
并克隆到 ｍｉＲ４０８ 的前体序列及其上游启动子序
列ꎬ 并对前体序列和启动子区进行生物信息学分
析ꎬ 研究 ｍｉＲ４０８在不同部位及不同诱导条件下的
表达情况ꎬ 以期为进一步开展丹参 ｍｉＲ４０８ 的功能
研究提供一定的参考ꎮ
１３４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 郭晓荣等: 丹参 ｍｉＲ４０８基因前体序列的克隆及表达分析
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
以种植于西北濒危药材资源开发国家工程实验
室温室的一年生盛花期丹参实生苗为材料ꎬ 提取基
因组 ＤＮＡ和总 ＲＮＡꎮ 采收于实验室的丹参种子栽
培于腐殖质土和蛭石(１∶１)中ꎬ 置于温度 ２５℃、 光
照时间为 １６ ｈ 光照 / ８ ｈ 黑暗、 光照强度为 ８０００ ｌｘ
的人工气候箱中ꎬ 培养 ６０ ｄꎮ
１􀆰 ２　 丹参基因组 ＤＮＡ 和总 ＲＮＡ 的提取及 ｃＤＮＡ
的合成
取盛花期丹参的根、 茎、 叶、 花ꎬ 液氮速冻ꎬ
－８０℃储存ꎮ 培养 ６０ ｄ 的丹参植株用 ５００ μｍｏｌ / Ｌ
茉莉酸甲酯(ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅꎬ ＭｅＪＡ)喷洒于表
面ꎬ 处理 １、 ２、 ６、 ８、 ２４ ｈ 后取全株样品ꎻ 用止
血钳对 ６０ ｄ的丹参叶片进行伤害ꎬ 每片叶子造成
约 ５０％的机械损伤ꎬ 分别于伤害处理后的 ０􀆰５、 １、
１２、 ４８ ｈ后取全株样品ꎻ 培养 ６０ ｄ 的丹参实生植
株黑暗处理 ２ ｄ 后持续正常光照ꎬ ０、 ２、 ４、 ６、
８、 １０、 １２、 ２４、 ４８、 ７２、 ９６ ｈ 后取全株样品ꎬ
液氮速冻ꎬ －８０℃储存ꎮ 以上植物材料使用 ＲＮＡ
提取试剂盒(ＯＭＥＧＡ)进行 ＲＮＡ 提取ꎬ 随后采用
反转录试剂盒(ＴａＫａＲａ)合成 ｃＤＮＡꎮ 采用 ＤＮＡ提
取试剂盒(ＯＭＥＧＡ)提取丹参总 ＤＮＡꎮ
１􀆰 ３　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８基因以及启动子区的克隆
根据实验室已构建的丹参基因组 Ｓｕｒｖｅｙ 测序
结果ꎬ 利用成熟ｍｉＲ４０８序列从丹参基因组 Ｓｕｒｖｅｙ
数据库中搜索到 ｍｉＲ４０８基因前体序列ꎬ 根据前体
序列设计引物(ＭＩＲ４０８￣Ｆ 和 ＭＩＲ４０８￣Ｒ)对其进行
扩增(表 １)ꎬ 反应程序为 ９４℃预变性 ３ ｍｉｎꎻ ９４℃
变性 ３０ ｓꎬ ５８℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸 ４０ ｓꎬ ３１个
循环ꎻ ７２℃复性 １０ ｍｉｎꎮ 根据丹参ｍｉＲ４０８基因前
体序列上游 ８００ ｂｐ 的片段设计引物(Ｐ￣ＭＩＲ４０８￣Ｆ
和 Ｐ￣ＭＩＲ４０８￣Ｒꎬ 见表 １)克隆其启动子区ꎮ
１􀆰 ４　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８基因的生物信息学分析
利用小 ＲＮＡ 数据库 ｍｉＲｂａｓｅ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
ｍｉｒｂａｓｅ.ｏｒｇ / )下载拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)、
水稻(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)、 烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ)、
大豆(Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ)等植物 ｍｉＲ４０８ 的前体序列及
成熟序列ꎮ 使用 ＭＥＧＡ ５􀆰２软件构建 ＭＩＲ４０８前体
序列的系统进化树ꎬ 通过 ＲＮＡｆｏｌｄ Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ
(ｈｔｔｐ: / / ｒｎａ.ｔｂｉ.ｕｎｉｖｉｅ.ａｃ.ａｔ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ＲＮＡｆｏｌｄ.ｃｇｉ)
表 １　 引物序列
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物 Ｐｒｉｍｅｒ 序列 Ｏｌｉｇｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′ ｔｏ ３′
ＭＩＲ４０８￣Ｆ ＡＣＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＧ
ＭＩＲ４０８￣Ｒ ＧＴＣＣＣＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＡＣＡＣＡＧＴＡＡ
Ｐ￣ＭＩＲ４０８￣Ｆ ＡＣＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＧＴ
Ｐ￣ＭＩＲ４０８￣Ｒ ＴＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴ
ＲＴ￣ＭＩＲ４０８￣Ｆ ＡＣＧＧＧＧＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＡＴ
ＲＴ￣ＭＩＲ４０８￣Ｒ ＧＧＣＴＴＴＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＡＧ
Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣Ｆ ＡＣＣＣＴＣＡＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣ
Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ￣Ｒ ＡＣＣＡＣＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧ
在线工具预测丹参 ＭＩＲ４０８二级结构ꎬ 用Ｗｅｂｌｏｇｏ
(ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂｌｏｇｏ.ｂｅｒｋｅｌｅｙ.ｅｄｕ / ｌｏｇｏ.ｃｇｉ)在线工
具分析 ｍｉＲ４０８ 成熟序列的碱基保守性ꎮ 从 ＮＣＢＩ
下载水稻和拟南芥 ＭＩＲ４０８ 前体序列上游 ７３０ ｂｐ
的启动子区序列ꎬ 利用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 分析丹参、 拟
南芥和水稻 ＭＩＲ４０８基因启动子区的顺式作用元件
(ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ / ｐｌａ￣
ｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ)ꎬ 预测丹参 ＭＩＲ４０８ 转录起始位点
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｆｒｕｉｔｆｌｙ.ｏｒｇ / ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ / ｐｒｏｍｏｔｅｒ.ｈｔｍ)ꎮ
１􀆰 ５　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８的表达模式分析
分别以丹参根、 茎、 叶、 花不同组织以及经过
处理后的整株丹参 ｃＤＮＡ为模板ꎬ 以丹参持家基因
Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ (ＧｅｎＢａｎｋ 号: ＪＦ７６０２０６􀆰１)为内参[２２]ꎬ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 的相对表达量(引物见
表 １)ꎮ 反应程序为: ９５℃变性 １０ ｓꎬ ６０℃退火
３０ ｓꎬ ４５个循环ꎬ 每个样品重复 ３ 次ꎮ 采用“相对
定量”法分析数据ꎬ 其中荧光定量的引物扩增效率
为 １００％ꎬ 利用每 ３ 个重复样品的 Ｒａｔｉｏ 值的标准
差添加误差线ꎬ 并用 ＳＰＳＳ １７􀆰０ 软件分析基因表
达的显著性差异ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８基因的克隆及二级结构预测
以丹参总 ＤＮＡ为模板ꎬ 扩增获得长度为 ３６６ ｂｐ
含有茎环结构的 Ｓｍ￣ｍｉＲ４０８ 前体序列ꎮ 利用
ＲＮＡｆｏｌｄｅｒ对丹参 ｍｉＲ４０８ 前体序列的二级结构进
行分析ꎬ 发现其能形成稳定的茎环结构ꎬ 所预测的
二级结构的最小折叠自由能为 －７５􀆰００ ｋｃａｌ / ｍｏｌꎬ
ｍｉＲ４０８ / ｍｉＲ４０８∗双链结构区分别位于茎环结构的
两臂ꎬ ｍｉＲ４０８成熟序列(５′￣ＡＵＧＣＡＣＵＧＣＣＵＣＵ￣
２３４ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
ＵＣＣＣＵＧＧＣ￣３′)位于茎环结构 ３′端(图 １箭头所指
位置)ꎬ 与ｍｉＲｂａｓｅ 数据库中其他植物 ｍｉＲ４０８ 成
熟序列的位置相似ꎮ
２􀆰 ２　 Ｓｍ￣ｍｉＲ４０８基因序列分析
对丹参ｍｉＲ４０８和 ｍｉＲｂａｓｅ 数据库中所有植物
ｍｉＲ４０８成熟序列碱基保守性分析结果显示(图 ２)ꎬ
ｍｉＲ４０８家族具有很高的保守性ꎬ 第 ９、 １３、 １５、
１６、 １９位上的碱基保守性最高ꎬ 且丹参 ｍｉＲ４０８的
成熟序列 ( ５′￣ＡＵＧＣＡＣＵＧＣＣＵＣＵＵＣＣＣＵＧＧＣ￣
３′)与其他 ｍｉＲ４０８ 家族成员的大部分序列保持一
致ꎬ 说明 ｍｉＲ４０８家族在进化过程中比较保守ꎮ
ＭＥＧＡ５􀆰２软件构建的 ｍｉＲ４０８前体序列的系统
进化树显示(图 ３)ꎬ 不同物种聚为两大分支ꎬ 来源
于单子叶植物的 ＭＩＲ４０８聚为一支ꎬ 来源于双子叶
植物的 ＭＩＲ４０８ 聚为另一支ꎮ 丹参 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 与
烟草、 马铃薯(Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ)、 刺苞菜蓟
(Ｃｙｎａｒａ ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ )、 紫花洋地黄 ( Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ
ｐｕｒｐｕｒｅａ)等物种中的 ＭＩＲ４０８ 在双子叶植物大分
支内聚为一个小分支ꎬ 显示其亲缘关系最近、 同源
性较高ꎮ
２􀆰 ３　 启动子区的克隆及分析
参照丹参基因组 Ｓｕｒｖｅｙ 数据库ꎬ 以丹参总
ＤＮＡ为模板ꎬ 设计引物 Ｐ￣ＭＩＲ４０８￣Ｆ和 Ｐ￣ＭＩＲ４０８￣
Ｒꎬ 克隆得到长度 ７２３ ｂｐ的 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８的启动子
区ꎮ 通过在线平台(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｆｒｕｉｔｆｌｙ.ｏｒｇ / ｓｅｑ＿
ｔｏｏｌｓ / ｐｒｏｍｏｔｅｒ.ｈｔｍ)预测转录起始位点( ｔｒａｎｓｃｒｉｐ￣
ｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅꎬ ＴＩＳ)位于启动子区 ６５１ ｂｐ 处ꎬ
标记为“＋１”ꎻ 利用 Ｐｌａｎｔｃａｒｅ 对启动子区进行分
析ꎬ 结果显示(图 ４): ＴＩＳ上游存在多个启动子基
本元件 ＴＡＴＡ￣ｂｏｘ和 ＣＡＡＴ￣ｂｏｘꎬ 转录起始位点上
游 ２２ ｂｐ处存在一个 ＴＡＴＡ￣ｂｏｘꎬ 符合真核生物的
特点ꎮ 同时启动子区还有多个其他顺式作用元件ꎬ
包括光应答元件 ＢｏｘⅠ、 Ｇ￣ｂｏｘ、 Ｃ￣ｂｏｘ 和 ＣＡＴＴ￣
ｍｏｔｉｆꎬ 茉莉酸甲酯应答元件 ＣＧＴＣＡ￣ｍｏｔｉｆ 和
ＴＧＡＣＧ￣ｍｏｔｉｆꎬ 乙烯应答元件 ＥＲＥꎬ 高温应答元件
ＨＳＥꎬ 防御与胁迫应答元件 ＴＣ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔｓꎬ 并含
有 ７ 个铜离子响应元件 ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆꎮ 推测 Ｓｍ￣
ＭＩＲ４０８基因的表达受到茉莉酸甲酯、 伤害、 光
照、 高温等胁迫处理的诱导ꎮ
将 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 启动子区与模式植物拟南芥
Ａｔｈ￣ＭＩＲ４０８和水稻 Ｏｓａ￣ＭＩＲ４０８启动子区 ７３０ ｂｐ
的序列进行比较(表 ２)ꎬ 发现它们的 ＭＩＲ４０８ 启动
子具有很多相同的顺式作用元件ꎬ 如 Ｇ￣ｂｏｘ、
ＣＡＡＴ￣ｂｏｘ、 ＴＡＴＡ￣ｂｏｘ、 ＣＧＴＣＡ￣ｍｏｔｉｆ、 ＴＧＡＣＧ￣
ｍｏｔｉｆ、 ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆ 等ꎬ 表明 ｍｉＲ４０８ 在功能上具
有很强的保守性ꎻ 而 ＨＳＥ、 ＣＡＴＴ￣ｍｏｔｉｆ 作用元件
仅存在于丹参启动子区ꎬ 推测 ｍｉＲ４０８在不同的物
种中可能具有不同的功能ꎮ
5′
3′
图 １　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８前体二级结构预测
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
5′ 3′
2
0
Bi
ts 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
图 ２　 ｍｉＲ４０８成熟序列碱基保守性分析
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉＲ４０８
３３４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 郭晓荣等: 丹参 ｍｉＲ４０８基因前体序列的克隆及表达分析
ptc-MIR408 Populus trichocarpa( )
vvi-MIR408 Vitis vinifera( )
rco MIR408 Ricinus communis- ( )
mes-MIR408 Manihot esculenta( )
csi-MIR408 Citrus sinensis( )
cpa-MIR408 Carica papaya( )
mdm MIR408a Malus domestica- ( )
mtr-MIR408 Medicago truncatula( )
ath-MIR40 Arabidopsis thaliana8 ( )
aly-MIR408 Arabidopsis lyrata( )
ahy-MIR408 Arachis hypogaea( )
lus-MIR408a Linum usitatissimum( )
aqc-MIR408 Aquilegia caerulea( )
dpr-MIR40 Digitalis purpurea8 ( )
cca-MIR408 Cynara cardunculus( )
sm-MIR408 Salvia miltiorrhiza *( )
nta-MIR408 Nicotiana tabacum( )
stu-MIR408a Solanum tuberosum( )
stu-MIR408b Solanum tuberosum( )
cme-MIR408 Cucumis melo( )
gma-MIR408d Glycine max( )
gma-MIR408b Glycine max( )
vun-MIR408 Vigna unguiculata( )
gma-MIR408a Glycine max( )
gma-MIR408c Glycine max( )
osa-MIR408 Oryza sativa( )
bdi-MIR408 Brachypodium distachyon( )
tae-MIR408 Triticum aestivum( )
zma-MIR408b Zea mays( )
zma-MIR408a Zea mays( )
sbi-MIR408 Sorghum bicolor( )
sof-MIR408d Saccharum officinarum( )
ssp-MIR408d Saccharum sp.( )
ssp-MIR408a Saccharum sp.( )
sof-MIR408e Saccharum officinarum( )
sof-MIR408a Saccharum officinarum( )
sof-MIR408b Saccharum officinarum( )
sof-MIR408c Saccharum officinarum( )
99
99
99
99
97
89
88
94
73
71
63
62
99
56
99
98
83
65
81
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图 ３　 基于 ｍｉＲ４０８基因前体序列构建的系统进化树
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｍｉＲ４０８ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ
４３４ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
转录起始位点标记为“＋１ ＴＩＳ”ꎬ 顺式作用元件用阴影、 下划线表示ꎮ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｓ ｍａｒｋｅｄ ａｓ ＋１ ＴＩＳ ａｎｄ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ａｒｅ ｓｈａｄｏｗｅｄꎬ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
图 ４　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８基因上游启动子区序列分析
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８
２􀆰 ４　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８表达模式分析
实时定量 ＰＣＲ分析结果显示ꎬ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 在
丹参的根、 茎、 叶ꎬ 花中均有表达(图 ５: Ａ)ꎬ 且
不同组织中的表达量不同ꎬ 花中的表达量最高ꎬ 其
次是叶ꎬ 最后是茎和根ꎮ
用 ５００ μｍｏｌ / Ｌ 茉莉酸甲酯(ｍｅｔｈｙｌ ｊａｓｍｏｎａｔｅ
ＭｅＪＡ)处理丹参植株ꎬ 可抑制 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 的表
达ꎮ 处理 １ ｈ后表达量开始降低ꎬ 在 ８ ｈ时达到最
低值ꎬ 其表达量仅为对照的 １０％ꎬ 随后升高ꎬ
２４ ｈ 后其表达量与对照没有显著差异(图 ５: Ｂ)ꎮ
机械损伤处理可抑制 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 的表达ꎬ 处理
１ ｈ 时 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 表达量降低ꎬ 为对照的 ４０％ꎬ
随后逐渐升高ꎬ ４８ ｈ 后恢复到正常水平 (图 ５:
Ｃ)ꎮ 暗处理 ２ ｄ 后ꎬ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 的表达量降低为
对照的 １８％ꎬ 随着光照的恢复ꎬ 其表达量逐渐升
高ꎬ １２ ｈ恢复到与对照(ＣＫ)相近水平ꎬ 随着光照
时间的持续延长ꎬ 其表达量又显著下调(图 ５: Ｄ)ꎮ
３　 讨论
ＭｉＲ４０８是陆生植物中一类高度保守的小 ＲＮＡ
分子ꎬ 其表达受到多种生长及环境因素的影响ꎮ 研
究表明ꎬ ｍｉＲ４０８在植物体内的功能主要包括参与
非生物胁迫应答和维持铜离子的稳定ꎮ 虽然目前对
ｍｉＲ４０８的研究较少ꎬ 但对其靶基因的认识基本一
致ꎬ ｍｉＲ４０８的靶基因包括铜离子结合蛋白(蛋白
质间的电子传递链)、 漆酶及含铜蛋白(参与木质素
５３４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 郭晓荣等: 丹参 ｍｉＲ４０８基因前体序列的克隆及表达分析
表 ２　 ＭＩＲ４０８启动子区顺时作用元件比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ＭＩＲ４０８
顺时作用原件
ｃｉｓ￣ａｃｔｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ
功能
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
丹参
Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ
拟南芥
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
水稻
Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ
５ＵＴＲＰｙ￣ｒｉｃｈ ｓｔｒｅｔｃｈ 高转录水平元件 ＋
３￣ＡＦ３ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ 保守 ＤＮＡ一部分 ＋
ＡＢＲＥ 脱落酸应答元件 ＋
ＭＢＳ 干旱诱导中 ＭＹＢ结合位点 ＋
ＨＳＥ 高温应答元件 ＋
ＬＴＲ 低温应答元件 ＋
ＡＲＥ 厌氧诱导应答元件 ＋ ＋
ＥＩＲＥ 诱导子应答元件 ＋
ＢｏｘⅡ 部分光应答元件 ＋
ＢｏｘⅠ 光应答元件 ＋ ＋ ＋
ＥＲＥ 乙烯应答元件 ＋
Ｇ￣Ｂｏｘ 光应答元件 ＋
Ｇ￣ｂｏｘ 光应答元件 ＋ ＋ ＋
Ｃ￣ｂｏｘ 光应答元件 ＋
ＡＥ￣ｂｏｘ 部分光应答元件 ＋
Ｐ￣ｂｏｘ 赤霉素应答元件 ＋
Ｇａｐ￣ｂｏｘ 部分光应答元件 ＋
ＣＡＡＴ￣ｂｏｘ 启动子和增强子元件 ＋ ＋ ＋
ＧＡ￣ｍｏｔｉｆ 部分光应答元件 ＋
ＧＡＴＡ￣ｍｏｔｉｆ 部分光应答元件 ＋
ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆ 铜应答元件的核心 ＋ ＋ ＋
ＧＡＧ￣ｍｏｔｉｆ 部分光应答元件 ＋
ＣＡＴＴ￣ｍｏｔｉｆ 部分光应答元件 ＋
ＣＧＴＣＡ￣ｍｏｔｉｆ 茉莉酸甲酯应答元件 ＋ ＋ ＋
ＴＧＡＣＧ￣ｍｏｔｉｆ 茉莉酸甲酯应答元件 ＋ ＋ ＋
Ｓｋｎ￣１￣ｍｏｔｉｆ 胚乳表达所需元件 ＋ ＋
ＴＡＴＡ￣ｂｏｘ 核心启动子区 ＋ ＋ ＋
ＴＣＡ￣ｅｌｅｍｅｎｔ 水杨酸应答元件 ＋
ＴＣ￣ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔｓ 防御与胁迫应答元件 ＋ ＋
ｃｉｒｃａｄｉａｎ 昼夜节律控制元件 ＋ ＋ ＋
ｂｏｘⅡ 部分光应答元件 ＋
氧化聚合) [２３]ꎮ 水稻中除了有铜离子结合蛋白和含
铜蛋白保守性靶基因外ꎬ 还新发现了一个非保守性
靶基因 ＶＩＮ１(液泡转化酶)ꎮ 在拟南芥中ꎬ 当铜离
子缺乏时 ꎬ 转录因子 ＳＰＬ７会与 ＭＩＲ４０８启动子区
的多个 ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆｓ 结合ꎬ 诱导 ｍｉＲ４０８ 的表
达[１０]ꎮ 最近的研究表明ꎬ 拟南芥 ｍｉＲ４０８ 在 ＨＹ５￣
ＳＰＬ７基因网络中起着关键作用ꎬ 而 ＨＹ５￣ＳＰＬ７ 基
因网络可介导拟南芥对光照和铜离子的协调应
答[２４]ꎬ 表明 ｍｉＲ４０８ 在植物应对环境变化的响应
中所发挥了核心作用ꎮ 从丹参 ＭＩＲ４０８ 启动子序列
的分析发现ꎬ 该启动子区含有 ７ 个铜响应元件
ＧＴＡＣ￣ｍｏｔｉｆｓꎬ 并含有与 ＨＹ５结合的 Ｇ￣ｂｏｘꎬ 推测
丹参 ｍｉＲ４０８具有和拟南芥 ｍｉＲ４０８ 相似的调控网
络ꎮ
研究发现ꎬ ｍｉＲ４０８ 过表达可提高拟南芥抗
盐、 抗冻和抗氧化能力ꎬ 同时增强应对干旱环境和
渗透压变化的敏感性[１８]ꎬ 其在植物非生物胁迫响
应中具有重要功能ꎮ 本实验以药用植物丹参为材
料ꎬ 克隆获得长度为 ３６６ ｂｐ 的 ＭＩＲ４０８ 前体序列
和 ７２３ ｂｐ的启动子区ꎮ 该启动子区含有高温、 茉
莉酸甲酯和机械损伤等响应元件ꎻ 实时定量 ＰＣＲ
结果显示ꎬ 机械损伤及茉莉酸甲酯均可抑制丹参
Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８ 的表达ꎬ 推测丹参 ｍｉＲ４０８ 参与了逆
境胁迫下的应答及调控ꎮ
６３４ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
CK 1 h 2 h 6 h 8 h 24 h
a
b
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c
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BA
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
CK 0.5 h 1 h 12 h 48 h
a
a
a
c
b
C D
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
CK 0h 2h 4h 6h 8h 10h 12h 24h 48h 72h 96h
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e
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b
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Ａ: 不同组织ꎻ Ｂ: ５００ μｍｏｌ / Ｌ茉莉酸甲酯ꎻ Ｃ: 机械损伤ꎻ Ｄ: 光照ꎮ 不同小写字母表示基因相对表达量在 Ｐ < ０􀆰０５水平上差异显
著ꎮ
Ａ: Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓꎻ Ｂ: ５００ μｍｏｌ / Ｌ ＭｅＪＡꎻ Ｃ: Ｗｏｕｎｄｉｎｇꎻ Ｄ: Ｌｉｇｈｔ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｏｒｍａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ
ａｍｏｎｇ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｔ ｔｈｅ Ｐ < ０􀆰０５ ｌｅｖｅｌ.
图 ５　 Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８表达分析
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ Ｓｍ￣ＭＩＲ４０８
　 　 ＭｉＲＮＡｓ不仅在植物的生长发育及响应非生物
胁迫过程中发挥着重要的作用ꎬ 它还参与植物的次
生代谢调控ꎮ 如 ｍｉＲ１５６ 的靶标 ＳＰＬ９(Ｓｑｕａｍｏｓａ
ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ￣ｌｉｋｅ９)是花青素生物合
成途径中的负调控因子ꎬ 当 ｍｉＲ１５６ 活性增强时
可促进花青素的积累ꎬ 而活性降低时则会促进类
黄酮的积累[２５]ꎻ ｍｉＲ１６３ 活性降低时会导致甲基
法尼酯(ｍｅｔｈｙｌ ｆａｒｎｅｓｏａｔｅ)的积累[２６]ꎻ Ｘｕ 等[２１]
预测丹参 ｍｉＲ５０７２通过靶标乙酰 ＣｏＡ 酰基转移酶
(ａｃｅｔｙｌ￣ＣｏＡ Ｃ￣ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)调控丹参酮的合
成ꎮ 研究发现ꎬ ｍｉＲ４０８过表达拟南芥幼苗的花青
素含量是对照的 ７ ~ ８ 倍[１７]ꎬ 但其调控机制未知ꎮ
一般认为ꎬ 植物在逆境环境下会积累更多的次生代
谢物ꎬ 当植物受到胁迫时ꎬ 其体内会发生包括次生
代谢产物含量在内的许多变化ꎬ ｍｉＲ４０８ 可能参与
了这一过程的调控ꎬ 而丹参 ｍｉＲ４０８是否也参与其
应对非生物胁迫的响应以及次生代谢调控还有待进
一步研究ꎮ 基于已知丹参 ＭＩＲ４０８ 的前体序列ꎬ 本
课题组已成功构建其 ｍｉＲ４０８过表达载体和干涉载
体ꎬ 为深入开展 ｍｉＲ４０８在丹参中的功能研究奠定
了基础ꎮ
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７３４　 第 ３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 郭晓荣等: 丹参 ｍｉＲ４０８基因前体序列的克隆及表达分析
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ＮＡｓ ｕｐｏｎ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｓｔｒｅｓｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ] . Ｆｕｎｃｔ Ｉｎｔｅｇｒ Ｇｅｎｏｍꎬ ２０１０ꎬ １０(４): ４９３－
５０７.
[１２] 　 Ｌｕ Ｓꎬ Ｓｕｎ ＹＨꎬ Ｓｈｉ Ｒꎬ Ｃｌａｒｋ Ｃꎬ Ｌｉ Ｌꎬ Ｃｈｉａｎｇ ＶＬ. Ｎｏｖｅｌ
ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｐｏｐｕｌｕｓ
ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｂｓｅｎｔ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌꎬ ２００５ꎬ １７(８): ２１８６－２２０３.
[１３] 　 Ｌｉ Ｔꎬ Ｌｉ Ｈꎬ Ｚｈａｎｇ ＹＸꎬ Ｌｉｕ ＪＹ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｓｅｖｅｎ Ｈ２Ｏ２ ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ３２ ｎｅｗ ｍｉＲＮＡｓ ｉｎ
ｔｈｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ ｒｉｃｅ(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ. ｓｓｐ. ｉｎｄｉｃａ)[Ｊ] . Ｎｕ￣
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓꎬ ２０１１ꎬ ３９(７): ２８２１－２８３３.
[１４] 　 Ｔｒｉｎｄａｄｅ Ｉꎬ Ｃａｐｉｔãｏ Ｃꎬ Ｄａｌｍａｙ Ｔꎬ Ｆｅｖｅｒｅｉｒｏ ＭＰꎬ Ｓａｎｔｏｓ
ＤＭ. ｍｉＲ３９８ ａｎｄ ｍｉＲ４０８ ａｒｅ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ｗａｔｅｒ ｄｅｆｉｃｉｔ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ ２０１０ꎬ
２３１(３): ７０５－７１６.
[１５] 　 Ｋａｎｔａｒ Ｍꎬ Ｕｎｖｅｒ Ｔꎬ Ｂｕｄａｋ Ｈ. Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ ｍｉＲ￣
ＮＡｓ ｕｐｏｎ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎｓｔｒｅｓｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ] . Ｆｕｎｃｔ Ｉｎｔｅｇｒ Ｇｅｎｏｍꎬ ２０１０ꎬ １０(４): ４９３－
５０７.
[１６] 　 Ｅｌｄｅｍ Ｖꎬ Ａｋçａｙ ＵÇꎬ Ｏｚｈｕｎｅｒ Ｅꎬ Ｂａｋıｒ Ｙꎬ Ｕｒａｎｂｅｙ Ｓꎬ
Ｕｎｖｅｒ Ｔ. Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ｔｏ ｄｒｏｕｇｈｔ ｉｎ ｐｅａｃｈ(Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ) ｂｙ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ[Ｊ] . ＰｌｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１２ꎬ ７: ｅ５０２９８.
[１７] 　 Ｚｈｏｕ Ｌꎬ Ｌｉｕ Ｙꎬ Ｌｉｕ Ｚꎬ Ｋｏｎｇ Ｄꎬ Ｄｕａｎ Ｍꎬ Ｌｕｏ Ｌ. Ｇｅｎｏｍｅ￣
ｗｉｄｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｒｏｕｇｈｔ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉ￣
ｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ[ Ｊ] . Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２０１０ꎬ ６１(１５):
４１５７－４１６８.
[１８] 　 Ｚｈａｎｇ Ｈꎬ Ｈｅ Ｈꎬ Ｗａｎｇ Ｘꎬ Ｗａｎｇ Ｘꎬ Ｙａｎｇ Ｘꎬ Ｌｉ Ｌꎬ Ｄｅｎｇ
ＸＷ. Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＨＹ５￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ
ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｔ ｉｎｖｏｌｖｅ ｂｏｔｈ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
ａｎｄ ｐｏｓｔ￣ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２０１１ꎬ ６５:
３４６－３５８.
[１９] 　 Ｍａ Ｃꎬ Ｂｕｒｄ Ｓꎬ Ｌｅｒｓ Ａ. ｍｉＲ４０８ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ ２０１５ꎬ ８４: １６９ －
１８７.
[２０] 　 化文平ꎬ 宋双红ꎬ 智媛ꎬ 王喆之. 丹参 ＳｍＧＧＰＰＳ３基因的
克隆及表达分析[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１４ꎬ ３２(１): ５０－
５７.
Ｈｕａ ＷＰꎬ Ｓｏｎｇ ＳＨꎬ Ｚｈｉ Ｙꎬ Ｗａｎｇ ＺＺ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＳｍＧＧＰＰＳ３ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉ￣
ｚａ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１４ꎬ ３２(１): ５０－５７.
[２１] 　 Ｘｕ Ｘꎬ Ｊｉａｎｇ Ｑꎬ Ｍａ Ｘꎬ Ｙｉｎｇ Ｑꎬ Ｓｈｅｎ Ｂꎬ Ｑｉａｎ Ｙꎬ Ｓｏｎｇ Ｈꎬ
Ｗａｎｇ Ｈ. Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｉ￣
ｃｒｏＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅ￣
ｓｉｓ ｏｆ ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅｓ ｉｎ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ [ Ｊ ] . ＰｌｏＳ Ｏｎｅꎬ
２０１４ꎬ ９: ｅ１１１６７９.
[２２] 　 张媛. ＭｅＪＡ和 ＰＡＰ１转录因子对丹参酚酸类成分积累的影
响[Ｄ] . 陕西: 陕西师范大学ꎬ ２０１１: ６６.
Ｚｈａｎｇ Ｙ. Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＰＡＰ１ ａｎｄ ＭｅＪＡ ｈａｖｅ ａｎ
ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒ￣
ｒｈｉｚａ[Ｄ] . Ｓｈａａｎｘｉ: Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ２０１１: ６６.
[２３] 　 Ｓｃｈｕｅｔｚ Ｍꎬ Ｂｅｎｓｋｅ Ａꎬ Ｓｍｉｔｈ ＲＡꎬ Ｗａｔａｎａｂｅ Ｙꎬ Ｔｏｂｉｍａｔ￣
ｓｕ Ｙꎬ Ｒａｌｐｈ Ｊꎬ Ｄｅｍｕｒａ Ｔꎬ Ｅｌｌｉｓ Ｂꎬ Ｓａｍｕｅｌｓ ＡＬ. Ｌａｃｃａｓｅｓ
ｄｉｒｅｃｔ ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｄｏ￣
ｍａｉｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｏｘｙｌｅｍ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１４ꎬ １６６: ７９８－
８０７.
[２４] 　 Ｚｈａｎｇ ＨＹꎬ Ｚｈａｏ Ｘꎬ Ｌｉ ＪＧ.ꎬ Ｃａｉ ＨＱꎬ Ｄｅｎｇ ＸＷꎬ Ｌｉ Ｌ. Ｍｉ￣
ｃｒｏＲＮＡ４０８ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ＨＹ５￣ＳＰＬ７ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｔｈａｔ
ｍｅｄｉａｔｅｓｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ[Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２０１４ꎬ ２６: ４９３３－４９５３.
[２５] 　 Ｇｏｕ ＪＹꎬ Ｆｅｌｉｐｐｅｓ ＦＦꎬ Ｌｉｕ ＣＪꎬ Ｗｅｉｇｅｌ Ｄꎬ Ｗａｎｇ ＪＷ. Ｎｅｇａ￣
ｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｂｙ ａ ｍｉＲ１５６￣ｔａｒｇｅｔｅｄ ＳＰＬ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌꎬ ２０１１ꎬ ２３: １５１２－１５２２.
[２６] 　 Ｎｇ ＤＷꎬ Ｚｈａｎｇ Ｃꎬ Ｍｉｌｌｅｒ Ｍꎬ Ｐａｌｍｅｒ Ｇꎬ Ｗｈｉｔｅｌｅｙ Ｍꎬ Ｔｈｏｌｌ
Ｄꎬ Ｃｈｅｎ ＺＪ. ｃｉｓ￣ａｎｄ ｔｒａｎｓ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ１６３ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ
ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｆｅｒｓ ｎａｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｉｎ
ｔｗｏ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｌｌｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌꎬ ２０１１ꎬ ２３: １７２９－１７４０.
(责任编辑: 周 媛)
８３４ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷