全 文 ：植物科学学报 ２０１６ꎬ ３４(１): ９９~１０８
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ.ｃｎ
ＤＯＩ:１０ １１９１３ / ＰＳＪ ２０９５￣０８３７ ２０１６ １００９９
董超ꎬ 杨云强ꎬ 孙旭东ꎬ 李雄ꎬ 杨时海ꎬ 黄蓉ꎬ 杨永平. 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆及对非生物胁迫的应答[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１６ꎬ ３４
(１): ９９－１０８
Ｄｏｎｇ Ｃꎬ Ｙａｎｇ ＹＱꎬ Ｓｕｎ ＸＤꎬ Ｌｉ Ｘꎬ Ｙａｎｇ ＳＨꎬ Ｈｕａｎｇ Ｒꎬ Ｙａｎｇ ＹＰ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｉｎ Ｓｔｉｐａ ｃａｐｉｌｌａｃｅａ ｕｎｄｅｒ
ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１６ꎬ ３４(１): ９９－１０８
丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆及对非生物胁迫的应答
董 超１ꎬ２ꎬ３ꎬ 杨云强１ꎬ２ꎬ 孙旭东１ꎬ２ꎬ 李 雄１ꎬ２ꎬ 杨时海１ꎬ４ꎬ 黄 蓉１ꎬ２ꎬ 杨永平１ꎬ２∗
(１. 中国科学院昆明植物研究所东亚植物多样性与生物地理学重点实验室ꎬ 昆明 ６５０２０１ꎻ ２. 中国科学院昆明植物研究所西南
野生生物种质资源库ꎬ 昆明 ６５０２０１ꎻ ３. 中国科学院大学ꎬ 北京 １０００４９ꎻ ４. 中国科学院青藏高原研究所ꎬ 北京 １００１０１)
摘 要: 利用丝颖针茅(Ｓｔｉｐａ ｃａｐｉｌｌａｃｅａ Ｋｅｎｇ)一条 ＥＳＴ序列并结合 ｃＤＮＡ末端快速扩增(ＲＡＣＥ)技术ꎬ 克隆了
丝颖针茅的一个液泡膜内在蛋白( ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＴＩＰｓ)基因 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 的全长编码区序列ꎮ 该基因
开放阅读框长度为 ７５３ ｂｐꎬ 编码 ２５０个氨基酸ꎬ 其蛋白质分子量为 ２５８ ｋＤꎬ 理论等电点为 ６１６ꎻ 序列比对及
系统进化分析表明ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１和拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)ＡｔＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白的亲缘关系较近ꎻ 亚细胞定位结果
显示ꎬ 该蛋白位于液泡膜上ꎻ 实时荧光 ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测表明ꎬ 盐、 干旱及低温胁迫可诱导 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因的表达ꎬ
且低温处理后基因的表达量变化最为明显ꎮ 本研究结果为理解丝颖针茅的生态适应性提供了理论依据ꎮ
关键词: 丝颖针茅ꎻ 液泡膜内在蛋白ꎻ 分子克隆ꎻ 基因表达ꎻ 非生物胁迫
中图分类号: Ｑ７８ 文献标识码: Ａ 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１６)０１￣００９９￣１０
收稿日期: ２０１５￣０９￣０２ꎬ 退修日期: ２０１５￣１０￣０２ꎮ
基金项目: 国家自然科学基金项目(４１２７１０５８)ꎻ 国家重点基础研究发展计划(２０１０ＣＢ９５１７０４)ꎻ 中国科学院寒旱区陆面过程与气候
变化重点实验室开放课题(Ｙ５２０３５１１Ｙ１)ꎮ
Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (４１２７１０５８)ꎬ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (２０１０ＣＢ９５１７０４)ꎬ ａｎｄ Ｏｐｅｎ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｌａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ Ｃｌｉｍａｔｅ ｉｎ Ｃｏｌｄ ａｎｄ Ａｒｉｄ
Ｒｅｇｉｏｎｓꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ (Ｙ５２０３５１１Ｙ１) .
作者简介: 董超(１９９０－)ꎬ 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事植物分子生物学研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄｏｎｇｃｈａｏ＠ｍａｉｌ ｋｉｂ ａｃ ｃｎ)ꎮ
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙａｎｇｙｐ＠ｍａｉｌ ｋｉｂ ａｃ ｃｎ)ꎮ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｉｎ
Ｓｔｉｐａ ｃａｐｉｌｌａｃｅａ ｕｎｄｅｒ Ａｂｉｏｔｉｃ Ｓｔｒｅｓｓ
ＤＯＮＧ Ｃｈａｏ１ꎬ２ꎬ３ꎬ ＹＡＮＧ Ｙｕｎ￣Ｑｉａｎｇ１ꎬ２ꎬ ＳＵＮ Ｘｕ￣Ｄｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＬＩ Ｘｉｏｎｇ１ꎬ２ꎬ
ＹＡＮＧ Ｓｈｉ￣Ｈａｉ１ꎬ４ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｒｏｎｇ１ꎬ２ꎬ ＹＡＮＧ Ｙｏｎｇ￣Ｐｉｎｇ１ꎬ２∗
(１. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｅａｓｔ Ａｓｉａꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｋｕｎｍｉｎｇꎬ ６５０２０４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ １０００４９ Ｃｈｉｎａꎻ
４. Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｉｂｅｔａｎ Ｐｌａｔｅａｕ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇꎬ １００１０ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂａｓｅｄ ｏｎ ＥＳＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ＲＡＣＥ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓꎬ ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ
ａ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ (ＴＩＰ) ｇｅｎｅ ｔｅｒｍｅｄ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｔｉｐａ ｃａｐｉｌｌａｃｅａ.
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ (ＯＲＦ) ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｗａｓ ７５３ ｂｐꎬ
ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ２５０ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２５８ ｋＤ ａｎｄ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔ ｏｆ ６１６. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１
ｈａｄ ａ ｃｌｏｓｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ ＡｔＴＩＰ１ꎻ１ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ. Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｗａｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ. Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｓａｌｔꎬ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓ.
ｃａｐｉｌｌａｃｅａ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｐｒｏｖｉｄｅ ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｓ ｃａｐｉｌｌａｃｅａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓｔｉｐａ ｃａｐｉｌｌａｃｅａ Ｋｅｎｇꎻ Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎻ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇꎻ Ｇｅｎｅ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ Ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ
水通道蛋白(ａｑｕａｐｏｒｉｎꎬ ＡＱＰ)存在于从细菌
到高等植物和哺乳动物等所有生物体的细胞中ꎬ 与
其他生物相比ꎬ 植物含有更多的水通道蛋白基
因[１]ꎮ 早期ꎬ 根据植物 ＡＱＰ 的亚细胞定位和蛋白
质序列相似性将其分为 ４ 类ꎬ 即质膜内在蛋白
(ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＰＩＰｓ)、 液
泡膜内在蛋白 ( ＴＩＰｓ)、 类 Ｎｏｄ２６ 膜内在蛋白
(ＮＯＤ２６￣ｌｉｋｅ ＭＩＰｓꎬ ＮＩＰｓ)、 小分子碱性膜内在蛋
白( ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ＳＩＰｓ)ꎬ 其
中 ＰＩＰｓ主要分布于质膜上ꎬ ＴＩＰｓ 主要分布于液泡
膜上ꎮ 后来ꎬ 对苔藓和其他植物的研究表明ꎬ 植物
水通道蛋白还包括另外 ３ 类ꎬ 即类 ＧｌｐＦ 膜内在蛋
白(ＧｌｐＦ￣ｌｉｋｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＧＩＰｓ)、 混合内在
蛋白(ｈｙｂｒｉｄ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＨＩＰｓ)和 Ｘ 内在蛋
白(Ｘ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＸＩＰｓ)ꎮ 因此ꎬ 目前植物
ＡＱＰ蛋白质家族主要分为 ７ 类ꎬ 其中以质膜内在
蛋白 ＰＩＰｓ 和液泡膜内在蛋白 ＴＩＰｓ 的研究最为
广泛[２]ꎮ
水通道蛋白属于主要内在蛋白(ｍａｊｏｒ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ＭＩＰｓ)超家族ꎬ 分子量为 ２６ ~ ３４ ｋＤ [３]
ꎮ ＡＱＰ蛋白的一级结构高度保守ꎬ 同时典型的植
物 ＡＱＰｓ共有 ６个跨膜 α￣螺旋(Ｈ１ ~ Ｈ６)ꎬ 并在跨
膜螺旋之间形成 ５ 个短环( ｌｏｏｐ Ａ ~ ｌｏｏｐ Ｅ)ꎮ 其
中ꎬ ｌｏｏｐＡ、 ｌｏｏｐＣ、 ｌｏｏｐＥ 位于细胞膜外侧ꎬ 而
ｌｏｏｐＢ、 ｌｏｏｐＤ以及 ＡＱＰ 肽链的 Ｎ 端和 Ｃ 端均在
细胞膜内侧ꎻ 在 Ｂ 环和 Ｅ 环上各有一个非常保守
的天 门 冬 酰 胺￣脯 氨 酸￣丙 氨 酸 ( Ａｓｎ￣Ｐｒｏ￣Ａｌａꎬ
ＮＰＡ)结构域ꎬ 并且几乎所有的已测序的 ＭＩＰｓ 基
因中都具有 ＮＰＡ 结构域[４]ꎮ 若该区域产生突变ꎬ
ＡＱＰ的水通道功能则会丧失[５]ꎬ 因此 ＮＰＡ 结构域
与水通道的形成直接相关ꎬ 并且已经成为鉴定植物
ＡＱＰｓ的标志性序列ꎮ
ＡＱＰ在植物对非生物胁迫响应方面起着重要
作用[６]ꎮ ＡＱＰ基因能够参与响应多种非生物胁迫
(干旱、 盐碱和低温等)ꎬ 如盐芥 ( Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ
ｓａｌｓｕｇｉｎｅａ)ＴｓＴＩＰ１ꎻ２ 和野生大豆(Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ)
ＧｓＴＩＰ２ꎻ１ 基因均可被干旱、 盐、 低温、 Ｈ２Ｏ２、
ＡＢＡ诱导表达[７ꎬ８]ꎮ ＡＱＰ 基因对非生物胁迫的响
应是多样的[９]ꎬ 即不同的 ＡＱＰ 基因在相同胁迫条
件下会出现上调或下调表达趋势ꎮ 过表达 ＡＱＰ 基
因可以增加转基因植物抵抗非生物胁迫的能力ꎬ 例
如: 小麦 ＴａＮＩＰ 和 ＴａＡＱＰ８ 基因的过表达提高了
转基因植株对盐胁迫的耐受能力[１０ꎬ１１]ꎻ 人参
ＰｇＴＩＰ１在拟南芥中的过表达提高了其植株对盐胁
迫的抗性ꎬ 同时降低冷驯化能力[１２]ꎻ 过表达 Ｓｌ￣
ＴＩＰ２ꎻ２基因的转基因番茄植株表现出对盐和水分
胁迫抗性的提高[１３]ꎮ 相反ꎬ 过表达一些 ＡＱＰ 基因
也会降低转基因植株耐盐、 耐旱或耐低温的能
力[９]ꎬ 如拟南芥 ＰＩＰ１ꎻ４ 和 ＰＩＰ２ꎻ５ 基因的过表达
会导致干旱胁迫下水分流失更快ꎬ 进而导致种子萌
发和幼苗生长减慢[１４]ꎮ 因此ꎬ 研究不同逆境下
ＡＱＰ基因的表达模式ꎬ 对理解该基因在植物响应
逆境胁迫中的作用以及筛选关键的候选基因并应用
于分子育种具有重要意义ꎮ
液泡占据了成熟植物细胞的 ９０％空间ꎬ 而 ＴＩＰ
主要在液泡膜中表达ꎬ 并且是细胞内水分运输的关
键蛋白ꎮ ＴＩＰ不仅是水分运输的通道[１５]ꎬ 一些 ＴＩＰ
还是其他小分子物质的运输通道ꎬ 如拟南芥
ＡｔＴＩＰ１ꎻ１、 ＡｔＴＩＰ１ꎻ２、 ＡｔＴＩＰ２ꎻ３ 蛋白可以运输
Ｈ２Ｏ２ꎬ 而烟草 ＮｔＴＩＰａ 可以运输尿素和甘油[１６ꎬ１７]ꎮ
盐芥 ＴｓＴＩＰ１ꎻ２基因在拟南芥中的过表达会明显提
高其植株在盐胁迫条件下细胞内 Ｎａ＋含量[８]ꎻ 番茄
ＳｌＴＩＰ２ꎻ２基因在拟南芥中的过表达明显降低了其
根尖分生区表皮细胞中 Ｎａ＋和 Ｋ＋的流出速率[１８]ꎬ
说明一些 ＴＩＰ还参与 Ｎａ＋、 Ｋ＋离子的平衡调节ꎮ 除
液泡膜外ꎬ 一些 ＴＩＰ也定位在特定细胞器中ꎬ 如拟
南芥 ＡｔＴＩＰ３ꎻ１在种子子叶中的蛋白质储存泡中高
表达ꎮ 此外ꎬ 一些 ＴＩＰ基因还具有组织特异性表达
的特点ꎬ 如 ＡｔＴＩＰ２ꎻ１ 在茎的维管组织中高表达ꎬ
而在根中几乎不表达[１９]ꎻ 有的 ＴＩＰ 基因参与果实
成熟调节ꎬ 如梨 ＴＩＰ１ꎻ１ 和葡萄 ＴＩＰｓ 基因[２０ꎬ２１]ꎮ
这说明不同的 ＴＩＰ具有不同的功能ꎮ
丝颖针茅是禾本科(Ｇｒａｍｉｎｅａｅ)针茅属(Ｓｔｉ￣
ｐａ)的多年生丛生草本植物ꎬ 也是青藏高原特有植
物ꎬ 主要分布在灌丛草甸与灌丛草原地区ꎮ 在西藏
境内ꎬ 从阿里南部向东ꎬ 沿雅鲁藏布江－藏南湖盆
地区一直分布到隆子附近ꎻ 在羌塘高原南部和藏东
北索县、 丁青以及昌都地区也有分布ꎮ 丝颖针茅是
００１ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷
青藏高原地区的优良牧草之一ꎬ 具有很强的抗逆性
能ꎮ Ｚｈａｎｇ等[２２]研究表明ꎬ 丝颖针茅在水分缺乏
以及高温条件下可以通过叶片卷曲、 气孔关闭等生
理活动来提高自身对环境的适应性ꎮ 目前ꎬ 对于丝
颖针茅抗逆的分子机制研究较少[２３]ꎬ 本文拟利用
其转录组数据中的 ＥＳＴ 序列ꎬ 并结合 ｃＤＮＡ 末端
快速扩增 ( ｒａｐｉｄ￣ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓꎬ
ＲＡＣＥ)技术克隆一个液泡膜内在蛋白基因 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ꎬ
通过序列分析、 亚细胞定位以及检测该基因在盐、
低温、 干旱胁迫下的表达水平ꎬ 以期阐明 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１
基因在丝颖针茅适应非生物胁迫等逆境中的作用奠
定基础ꎮ
１ 材料与方法
１ １ 实验材料
从西藏当雄草原站(３０°４５′２８″ Ｎꎬ ９１°３１′１２″ Ｅ)
采集饱满、 成熟度好的丝颖针茅种子作为供试材
料ꎮ 将种子播种在盛有混合营养土的小塑料花盆
中ꎬ 每盆播种约 ２０ ~３０粒ꎻ 然后置于 ２３℃生化培
养箱中黑暗培养 ３６ ｈꎻ 待种子发芽后ꎬ 移入人工
气候 室 (昼 夜 温 度: ２５℃/ ２０℃ꎻ 昼 夜 时 间:
１６ ｈ / ８ ｈꎻ 相对湿度: ７５％ ~ ８０％)培养 ４ ~ ５周ꎬ
备用ꎮ
１ ２ 实验试剂
ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ 试剂盒购自 ＴａＫａＲａ 公司ꎻ Ｍ￣
ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔａｓｅ 反转录试剂盒购自
Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻ Ｓａｌ Ｉ、 ＥｃｏＲ Ｉ 内切酶和 Ｔ４ ＤＮＡ
连接酶购自 ＮＥＢ 公司ꎻ ＬＡ Ｔａｑ 酶、 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载
体购自宝生物工程 (大连)公司ꎻ ＴｒａｎＳｔａｒｔ Ｔｏｐ
ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｓｕｐｅｒ ｍｉｘ 购自北京全式金生物技术
有限公司ꎮ 其他生化试剂均为进口或国产分析纯
级ꎮ 引物合成和 ＤＮＡ 测序由上海捷瑞生物工程有
限公司完成ꎮ
１ ３ 实验方法
１ ３ １ 总 ＲＮＡ提取和第一链 ｃＤＮＡ的合成
选取生长良好的丝颖针茅幼苗ꎬ 剪取其幼嫩叶
片ꎬ 用 ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ 试剂盒提取总 ＲＮＡꎬ 并用
０８％琼脂糖凝胶电泳和 ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ１０００ 分光
光度计检测 ＲＮＡ的质量、 浓度及纯度ꎮ 取 ＲＮＡ样
品 ５ μｇꎬ 参照 Ｐｒｏｍｅｇａ 公司的 Ｍ￣ＭＬＶ 反转录试
剂盒说明书进行 ｃＤＮＡ第一链合成ꎮ
１ ３ ２ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆
根据从丝颖针茅转录组序列中筛选出的一条
ＥＳＴ片段序列信息ꎬ 应用软件 Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５设
计 ３′、 ５′端片段克隆引物 Ｐ１ 和 Ｐ２、 Ｄ１ 和 Ｄ２(表
１)ꎬ 并以 ｃＤＮＡ第一链为模板进行 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因
开放阅读框序列的扩增ꎮ ３′ＲＡＣＥ 分别用两轮巢式
引物进行扩增ꎬ 第二轮模板为稀释 ２０ 倍的上一轮
ＰＣＲ产物ꎬ 引物分别为试剂盒提供的 Ｂ２６ 和 Ｐ１、
Ｂ２６和 Ｐ２ꎮ
５′ＲＡＣＥ 利用 ＴＡＫＡＲＡ 公司的 ５′ Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ
Ｋｉｔ试剂盒并参照使用说明书进行扩增ꎮ 首先ꎬ 对
ｃＤＮＡ第一链进行末端加尾并作为模板ꎻ 然后ꎬ 分
别用两轮巢式引物进行扩增ꎮ 第二轮模板为稀释
２０倍的上一轮 ＰＣＲ产物ꎬ 引物分别为试剂盒提供
的 ＡＡＰ和 Ｄ１、 ＡＵＡＰ和 Ｄ２ꎮ
将 ＥＳＴ 序列和 ３′端、 ５′端片段的测序序列进
行拼接ꎬ 并应用软件 Ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 设计 Ｓｃ￣
ＴＩＰ１ꎻ１基因全长的扩增引物 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｆ和 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣
Ｒ(表 １)ꎻ ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增后连接至 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体ꎬ
转化大肠杆菌 ＤＨ５α并测序ꎮ
１ ３ ３ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的序列分析
利用 Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ 网站的
ＥｘＰＡＳｙ 翻译工具 ( ｈｔｔｐ: / / ａｕ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ /
ｄｎａ.ｈｔｍｌ)将全长 ｃＤＮＡ 序列翻译成蛋白序列ꎻ 利
用 ＮＣＢＩ 数据库中 Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ 进行同源比对分
析ꎻ 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ工具(ｈｔｔｐ: / / ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ / )
在线预测蛋白质的分子量大小、 氨基酸组成、 等电
点及疏水性ꎬ 在 ＩｎｔｅｒＰｒｏ 网站预测其结构域ꎻ 用
ＭＥＧＡ ５１ 软件的 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ 程序进行同源序列比
对ꎻ 用 Ｐｈｙｒｅ２ ｓｅｒｖｅｒ在线软件(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｓｂｇ.
ｂｉｏ.ｉｃ. ａｃ. ｕｋ / ｐｈｙｒｅ２ / ｈｔｍｌ / ｐａｇｅ. ｃｇｉ? ｉｄ ＝ ｉｎｄｅｘ)
预测蛋白质的三维结构ꎻ 用ＭＥＧＡ ５１软件并选择
邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇꎬ ＮＪ)进行系统发育树的
构建ꎬ 自展值(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅ)为 １０００ꎮ
１ ３ ４ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１表达载体的构建及亚细胞定位
以测序正确的 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ / ｐＭＤ１８￣Ｔ 重组质粒
为模板ꎬ 用 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｆ￣Ｓａｌ Ｉ和 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｒ￣ＥｃｏＲ Ｉ
引物(表 １)进行 ＰＣＲ扩增ꎬ 并将 ＰＣＲ反应产物连
接至 ｐＭＤ１８￣Ｔ载体ꎮ 挑选经测序验证序列正确的
克隆提取质粒ꎬ 并将质粒和 ｐＲＩ１０１￣ＧＦＰ 载体分别
用 Ｓａｌ Ｉ和 ＥｃｏＲ Ｉ内切酶双酶切ꎬ 再用 Ｔ４ ＤＮＡ 连
接酶过夜连接ꎬ 构建 ＳｃＴＩＰ ꎻ１ / ｐＲＩ１０１￣ＧＦＰ融合表
１０１ 第 １期 董 超等: 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆及对非生物胁迫的应答
表 １ ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ １ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
注释
Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
Ｐ１ ＴＧＴＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＡ ３′ＲＡＣＥ
Ｐ２ ＴＣＧＣＣＡＴＣＧＧＣＴＴＣＡＴＣＧＴ ３′ＲＡＣＥ
Ｄ１ ＴＧＣＧＣＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡ ５′ＲＡＣＥ
Ｄ２ ＡＡＣＣＧＣＡＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧ ５′ＲＡＣＥ
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｆ ＡＴＧＣＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＣＧＣ 基因全长
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｒ ＴＴＡＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡ 基因全长
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｆ￣Ｓａｌ Ｉ ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧ￣ＧＡＴＣＧＣ 亚细胞定位
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣Ｒ￣
ＥｃｏＲ Ｉ
ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＡＧＴＣＧＧＴＧＧＴ￣
ＧＧＧＧＡ 亚细胞定位
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ｑＦ ＧＧＧＡＴＡＣＣＡＧＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ｑＲ ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣＧＴＡ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
Ｕｂｉ￣ｑＦ: ＡＧＣＧＴＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣ￣ＴＡＣＴＣＣＡ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
Ｕｂｉ￣ｑＲ: ＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＴＣＡＡＣＣＴＴＧＴ ｑＲＴ￣ＰＣＲ
达载体ꎬ 转化大肠杆菌 ＤＨ５α并测序验证ꎮ
将构建好的质粒用电击法转化根癌农杆菌
ＧＶ３１０１菌株感受态ꎻ 再将含重组质粒的农杆菌
ＧＶ３１０１注射到烟草叶片中ꎬ ３ ｄ 后利用激光共聚
焦显微镜观察其下表皮的 ＧＦＰ荧光ꎮ
１ ３ ５ 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的表达分析
选取生长良好的丝颖针茅幼苗ꎬ 分别用
１５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ、 ２０％ ＰＥＧ８０００ 及 ４℃环境模
拟盐、 干旱、 低温胁迫ꎻ 然后取胁迫处理后 ０、 １、
３、 ６ ｈ 时的幼嫩叶片并分别提取总 ＲＮＡꎻ 反转录
成 ｃＤＮＡ (作为模板)后ꎬ 在 ＡＢＩ７５００ 荧光定量
ＰＣＲ 仪上进行实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ (表 １:
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ｑＦ、 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ｑＲ、 Ｕｂｉ￣ｑＦ、 Ｕｂｉ￣ｑＲ 引
物)ꎮ 反应体系为 ２０ μＬꎬ 主要包含: ２ × ｑＰＣＲ
ｍｉｘ １０ μＬꎬ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＤｙｅＩＩ ０４ μＬꎬ 上下
游引物(１０ μｍｏｌ / Ｌ)各 ０４ μＬꎬ ｃＤＮＡ １ μＬꎬ ｄｄＨ２Ｏ
７８ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增程序: ９４℃预变性 ３０ ｓꎻ ９４℃
变性 ５ ｓꎬ ５９℃退火 １５ ｓꎬ ７２℃延伸 ３４ ｓꎬ ４０ 个
循环ꎮ 每个处理设 ４次重复ꎬ 每个反应设 ３次技术
重复ꎮ 以丝颖针茅 Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ基因为内参ꎮ
采用 ２－ΔΔＣＴ法[２４]计算基因相对表达量ꎻ 利用
ＳＰＳＳ软件对数据进行统计分析ꎬ 并采用单因素
ＡＮＯＶＡ 检验ꎻ 利用 ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １００ 软件绘制柱
状图ꎮ
２ 结果与分析
２ １ 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆
利用 ３′ＲＡＣＥ扩增技术获得长度为 ３９２ ｂｐ 的
３′端序列(图 １: Ａ)ꎬ 利用 ５′ＲＡＣＥ 扩增技术获得
长度为 ３７４ ｂｐ 的 ５′端序列(图 １: Ｂ)ꎬ 再经全长
扩增获得了丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因的编码区全长
ＯＲＦ序列(图 １: Ｃ)ꎮ 其长度为 ７５３ ｂｐꎬ 编码 ２５０
个氨基酸ꎬ 包括两个保守的 ＮＰＡ 序列(图 ２ꎬ 第
８５ ~ ８７、 １９８ ~ ２００ 个氨基酸)ꎮ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因序
列的 ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＫＴ０２３５７２ꎮ
100
250
500
750
1000
2000
bp bp bp
100
250
500
750
1000
2000
100
250
500
750
1000
2000
M M MA B C
Ａ: ３′ＲＡＣＥ扩增ꎻ Ｂ: ５′ＲＡＣＥ扩增ꎻ Ｃ: 开放阅读框(ＯＲＦ)序列扩增ꎮ
Ａ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ３′ ＲＡＣＥꎻ Ｂ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ５′ ＲＡＣＥꎻ Ｃ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏ￣
ｄｕｃｔ ｏｆ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１. Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ.
图 １ ＲＡＣＥ及 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因扩增
Ｆｉｇ １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＡＣＥ ａｎｄ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１
２０１ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷
11
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21
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41
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241
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301
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121
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161
541
181
601
201
661
221
721
241
图 ２ 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的核酸序列及其蛋白的氨基酸序列
Ｆｉｇ ２ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｐｒｏｔｅｉｎ
２ ２ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的序列分析
将该蛋白质的氨基酸序列在 ＧｅｎＢａｎｋ 中进行
Ｂｌａｓｔ搜索ꎬ 发现该蛋白和短柄草(Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ
ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ) ＴＩＰ１￣１ 蛋 白 ( ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ ＸＰ＿
００３５５８８１５)、 玉米 ( Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ.) ＴＩＰ１￣１ 蛋白
(ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ. ＮＰ ＿００１１０４８９６)、 水稻 (Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ Ｌ.)ＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白(ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ. Ｐ５０１５６)分
别具有 ９３％、 ９１％、 ９３％的序列相似性ꎮ 将其分
别和拟南芥 ＡｔＴＩＰ１ꎻ１、 ＡｔＴＩＰ１ꎻ ２ 氨基酸序列进行
比对ꎬ 发现序列相似性分别为 ７６４９％和 ７５４９％ꎬ
故将其命名为丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因ꎮ
应用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 工具对 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因序列进
行在线分析ꎬ 结果表明ꎬ 推测的编码蛋白质的预测
分子量为 ２５８ ＫＤꎬ 理论等电点为 ６１６ꎻ 该蛋白有
８个强碱性氨基酸残基(３２％)、 １０ 个强酸性氨基
酸残基(４０％)、 １２４ 个疏水性残基(４９６％)、 ５３
个极性残基(２１２％)ꎬ 说明其具有较强的疏水性ꎻ
不稳定系数为 ２３６９ꎬ 显示其为稳定蛋白ꎮ 将 Ｓｃ￣
ＴＩＰ１ꎻ１蛋白在 ＩｎｔｅｒＰｒｏ 网站上进行结构预测ꎬ 结
果表明 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白有 ６ 个跨膜结构域(图 ３ꎬ
ＴＭ１~ ６)和两个保守的 ＮＰＡ 基序ꎬ 说明其具有液
泡膜内在蛋白家族典型的特征[２５ꎬ２６]ꎬ 属于液泡膜
内在蛋白家族的一员ꎮ
２ ３ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的进化分析
为了探讨 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因的系统进化关系ꎬ 我
们 从 ＴＡＩＲ ( Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅ￣
ｓｏｕｒｃｅ)数据库中下载了拟南芥所有 ＡＱＰ 蛋白的
氨基酸序列ꎬ 并利用 ＭＥＧＡ ５０软件的 ＮＪ 法构建
系统发育树(图 ４)ꎮ 结果显示ꎬ 所有的 ＴＩＰ 蛋白形
成一个分支ꎬ 其中 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 与拟南芥 ＡｔＴＩＰ１ꎻ１、
ＡｔＴＩＰ１ꎻ２两个蛋白形成的分支关系最近ꎮ 此外ꎬ 氨
基酸序列比对结果表明ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 与 ＡｔＴＩＰ１ꎻ１ 的
相似性(７６４９％)大于 ＡｔＴＩＰ１ꎻ２(７５４９％)ꎬ 说明
其属于 ＴＩＰ１ꎻ１基因类型ꎬ 并可能具有和拟南芥 Ａｔ￣
ＴＩＰ１ꎻ１基因相似的功能ꎮ
２ ４ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１蛋白的三维结构预测
应用 Ｓｗｉｓｓ￣Ｍｏｄｅｌ对 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白的三维结
构进行预测ꎬ 结果显示该蛋白序列有 ６个较大的 α
螺旋结构域ꎬ 并由 ｌｏｏｐ 环相连ꎮ 结合对结构域的
进一步预测分析ꎬ 我们推测这 ６ 个 α 螺旋结构为
跨膜结构(图 ５)ꎬ 此结果与其他物种的 ＴＩＰ１ 蛋白
结构一致[２７]ꎮ
２ ５ 水通道蛋白 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１的亚细胞定位
为了探究 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白在细胞中发挥功能的
３０１ 第 １期 董 超等: 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆及对非生物胁迫的应答
ScTTP1 1
Bd
;
TTP1 1
HvTTP1 1
OsTTP1 1
TaTTP1 1
ZmTTP1 1
;
;
;
;
;
ScTTP1 1
BdTTP1 1
HvTTP1 1
OsTTP1 1
TaTTP1 1
ZmTTP1 1
;
;
;
;
;
;
ScTTP1 1
BdTTP1 1
HvTTP1 1
OsTTP1 1
TaTTP1 1
ZmTTP1 1
;
;
;
;
;
;
ScTTP1 1
BdTTP1 1
HvTTP1 1
OsTTP1 1
TaTTP1 1
ZmTTP1 1
;
;
;
;
;
;
78
78
78
78
78
78
156
156
156
156
156
156
234
234
234
234
234
234
250
250
250
250
250
250
TM1 TM2
TM3 TM4
TM5 TM6
ＴＭ１ ~ ６代表 ６个跨膜区域ꎬ ２个方框表示 ＭＩＰ蛋白家族具有的保守 ＮＰＡ基序ꎮ
ＴＭ１ ~ ６ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｉｘ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎｓꎬ ａｎｄ ｔｗｏ ｒｅｄ ｂｏｘｅｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｔｗｏ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＮＰＡ ｍｏｔｉｆｓ.
图 ３ 不同植物 ＴＩＰ１的氨基酸序列比对
Ｆｉｇ ３ Ｍｕｌｔｉ￣ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＴＩＰ１ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔｓ
位置ꎬ 我们构建了绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)和目的蛋
白的融合表达载体(图 ６: Ａ)ꎬ 并将其和空的 ＧＦＰ
载体分别用农杆菌 ＧＶ３１０１菌株浸染烟草叶片ꎮ 浸
染后第 ３ ｄꎬ 利用激光共聚焦显微镜观察融合载体
在烟草叶片下表皮中的瞬时表达情况ꎮ 结果显示
(图 ６)ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ＧＦＰ 融合蛋白仅在细胞内液泡
膜中特异表达ꎬ 而空的 ＧＦＰ 蛋白在整个细胞中都
有表达ꎬ 这说明 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白定位在液泡膜中并
发挥其作用ꎬ 此结果与拟南芥等物种 ＴＩＰ１ 蛋白在
细胞中的位置一致[２８ꎬ２９]ꎮ
２ ６ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因在盐、 干旱及低温胁迫下的表
达分析
分别用 １５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ、 ２０％ＰＥＧ８０００ 和
４℃环境模拟盐、 干旱及低温胁迫ꎬ 并检测
ＳｃＴＩＰ１ ꎻ１ 基因在不同胁迫条件下的表达水平变化
(图 ７)ꎮ 结果显示: 盐胁迫处理 ３ ｈ 时ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１
基因的表达量为对照(０ ｈ)的 ８ 倍ꎬ ６ ｈ 时其表达
量下降至对照的 ２９ 倍ꎬ 表明 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因受
１５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ 诱导表达ꎻ ２０％ＰＥＧ８０００ 处理
１ ｈ时ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的表达量显著上调ꎬ 约为对
照的 １０倍ꎬ 之后随干旱胁迫时间的延长逐渐下降
至初始水平ꎬ 说明 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因受干旱胁迫的快
速诱导表达ꎻ 在 ４℃低温胁迫下ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的
表达量在 ３ ｈ 时达到最高峰ꎬ 约为对照的 ３６ 倍ꎬ
之后迅速下降至对照的 ７倍ꎮ 在盐、 干旱及低温胁
迫下ꎬ 丝颖针茅ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因能够被快速诱导表
达ꎬ 且低温处理后其表达量变化最明显ꎬ 说明
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因参与了丝颖针茅对多种非生物胁迫
的响应ꎬ 这对丝颖针茅适应青藏高原复杂多变的环
境具有重要作用ꎮ
３ 讨论
水孔蛋白属于多基因家族并作为通道蛋白大量
存在于生物膜细胞上ꎬ 且具有高度保守的结构特
征ꎮ 本实验基于青藏高原特有植物丝颖针茅转录组
数据库中的一条 ＥＳＴ 序列ꎬ 结合 ＲＡＣＥ 快速扩增
技术ꎬ 首次克隆到 １ 条 ＴＩＰ 基因序列并命名为
ＳｃＴＩＰ１ ꎻ１ꎬ 该基因 ＯＲＦ长度为 ７５３ ｂｐꎬ 编码 ２５０
个氨基酸ꎮ 对其进行序列分析(图 ２ꎬ 图 ５)ꎬ 发现
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１和其他物种的 ＴＩＰ１具有高度相似性ꎬ 均
４０１ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷
At
PI
P2
2;
At
PI
P2
3;
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At
PI
P2
1;
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tP
IP
2
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58
At
PI
P2
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AtP
IP2
6;
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AtP
IP2
7;
AtPI
P2
8;
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AtPIP1 5;
AtPIP1 4;
AtPIP1 3;
AtPIP1 1;
AtPIP1 2;
97
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100
AtTIP2 2;AtTIP2
3;
97
AtTIP2
1;
75
AtTIP5
1;
37
AtTIP4
1;
AtTIP3
1;
AtTIP3
2;
100
AtTIP1
3;
ScTIP1
1;
AtTIP1
1;
AtTIP1
2;
90 89 92 4
9 38
74
78
AtN
IP7
1;
AtN
IP5.
1
AtNIP
6 1;
100
AtNIP4 1;
AtNIP4 2;
100
AtNIP3 1;
AtNIP2 1;
AtNIP1 1;
AtNIP1 2;
74
67
66
85
77
96
AtSIP2
1;
AtSIP1
2;
AtSIP1
1;
100
99
0.5
图 ４ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１和拟南芥水通道蛋白的系统发育关系分析
Ｆｉｇ ４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ａｎｄ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
Extracellular
Cytoplasmic
N-terminal
C-terminal
Membrane
197-208 Re-entrant helix
41
21
60
90
124
94
141
163
193
175 236
216
H1 H2 H3 H4 H5 H6
A B Loop
structure
α helix
NPA domain
Ａꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１跨膜螺旋结构示意图ꎻ Ｂꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１空间结构图ꎮ
Ａꎬ Ｓｋｅｔｃｈ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｂꎬ Ｓｐａｔｉａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｐｒｏｔｅｉｎ.
图 ５ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１蛋白的三维结构模型构建与分析
Ｆｉｇ ５ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｈｅ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｐｒｏｔｅｉｎ
含有 ６ 个跨膜结构域和水通道蛋白家族保守的
ＮＰＡ结构域[３０]ꎬ 这些特征序列成为鉴别丝颖针茅
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１蛋白及其类别划分的重要标准之一ꎬ 同
时也是执行和调控丝颖针茅水孔蛋白功能的重要基
序ꎮ 氨基酸序列同源性比对和聚类分析进一步表
明ꎬ 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１与拟南芥 ＡｔＴＩＰ１ꎻ１蛋白的
５０１ 第 １期 董 超等: 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆及对非生物胁迫的应答
CaMV 35S
promoter
AtADH 5’
UTR
GFP ScTIP1;1 NOS
terminator
A
B C D
Ａꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ＧＦＰ融合蛋白表达载体示意图ꎻ Ｂꎬ 明视野图ꎻ Ｃꎬ 荧光图ꎻ Ｄꎬ 叠加图ꎮ
Ａꎬ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ＧＦＰ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｂꎬ Ｖｉｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｎａｔｕｒｅ ｌｉｇｈｔꎻ Ｃꎬ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｖｉ￣
ｓｉｏｎꎻ Ｄꎬ Ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｖｉｓｉｏｎ.
图 ６ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ＧＦＰ融合蛋白在烟草叶片细胞中的亚细胞定位
Ｆｉｇ ６ Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１￣ＧＦＰ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｆ ｃｅｌｌ
亲缘关系最近(图 ３ꎬ 图 ４)ꎮ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白的 Ｎ
端和 Ｃ端与其他物种的水通道蛋白结构一致ꎬ 都
位于胞质外侧(图 ５: Ａ)ꎬ 跨膜域和 ｌｏｏｐＢ、 ｌｏｏｐＥ
共同构成水通道蛋白的中央狭窄空隙ꎬ 并形成“沙
漏”结构ꎮ 这种结构对水孔蛋白的渗透选择性和水
分的通透性具有重要意义[１５]ꎬ 并且 ＴＩＰ 蛋白的这
种调控作用主要发生在植物细胞的液泡膜上[６ꎬ１６]ꎬ
本研究的亚细胞定位结果也表明ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 蛋白
对丝颖针茅细胞的水分调控发生在液泡膜上ꎮ
水孔蛋白在植物细胞中的含量较高ꎬ 其中菠菜
ＴＩＰ占总液泡膜蛋白的 １０％ ~ １５％[１７]ꎬ 萝卜 ＴＩＰ
占总液泡膜蛋白的 ４０％[１９]ꎮ 水孔蛋白在植物细胞
中广泛分布且含量较高ꎬ 表明植物水通道蛋白不仅
是水分跨膜运输的通道ꎬ 同时也参与植物细胞的水
分平衡调节[１５]以及植物对多种非生物胁迫的响应ꎬ
例如: 盐芥 ＴｓＴＩＰ１ꎻ２ 可以被干旱、 盐、 ＡＢＡ、
Ｈ２Ｏ２ 等诱导表达ꎬ 进而促进盐芥对非生物胁迫的
耐受性[８ꎬ２７]ꎻ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因可以被干旱、 盐和低
温胁迫诱导表达ꎬ 尤其是在低温胁迫下其表达量更
高ꎮ 低温胁迫可造成植物细胞的生理性缺水ꎬ 如
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因在低温条件下表达上调ꎬ 可能与丝
颖针茅遭受低温胁迫和植物本身在低温下水分关系
的失衡有关ꎮ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因在低温、 干旱、 盐胁
迫下的表达量分别在处理 ３ ｈ 和 １ ｈ 时达到最高ꎬ
之后出现下降趋势ꎬ 说明该基因对胁迫存在快速、
短期响应现象ꎬ 这与水稻 ＯｓＴＩＰ１ꎻ１ 基因功能相
似ꎮ 利用 １５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ、 １００ μｍｏｌ / Ｌ ＡＢＡ、
１５％ ＰＥＧ处理水稻幼苗ꎬ 胁迫 ６ ｈ时 ＯｓＴＩＰ１ꎻ１基
６０１ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷
150 mmol/L NaCl
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0 1 3 6
!" Time h( )
a
b
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ab
20% PEG
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!" Time h( )
a
b
a
a
4℃
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0 1 3 6
!" Time h( )
#
$
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&
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e
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iv
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ex
pr
es
si
on
le
ve
l
a
c
d
b
不同字母表示 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ 基因的相对表达量差异显著( Ｐ <
００５)ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｏｒｍａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｍｅａｎ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ ｔｈｅ Ｐ <
００５ ｌｅｖｅｌ.
图 ７ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因在盐、 干旱及
低温胁迫下的表达量变化
Ｆｉｇ ７ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ
ＳｃＴＩＰ１ꎻ１ ｕｎｄｅｒ ｓｔｒｅｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓａｌｔꎬ
ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
因在其根中的表达量达到最高ꎬ 然后开始呈下降趋
势[３１]ꎮ 此外ꎬ ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因表达水平的变化也可
能是丝颖针茅对青藏高原昼夜温差变化大的一种适
应策略ꎮ
植物水孔蛋白对逆境条件在转录水平上的响应
并不完全一致ꎬ 主要包括被逆境诱导表达和抑制表
达ꎬ 例如: 在拟南芥中ꎬ γ￣ＴＩＰ和 δ￣ＴＩＰ在应用甘露
醇模拟干旱胁迫下其表达量下降[３２]ꎻ Ａｒｉｆａ 等[３３]在
研究低温对水稻根系的影响时发现ꎬ 随着处理时间
的延长低温抑制了水稻 ＯｓＴＩＰ１ꎻ１、 ＯｓＴＩＰ２ꎻ２ 基因
表达ꎮ 由于一些 ＡＱＰ基因的过表达也不能提高转基
因植株耐盐、 干旱或低温的能力[９]ꎬ 因此筛选能
够响应逆境胁迫的 ＴＩＰ１ 基因具有重要意义ꎮ 本研
究中 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１受不同胁迫诱导时表达上调可能是
植物本身适应青藏高原环境条件的一种优化结果ꎬ
然而这种优化的作用机制以及能否将该基因作为提
高植物抗逆性的候选基因仍需进一步的研究验证ꎮ
参考文献:
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[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１４ꎬ ３２(３): ３０４－３１４.
[ ３ ] Ｔｙｅｒｍａｎ ＳＤꎬ Ｎｉｅｍｉｅｔｚ ＣＭꎬ Ｂｒａｍｌｅｙ Ｈ. Ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ:
ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｓｏｌｕｔｅ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ
ｒｏｌｅｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｖｉｒｏｎꎬ ２００２ꎬ ２５ (２): １７３－１９４.
[ ４ ] Ｈｅｙｍａｎｎ ＪＢꎬ Ｅｎｇｅｌ Ａ. Ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ: ｐｈｙｌｏｇｅｎｙꎬ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ[ Ｊ] . Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃｉꎬ
１９９９ꎬ １４(５): １８７－１９３.
[ ５ ] Ｐｒｅｓｔｏｎ ＧＭꎬ Ｃａｒｒｏｌｌ ＴＰꎬ Ｇｕｇｇｉｎｏ ＷＢꎬ Ａｇｒｅ Ｐ. Ａｐｐｅａｒ￣
ａｎｃｅ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｐｃｙｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ
ｒｅｄ ｃｅｌｌ ＣＨＩＰ２８ ｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ] . Ｓｃｉｃｎｃｅꎬ １９９２ꎬ ２５６(５０５５):
３８５－３８７.
[ ６ ] Ｌｉ Ｇꎬ Ｓａｎｔｏｎｉ Ｖꎬ Ｍａｕｒｅｌ Ｃ. Ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ: ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ[ Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａꎬ ２０１３ꎬ １８４０(５):
１５７４－１５８２.
[ ７ ] Ｗａｎｇ ＬＬꎬ Ｃｈｅｎ ＡＰꎬ Ｚｈｏｎｇ ＮＱꎬ Ｌｉｕ Ｎꎬ Ｗｕ ＸＭꎬ Ｗａｎｇ Ｆꎬ
Ｙａｎｇ ＣＬꎬ Ｒｏｍｅｒｏ ＭＦꎬ Ｘｉａ ＧＸ. Ｔｈｅ Ｔｈｅｌｌｕｎｇｉｅｌｌａ ｓａｌｓｕｇ￣
ｉｎｅａ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ＴｓＴＩＰ１ꎻ ２ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓｅｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ
２０１３ꎬ ５５(１): １４８－１６１.
[ ８ ] Ｗａｎｇ Ｘꎬ Ｌｉ Ｙꎬ Ｊｉ Ｗꎬ Ｂａｉ Ｘꎬ Ｃａｉ Ｈꎬ Ｚｈｕ Ｄꎬ Ｓｕｎ ＸＬꎬ Ｃｈｅｎ
ＬＪꎬ Ｚｈｕ ＹＭ. Ａ ｎｏｖｅｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｓｏｊａ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｄｅｐｒｅｓｓｅｓ ｓａｌｔ
ａｎｄ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉ￣
ａｎａ[Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１１ꎬ １６８(１１): １２４１－１２４８.
[ ９ ] Ｇｕｏ Ｌꎬ Ｗａｎｇ ＺＹꎬ Ｌｉｎ Ｈꎬ Ｃｕｉ ＷＥꎬ Ｃｈｅｎ Ｊꎬ Ｌｉｕ Ｍꎬ Ｃｈｅｎ
ＺＬꎬ Ｑｕ ＬＪꎬ Ｇｕ ＨＹ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ
[Ｊ] . Ｃｅｌｌ Ｒｅｓꎬ ２００６ꎬ １６(３): ２７７－２８６.
[１０] Ｇａｏ Ｚꎬ Ｈｅ Ｘꎬ Ｚｈａｏ Ｂꎬ Ｚｈｏｕ Ｃꎬ Ｌｉａｎｇ Ｙꎬ Ｇｅ Ｒꎬ Ｓｈｅｎ ＹＺꎬ
Ｈｕａｎｇ ＺＪ. Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ
ｗｈｅａｔꎬ ＴａＮＩＰꎬ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａ￣
ｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ ５１(５): ７６７－７７５.
[１１] Ｈｕ Ｗꎬ Ｙｕａｎ Ｑꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ Ｃａｉ Ｒꎬ Ｄｅｎｇ Ｘꎬ Ｗａｎｇ Ｊꎬ Ｚｈｏｕ
ＳＹꎬ Ｃｈｅｎ ＭＪꎬ Ｃｈｅｎ ＬＨꎬ Ｈｕａｎｇ Ｃꎬ Ｍａ Ｚꎬ Ｙａｎｇ Ｇꎬ Ｈｅ Ｇ.
Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｗｈｅａｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｇｅｎｅꎬ ＴａＡＱＰ８ꎬ ｅｎ￣
ｈａｎｃｅｓ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ [ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１２ꎬ ５３(１２): ２１２７－２１４１.
[１２] Ｐｅｎｇ Ｙꎬ Ｌｉｎ Ｗꎬ Ｃａｉ Ｗꎬ Ａｒｏｒａ Ｒ. Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐａ￣
ｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ａｌｔｅｒｓ ｓａｌｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅꎬ
７０１ 第 １期 董 超等: 丝颖针茅 ＳｃＴＩＰ１ꎻ１基因的克隆及对非生物胁迫的应答
ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｌｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔａꎬ ２００７ꎬ ２２６(３): ７２９－７４０.
[１３] Ｓａｄｅ Ｎꎬ Ｖｉｎｏｃｕｒ ＢＪꎬ Ｄｉｂｅｒ Ａꎬ Ｓｈａｔｉｌ Ａꎬ Ｒｏｎｅｎ Ｇꎬ Ｎｉｓｓａｎ
Ｈꎬ Ｗａｌｌａｃｈ Ｒꎬ Ｋａｒｃｈｉ Ｈꎬ Ｍｏｓｈｅｌｉｏｎ Ｍ. Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐｌａｎｔ
ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ: ｉｓ ｔｈｅ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ
ａｑｕａｐｏｒｉｎ ＳｌＴＩＰ２ꎻ２ ａ ｋｅｙ ｔｏ ｉｓｏｈｙｄｒｉｃ ｔｏ ａｎｉｓｏｈｙｄｒｉｃ ｃｏｎ￣
ｖｅｒｓｉｏｎ? [Ｊ] . ２００９ꎬ Ｎｅｗ Ｐｈｙｔｏｌꎬ １８１(３): ６５１－６６１.
[１４] Ｊａｎｇ ＪＹꎬ Ｌｅｅ ＳＨꎬ Ｒｈｅｅ ＪＹꎬ Ｃｈｕｎｇ ＧＣꎬ Ａｈｎ ＳＪꎬ ＫａｎｇＨ.
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｌａｎｔｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ￣
ｉｎｇ ａｎ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｒｅｓｐｏｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｙ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ ａｂｉｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ ２００７ꎬ ６４(６): ６２１－６３２.
[１５] Ｌｕｉｓ Ｌꎬ Ｃａｔａｒｉｎａ Ｐꎬ Ｌｏｕｒｅｉｒｏ￣Ｄｉａｓ ＭＣꎬ Ｍｏｕｒａ ＴＦꎬ Ｓｏｖｅｒａｌ
Ｇ. Ｔｈｅ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ＴＩＰ２ꎻ１ ｉｓ ａ ｐｒｅｓｓｕｒｅ
ｇａｔｅｄ ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌ[Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎꎬ
２０１４ꎬ ４５０(１): ２８９－２９４.
[１６] Ｂｉｅｎｅｒｔ ＧＰꎬ Ｍｏｌｌｅｒ ＡＬꎬ Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ＫＡꎬ Ｓｃｈｕｌｚ Ａꎬ Ｍｏｌｌｅｒ
ＩＭꎬ Ｓｃｈｊｏｅｒｒｉｎｇ ＪＫꎬ Ｊａｈｎ ＴＰ. Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ
ｔｈｅ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｃｒｏｓｓ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ[Ｊ] .
Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍꎬ ２００７ꎬ ２８２(２): １１８３－１１９２.
[１７] Ｇｅｒｂｅａｕ Ｐꎬ Ｇｕｃｌｕ Ｊꎬ Ｒｉｐｏｃｈｅ Ｐꎬ Ｍａｕｒｅ Ｃ. Ａｑｕａｐｏｒｉｎ Ｎｔ￣
ＴＩＰａ ｃａｎ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｃｅｌｌ
ｖａｃｕｏｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏ ｓｍａｌｌ ｎｅｕｔｒａｌ ｓｏｌｕｔｅｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｊꎬ
１９９９ꎬ １８(６): ５７７－５８７.
[１８] Ｘｉｎ Ｓꎬ Ｙｕ ＬＬꎬ Ｑｉａｎｇ ＸＪꎬ Ｘｕ Ｎꎬ Ｃｈｅｎｇ ＸＧ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ｔｏｍａｔｏ ＳｌＴＩＰ２ꎻ２ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ
ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎｓ[Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓꎬ ２０１４ꎬ １２７(６): ６９５－７０８.
[１９] Ｊａｕｈ ＧＹꎬ Ｆｉｓｃｈｅｒ ＡＭꎬ Ｇｒｉｍｅｓ ＨＤꎬ Ｒｙａｎ Ｊｒ ＣＡꎬ Ｒｏｇｅｒｓ
ＪＣ. ｄｅｌｔａ￣Ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｕｎｉｑｕｅ ｐｌａｎｔ
ｖａｃｕｏｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ [ Ｊ ] . Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉꎬ １９９８ꎬ ９５
(２２): １２９９５－１２９９９.
[２０] Ｓｈｉｒａｔａｋｅ Ｋꎬ Ｇｏｔｏ Ｈꎬ Ｍａｅｓｈｉｍａ Ｍꎬ Ｙａｍａｋｉ Ｓ. Ｆｌｕｃｔｕａ￣
ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｈ＋￣ｐｕｍｐｓ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｃｈａｎｎｅｌｓ
ｏｆ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｒａｐｅ ｂｅｒｒｙ ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔ[Ｊ] . Ｊ Ｊｐｎ Ｓｏｃ Ｈｏｒｔｉｃ Ｓｃｉꎬ ２００１ꎬ ７０(３): ２８７－２９３.
[２１] Ｓｈｉｒａｔａｋｅ Ｋꎬ Ｋａｎａｙａｍａ Ｙꎬ Ｍａｅｓｈｉｍａ Ｍꎬ Ｙａｍａｋｉ Ｓ.
Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｈ(＋) ￣ｐｕｍｐｓ ａｎｄ ａ ｔｏｎｏｐｌａｓｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｏｆ ｖａｃｕｏｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅａｒ
ｆｒｕｉｔ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ １９９７ꎬ ３８(９): １０３９－１０４５.
[２２] Ｚｈａｏ ＹＰꎬ Ｚｈａｎｇ ＸＺꎬ Ｓｈｉ ＰＰꎬ Ｗａｎｇ ＪＳꎬ Ｗｕ ＪＳ. Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ
ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｎｅｔ ＣＯ２ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｂｏｖｅ ａｎ Ａｌｐｉｎｅ
ｇｒａｓｓｌａｎｄ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｔｉｂｅｔａｎ Ｐｌａｔｅａｕ[Ｊ] . Ｊ
Ｒｅｓ Ｅｃｏｌꎬ ２０１３ꎬ ４(４): ３２７－３３６.
[２３] Ｙａｎｇ ＳＨꎬ Ｌｉ Ｘꎬ Ｙａｎｇ ＹＱꎬ Ｙｉｎ Ｘꎬ Ｙａｎｇ ＹＰ. Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ
Ｓｔｉｐａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｔｉｂｅｔａｎ Ｐｌａｔｅａｕ[ Ｊ] . Ｂｏｔａｎｙꎬ ２０１４ꎬ
９２(１２): ８９５－９００.
[２４] Ｌｉｖａｋ ＫＪꎬ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓ￣
ｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２(－Ｄｅｌ￣
ｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ ( Ｔ)) ｍｅｔｈｏｄ [ Ｊ] . Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２００１ꎬ ２５ ( ４):
４０２－４０８.
[２５] Ｇｏｍｅｓ Ｄꎬ Ａｇａｓｓｅ Ａꎬ Ｔｈｉｅｂａｕｄ Ｐꎬ Ｄｅｌｒｏｔ Ｓꎬ Ｇｅｒｏｓ Ｈꎬ
Ｃｈａｕｍｏｎｔ Ｆ. Ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ａｒｅ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｓｏｌ￣
ｕｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ [ Ｊ] .
Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａꎬ ２００９ꎬ １７８８(６): １２１３－１２２８.
[２６] Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｉꎬ Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｍꎬ Ｊｏｈａｎｓｏｎ Ｕꎬ Ｌａｒｓｓｏｎ Ｃꎬ Ｋｊｅｌｌ￣
ｂｏｍ Ｐ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ｐｌａｎｔ
ｗａｔｅｒ ｂａｌａｎｅ[Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａꎬ ２０００ꎬ １４６５(１－
２): ３２４－３４２.
[２７] Ｙｕｅ Ｃꎬ Ｃａｏ ＨＬꎬ Ｗａｎｇ Ｌꎬ Ｚｈｏｕ ＹＨꎬ Ｈａｏ ＸＹꎬ Ｚｅｎｇ ＪＭꎬ
Ｗａｎｇ ＸＣꎬ Ｙａｎｇ ＹＪ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｅａ ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎ (ＡＱＰ) ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ [ Ｊ] .
Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ ２０１４ꎬ ８３: ６５－７６.
[２８] Ｂｅｅｂｏ Ａꎬ Ｔｈｏｍａｓ Ｄꎬ Ｄｅｒ Ｃꎬ Ｓａｎｃｈｅｚ Ｌꎬ Ｌｅｂｏｒｇｎｅ￣Ｃａｓ￣
ｔｅｌ Ｎꎬ Ｍａｒｔｙ Ｆꎬ Ｓｃｈｏｅｆｓ Ｂꎬ Ｂｏｕｈｉｄｅｌ Ｋ. Ｌｉｆｅ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉ￣
ｔｈｏｕｔ ＡｔＴＩＰ１ꎻ１ꎬ ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｌｏ￣
ｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｐｏｓｉｎｇ ｔｏｎｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ａｄｊａｃｅｎｔ ｖａｃｕｏｌｅｓ
[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ ２００９ꎬ ７０(１－２): １９３－２０９.
[２９] 庞永奇ꎬ 王高奇ꎬ 王旭初ꎬ 陈珈ꎬ 王学臣. 植物水孔蛋白的
亚细胞分布与生理功能浅析[Ｊ] . 生物化学与生物物理学进
展ꎬ ２０１２ꎬ ３９(１０): ９６２－９７１.
Ｐａｎｇ ＹＱꎬ Ｗａｎｇ ＧＱꎬ Ｗａｎｇ ＸＣꎬ Ｃｈｅｎ Ｊꎬ Ｗａｎｇ ＸＣ. Ａ
ｂｒｉｅｆ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ[ Ｊ] . Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ￣
ｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓꎬ ２０１２ꎬ ３９(１０): ９６２－９７１.
[３０] Ｍａｕｒｅｌ Ｃ. Ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ: ｎｏｖｅｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａ￣
ｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ[ Ｊ] . ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔꎬ ２００７ꎬ ５８１ ( １２): ２２２７ －
２２３６.
[３１] Ｌｉ ＧＷꎬ Ｐｅｎｇ ＹＨꎬ Ｙｕ Ｘꎬ Ｚｈａｎｇ ＭＨꎬ Ｃａｉ ＷＭꎬ Ｓｕｎ ＷＮꎬ
Ｓｕ ＷＡ. Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ｖａｃｕｏｌａｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｖａｒｉｏｕｓ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ ｉｎ ｒｉｃｅ [ Ｊ] . Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００８ꎬ １６５ ( １８):
１８７９－１８８８.
[３２] Ｗｅｉｇ Ａꎬ Ｄｅｓｗａｒｔｅ Ｃꎬ Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ ＭＪ. Ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｈａｓ ２３ ｍｅｍｂｅｒｓ ｔｈａｔ ｆｏｒｍ
ｔｈｒｅｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｉｔｈ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ｉｎ ｅａｃｈ
ｇｒｏｕｐ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ １９９７ꎬ １１４(４): １３４７－１３５７.
[３３] Ａｒｉｆａ Ａꎬ Ｍａｒｉ ＭＨꎬ Ｊｕｎｋｏ ＩＳꎬ Ｈｉｎｄｅｈｉｒｏ Ｈꎬ Ｙｕｋｉｏ Ｋꎬ Ｍａｔ￣
ｓｕｏ Ｕ. Ｃｏｌｄ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｉｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｂｙ ｒｏｏｔ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１２ꎬ
５３(８): １４４５－１４５６.
(责任编辑: 刘艳玲)
８０１ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷