全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45卷 第 2期 2014年 1月

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• 药材与资源 •
刺五加液泡膜内在蛋白基因的克隆与表达分析
邢朝斌，刘 岩，周 秘，龙月红，吴 鹏
河北联合大学生命科学学院，河北 唐山 063000
摘 要：目的 克隆刺五加的液泡膜内在蛋白（tonoplast intrinsic proteins，TIP）基因，并对其进行生物信息学和表达分析。
方法 采用 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术克隆刺五加 TIP基因 cDNA的全长序列。以 GAPDH为内参照基因，通过
RT-PCR法检测 TIP基因在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果 刺五加 TIP基因 cDNA的全长 1 080 bp，开放阅
读框长 756 bp，编码 251个氨基酸的蛋白，该蛋白包含 TIP家族的标志性序列。刺五加的 TIP蛋白具有 6个跨膜螺旋，定位
于液泡膜。表达分析结果显示，刺五加 TIP基因在不同生长发育时期和不同器官中均有表达，但表达量具有显著差异（P＜
0.05）。其中盛花期的表达量最高，是最低量果实快速生长期的 2.07倍；各器官中，叶片的表达量最高，是最低量根的 1.73
倍。结论 首次分离到刺五加 TIP 基因的 cDNA 全长序列，并证实其在盛花期的叶中表达量最高，为进一步研究 TIP 基因
对刺五加水分代谢的影响奠定基础。
关键词：刺五加；液泡膜内在蛋白；克隆；生物信息学；表达分析
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)02 - 0250 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.02.018
Cloning and expression analysis of tonoplast intrinsic proteins gene
in Eleutherococcus senticosus
XING Zhao-bin, LIU Yan, ZHOU Mi, LONG Yue-hong, WU Peng
College of Life Science, Hebei United University, Tangshan 063000, China
Abstract: Objective To clone tonoplast intrinsic proteins (TIP) gene from Eleutherococcus senticosus and to analyze its
bioinformatics and expression. Methods Full length cDNA of TIP gene was cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE).
Taking GAPDH gene as reference gene, the expression of TIP in different organs of E. senticosus at various growing periods was
detected by RT-PCR. Results The full length cDNA of TIP gene was 1 080 bp containing a 756 bp open reading frame (ORF) that
encoded a protein of 251 amino acids including the typical sequences of TIP family. TIP gene was located in tonoplast with six
transmembrane domains. The result of expression analysis indicated that TIP gene expressed in different growth periods and organs of
E. senticosus, and the expression amount differed significantly (P < 0.05). The highest content of the expression showed up at full
opening flower stage, which was 2.07 times as much as that in the lowest at rapid fruit growth stage. The highest content of the
expression was in the leaves which was 1.73 times as much as that of the lowest in roots. Conclusion We have first extracted the full
length cDNA of TIP gene in E. senticosus, which proves that the highest content of the expression is in the leaves at full opening flower
stage. This work provides a foundation for the fuither investigation on the ffect of water metabolism in E. senticosus.
Key words: Eleutherococcus senticosus (Rupr. et Maxim.) Maxim.; tonoplast intrinsic proteins; clone; bioinformatics; expression analysis

水孔蛋白（aquaporin）是存在于植物细胞膜和
液泡膜上能选择性地高效转运水分子的膜内在蛋
白，属于主要内在蛋白（major intrinsic protein，MIP）
超家族[1]。在植物体中介导细胞与介质间的快速被
动水分运转，参与水分的长距离运输、单个细胞扩
展及渗透调节等许多生理过程，是水分进出细胞的
主要途径[2]。根据氨基酸序列的同源性及结构特征，
通常将植物水孔蛋白分为质膜内在蛋白（plasma
membrane intrinsic proteins，PIP）、液泡膜内在蛋白
（tonoplast intrinsic proteins，TIP）、类 Nod26膜内在

收稿日期：2013-10-16
基金项目：河北省自然科学基金——石药集团医药联合研究基金项目（H2012401006）；河北联合大学培育基金（GP201306）
作者简介：邢朝斌（1975—），男，副教授，研究方向为分子生药学、药用植物细胞工程。
Tel: (0315)3725859 Fax: (0315)3726341 E-mail: xzbheuu@126.com
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蛋白（nodulin 26-like intrinsic proteins，NIP）、小分子
碱性膜内在蛋白（ small and basic intrinsic
proteins，SIP）和 GlpF 膜内在蛋白（GlpF-like
intrinsic proteins，GIP），共 5 类[3-4]，对 PIP 的
研究较多。但最近发现 TIP的导水性能是 PIP的
上千倍，更利于水分的快速转移，因而其在细胞
渗透压及植物水分代谢的快速调节中可能起着
更为重要的作用 [5-6]。目前已经从部分植物中克
隆到其 TIP基因。刺五加是我国传统的珍贵药用
植物，近期，参与其次生代谢调控的关键酶基因
相继被克隆[7]，但尚未见其 TIP基因的相关报道。
本 研 究 采 用 cDNA 末 端 快 速 扩 增 （ rapid
amplification of cDNA ends，RACE）技术首次克
隆到刺五加 TIP基因的 cDNA全长序列，并分析
了其在不同生长发育时期、不同器官中的表达，
为深入研究刺五加的水分代谢及其对次生代谢
的影响奠定了基础。
1 材料与试剂
1.1 材料
刺五加 Eleutherococcus senticosus (Rupr. et
Maxim.) Maxim. 采自黑龙江省鸡西市，经河北联
合大学生命科学学院邢朝斌副教授鉴定。分别以 4
月 26日（萌芽期）、5月 26日（叶片完全展开期）、
6月 26日（盛花期）、7月 26日（果实快速生长期）、
8月 26日（果实基本成熟期）、9月 26日（叶片衰
老期）的叶片和 8月 16日的叶片、叶柄、幼茎和根
（编号为 1～10）为提取 RNA的试材。
1.2 试剂
Taq DNA 聚合酶、LA Taq DNA 聚合酶、
PrimeScript逆转录酶、TdT、3’-Full RACE core set
Ver.2.0购自 Takara公司。植物总 RNA提取试剂盒、
TOP-10感受态细胞和 PGM-T克隆试剂盒购自天根
生化科技（北京）有限公司。质粒小提试剂盒、PCR
产物纯化试剂盒和琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购
自 Biomiga 公司。RevertAidTM First Strand cDNA
Synthesis Kit购自 Thermo公司。IPTG、dCTP、X-gal、
dNTPs购自北京拜尔迪生物技术有限公司。引物由
生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PAGE
纯化。
2 方法
2.1 刺五加总RNA的提取和TIP基因保守区的获得
根据试剂盒的说明，分别提取 1～10号刺五加
样本的总 RNA，并逆转录为 cDNA。利用简并上游
引物 TIPS1：5’-AACATCTCCGG(C/T)GG(A/T/G/C)-
CA-3’和简并下游引物 TIPX1：5’-GCCCAGTA(C/T)-
ACCCA(G/T)TG -3’，以逆转录获得的刺五加 cDNA
为模板，PCR扩增刺五加 TIP基因的保守区核苷酸
序列。反应体系 50 μL，其中上下游引物各 1.5 μL，
2.5 mmol/L dNTP 4 μL，10×LA Taq 缓冲液 5 μL，
LA Taq酶 0.5 μL，cDNA 2 μL，补 dd H2O至 50 μL。
反应条件为 95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；53 ℃、
30 s；72 ℃、40 s。35个循环后 72 ℃补充延伸 10
min。扩增产物经电泳、回收后，克隆入 PGM-T质
粒载体，转化大肠杆菌 TOP-10。将验证转化成功的
菌株送 Invitrogen公司测序。
2.2 RACE 技术获取刺五加 TIP 基因 cDNA 的末
端序列
根据“2.1”项中所获得的刺五加 TIP cDNA的
保守区核苷酸序列，设计 5’RACE 扩增刺五加 TIP
基 因 5’ 末 端 序 列 的 特 异 性 引 物 TIP52 ：
5’-CAAAGCTGGCCCAAATGAAACG-3’和 TIP51：
5’-CGGATAGAGCAAATGCGGTTGT-3’，及 3’RACE
扩增刺五加 TIP 基因 3’末端序列的特异性引物
TIP32：5’-CAACAACCGCATTTGCTCTATCC-3’和
TIP31：5’-GATTGTGGGAGCCAACATTCTCG-3’。
参照罗聪等[8]的方法，利用 AUP1 引物，取刺五加
总 RNA 2 μL，逆转录合成 cDNA第 1链后利用 LA
Taq DNA聚合酶 5’RACE扩增 TIP基因 cDNA的 5’
末端序列。参照 3’-Full RACE core set Ver.2.0试剂
盒说明书的要求，进行3’RACE扩增。产物参照“2.1”
项中的方法电泳、回收、克隆、测序。
2.3 刺五加 TIP 基因全长的拼接、验证与生物信息
学分析
利用 DNAMAN 6.0 软件将获得的刺五加 TIP
基因保守区序列、5’和 3’末端序列进行拼接，获得
刺五加 TIP基因 cDNA的全长序列。根据拼接获得
的序列，设计扩增包含 TIP基因起始密码子的上游
引物 TIPQS：5’-CTTGATTTTCCGGCGATGC-3’和
包含终止密码子的下游引物 TIPQX：5’-CAAACA-
GTGACCCAACTTGAC-3’，预计扩增 916 bp。反应
条件为 95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；54 ℃、40 s；
72 ℃、1 min。30个循环后 72 ℃补充延伸 10 min。
PCR扩增体系与“2.1”项相同，利用TIPQS和TIPQX
引物对，PCR扩增 TIP基因的 cDNA全长序列。参
照文献方法[9]，利用 DNAMAN 6.0、ProtParam、
PROSITE、SOPMA、PSORT和 SWISS-MODEL软
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件进行生物信息学分析。利用 Clustal W软件进行
氨基酸序列的对比分析后，使用 MEGA 5.21软件
中的 Neighbor-joining 法，替换模型选择 Poisson
model，运算 1 000次获得系统发育树。
2.4 刺五加 TIP 基因的表达分析
参照文献方法[9]，以逆转录获得的 1～10 号刺
五加样本的 cDNA为模板，利用预计扩增 TIP基因
长度为 253 bp的上游引物 TIPRTS：5’-ATTTGCTC-
TATCCGGCGTGTC-3’ ， 下 游 引 物 TIPRTX ：
5’-CCAGTGGTTGGTCCAGTCCC-3’，以及预计扩
增刺五加 GAPDH 基因长度为 134 bp 的引物 RGS
和 RGX，进行表达量分析。
3 结果与分析
3.1 刺五加 TIP 基因的克隆
以刺五加的 cDNA 为模板，利用简并引物
TIPS1和 TIPX1进行 RT-PCR扩增后，测序获得一
条长 428 bp的条带（图 1）。经 NCBI的 BLAST比
对，确定该序列为刺五加 TIP基因 cDNA的部分序
列。利用 TIP52 和 TIP51引物，5’RACE 扩增后，
测序获得一条长 480 bp的 TIP基因 5’末端 cDNA序
列（图 1）。利用 TIP32和 TIP31引物，3’RACE扩
增后，测序获得一条长 469 bp 的 TIP 基因 3’末端
cDNA序列（图 1）。将所获得的保守区片段、5’和
3’末端 cDNA序列进行拼接，发现该序列包含刺五
加 TIP 基因的完整开放阅读框（ORF）。以刺五加
的 cDNA为模板，利用 TIPQS和 TIPQX引物，PCR
扩增获得 916 bp的一条带（图 1），与预期大小相
符。测序结果显示，该序列与拼接获得的序列完全
相同。

1-TIP基因保守区的 PCR扩增 2-TIP基因的 5’RACE 3-TIP基
因的 3’RACE 4-TIP基因 cDNA全长的 PCR扩增 M-Marker
1-PCR amplification of TIP gene conserved sequence 2-5’RACE of
TIP gene 3-3’RACE of TIP gene 4-PCR amplification of full
sequence of TIP gene cDNA M-Marker
图 1 刺五加 TIP 基因的克隆
Fig. 1 Clone of TIP gene from E. senticosus
3.2 刺五加 TIP 基因的生物信息学分析
刺五加TIP基因全长1 080 bp（GenBank登录号：
KF498593），其中 5’端非翻译区（5’UTR）长 69 bp，
3’端非翻译区（3’UTR）长 255 bp，终止密码子为
TAG，ORF长 756 bp，编码 251个氨基酸残基构成
的蛋白质，3’端具有 polyA尾。预测的蛋白质相对分
子质量为 25 703.8，理论等电点（pI）为 7.01。氨基
酸序列与人参 Panax ginseng C. A. Mey.、胡萝卜
Daucus carota L. 和烟草 Nicotiana tabacum L. 的同
源性分别达到 92.4%、92.3%和 89.7%。通过 NCBI
的 BLAST比对发现，刺五加的 TIP蛋白与蛋白质数
据库中其他物种的 TIP 具有相似的功能结构域。刺
五加 TIP的 84～92 [HVNPAVTFG] 氨基酸残基处为
TIP家族的标志性序列，86～88和 199～201氨基酸
残基处，对称地分布着TIP高度保守的 [NPA] 基序。
通过 TMHMM 软件分析得知，刺五加 TIP 蛋白在
24～43、58～80、105～127、142～164、171～193
和 217～239氨基酸残基处分别存在 6个跨膜螺旋，
定位于液泡膜。刺五加 TIP 蛋白的二级结构中含有
94个 α螺旋，占 37.45%；48个延伸链，占 19.12%；
14个 β折叠，占 5.58%；95个无规则蜷曲，占 37.85%。
刺五加 TIP蛋白的三维结构见图 2。

图 2 刺五加 TIP 蛋白三级结构同源建模
Fig. 2 3D structure of TIP from E. senticosus predicted
by Swiss-model
3.3 TIP 蛋白的分子系统进化分析
利用 MEGA 5.21软件，将 GenBank中登载的
10个物种的 TIP蛋白与刺五加的 TIP蛋白进行聚类
分析，构建 TIP蛋白的系统进化树（图 3）。刺五加
与同为五加科的人参首先聚为一支，进而与同为伞
形目的胡萝卜聚在一起。单子叶植物单独聚为一个
分支，之后与双子叶植物聚在一起。
3.4 刺五加 TIP 基因的表达分析
刺五加 TIP基因在不同生长发育时期和器官中
的表达变化如图 4所示。自萌芽开始的整个生长期
中，TIP 基因均有表达，但表达量差异显著（P＜
0.05）。在整个生长期中，TIP的表达呈现高-低-高-
M 1 M 2 M 3 M 4
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
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图 3 TIP 蛋白的系统进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of TIP protein

1-萌芽期 2-叶片完全展开期 3-盛花期 4-果实快速生长期 5-果
实基本成熟期 6-叶片衰老期 7-叶片 8-叶柄 9-幼茎 10-根
不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）
1-germination stage 2-leaf fully extended stage 3-flowering stage
4-fruit rapid growth stage 5-fruit elementary mature stage 6-leaf
senescence stage 7-blade 8-petiole 9-tender stems 10-roots
Lowercase letters indicate significant difference (P < 0.05）
图 4 刺五加不同生长发育时期及器官中 TIP 基因的表达变化
Fig. 4 Expression variations of TIP gene during different
growth and development stages and in various
organs of E. senticosus
低-高-低的变化趋势。萌芽期、盛花期和果实基本
成熟期的表达量较高，叶片完全展开期次之。其
中盛花期的表达量最高，果实快速生长期的表达
量最低，前者是后者的 2.07倍。果实快速生长期
和叶片衰老期的表达量间差异不显著。刺五加的
TIP 基因在叶片、叶柄、幼茎和根中均有表达，
但表达量具有显著差异（P＜0.05）（图 4）。最大
表达量出现在叶片中，为最低表达量根的 1.73倍，
叶柄的表达量次之，幼茎和根中 TIP 基因的表达
量间差异不显著。
4 讨论
本实验所克隆的刺五加 TIP基因与同属伞形目
的人参、胡萝卜的 TIP基因的序列一致性在 90%以
上，其编码蛋白具备 TIP超家族的标志性序列特征，
均属于植物 TIP家族。刺五加的 TIP蛋白的 C端和
N端分别对称性地分布着与 TIP家族功能密切相关
的特征基序 [NPA][10]，另外刺五加的 TIP中也具备
6 个跨膜螺旋和植物 TIP 家族的标志性序列
[HVNPAVTFG] 等鉴别植物 TIP的重要特征[10]。同
源性与系统进化分析的结果表明，刺五加的 TIP与
人参、胡萝卜等植物的 TIP1亚型的亲缘关系更近，
而与其他类型的亲缘关系均较远，因此初步推断，
本实验所克隆的刺五加 TIP属 TIP1型。
液泡作为植物细胞中重要的细胞器，在植物生
长发育、细胞膨压维持及生物重要分子的代谢等过
程中具有重要的作用[6,11]。定位于液泡膜的 TIP，使
植物细胞可利用体积较大的液泡空间来缓冲细胞质
内的渗透压波动以维持其处于稳定状态，因而在细
胞渗透压调节中具有关键的作用[5-6]。TIP 在植物
的不同生长发育时期及不同组织中的表达具有很
大差异，以实现其对渗透压的调节。在不同器官中
一般表现为在有水分大量流动或含水量较高的组
织和器官中 TIP的表达相对较高[12]，刺五加的 TIP
在叶片、叶柄幼茎和根中的表达量依次降低的特
点与此相符。而刺五加 TIP 在不同生长发育时期
中表现出的开花前表达量较低，盛花期最高，之
后迅速降低的特点与月季中表现出的在花朵盛开
前期随花朵的开放逐渐升高，达到盛开后迅速下
降的特点[13]完全一致。
本研究获得的刺五加 TIP 为刺五加中首次获
得的水孔蛋白，为进一步开展该基因的功能研究以
及深入探讨刺五加水分代谢调节的分子机制奠定
了基础。
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玉蜀黍（NP001104896）
小麦（AAD10494）
陆地棉（ACP28878）
橡胶树（ACX37451）
葡萄（AN69323）
烟草（BAF95576）
西红柿（NP001234103）
胡萝卜（ACV52008）
人参（ABB29477）
刺五加（KF498593）


TIP
GAPDH
a
b
a
c
a
c
a
b
c
c
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0

相
对
表
达
量

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