全 文 ：第 4 卷 19 96
V o l
.
4 N o
草 地 学 报
A CT A A G R E S T IA S IN C A
年
19 96
首楷抗乙硫氨酸 (E T H )变异体的初步筛选
陈默君 朱 勇
(中国农业大学 , 动科科技学院 , 北京 10 009 4)
刘玉红
(中国科学院综考会 , 北京 1。。10 1)
摘要 : 用高胚性细胞系 T re kl 作为筛选材料 , 进行了抗乙硫氨酸 (E T H )变异体的初步筛选 。
愈伤组织经 2 、 4 、6 K R 下射线照射后 , 转到含不同浓度的 E T H 固体和液体选择培养基中, 继代筛选
三个月后 , 抗性愈伤组织中的含硫氨基酸量 比对照提高 1 . 05 ~ 1 . 84 倍 , 并在 0 . 02 一 1 . Om M E T H
范 围内表现出有随 E T H 浓度升高而逐渐提高的趋势 。 从 0 . 02 、 0 . 01 m M E T H 的抗性愈伤组织获
得了一批再生植株 . 植株体内的含硫氨基酸量是对照的 1 . 83 和 4 . 17 倍 。 结果表明细胞水平的突
变体筛选 , 有可能是一条改良首楷品质的育种途径。
关镇词 : 乙硫氨酸 ; 含硫氨基酸 ; 突变体
1 前言
近十多年来 , 将生物技术与常规育种方法相结合进行新品种的选育 , 缩短了育种年限 ,
提高育种效率已成为世界植物育种的普遍趋势 (H o m . W (E d . ) , 19 86; N ijs , A . P . M , 1 9 9 1 )。
很多学者利用生物技术培育首蓓新品种做了大量工作 , 包括属 间 、 种间原生质体融合 , 并获
得一些 杂种 细 胞 愈 伤 组 织 ; 应 用 基 因重组 技 术进行遗传移 植 (w eb b , K . L . 1 9 8 8; De ak
M
.
G
.
B
.
K is
.
1 9 8 6 ; T h o m e s
,
M
.
R
.
1 9 9 2 ;杨茁萌 , 19 9 2 )。 在首蓓品质育种方面 , 有 的学者从增
加首蓓的含硫氨基酸入手 , 采用 生物技术手段 , 筛选含硫氨基酸高的突变体或提取高产硫基
因 , 从而提高首藉的含硫氨基酸 (R e is e h , B . ; S . H . D u ke , 1 9 8 1 ; N o vo z h ilo v , O · V · B · A · L e v e n k o ,
1 9 8 7 ;v lakh o v a
,
M
.
a n d A
.
A ta n a so v
,
1 9 9 0 )
, 进而 达到 改善动 物 毛皮的质量 。 H a r tm u t 等人
(19 1) 将经过重构建的鸡卵白蛋白基因转入三个首蓓品种 , 而卵白蛋白质在转基因植株一旦
形成就很稳定存在 。 我国学者关于抗乙硫氨酸 (E T H )突变体方面筛选的研究 , 首先在天冬氨
酸族氨基酸及其类似物抗性突变体中筛选 , 并已取得多项成果 。 w ak as a 和 R og n es (1 9 82) 获得
烟草和大麦抗苏氨酸种子的后代 。 在水稻和玉米也有成功的先例 。
首宿抗乙硫氨酸突变体的研究 , 19 81 年 R ei sh 和 Bi ng ha m 用 EM s 作为诱变剂 , 乙硫氨酸
作为选择剂 从二倍体首蓓 H q 的细 胞悬浮培养物 中选出抗 E T H 的 细胞 系 。 vl ak h ov a 等
(19 9 0 )用细胞筛选的方法 , 获得 了 16 个紫花首蓓 (M . sa ti 、 )和 多变首信 (M . va ri a )抗 5 -
m e th yltry p t o x p h a n
, 乙硫氨酸 (L 一 e thio n in e ) , am in o th yl一L 一 ey s te in e 和 s tr e p to m y e in 的抗性细胞
系 。 其中的一些细胞系表现多抗性 , 这些抗性细胞系经过增殖培养转移至选择培养基上仍保
持抗性 。 从 E T H 抗性愈伤组织获得的再生植株其形态产生 了变化 。 我国至今尚无在首借中
进行这类研究的报道 。
草 地 学 报 1 9 96 年
2 材料和方法
2
.
1 材料 : 利用杨茁萌提供的 T re k一高胚性细胞系 (来自日本 ) , T re kl 为抗性筛选的起始愈
伤组织 。
将保持在继代培养基 M4( MS + 2 , 4 一DZ m g / L + N A A Z m g / L 十 K T Zm g / L) 上的 T re k 愈伤
组织 , 在 y 射线照射前 7 天继代一次 。
2
.
2 方法 : 高胚性细胞系 T re kl 的获得是在 T re k 组培研究的基础上 , 挑取体细胞胚胎发生数
目较多的愈伤组织 , 经过继代培养 、扩大繁殖 , 其体细胞胚胎发生频率达到 68 % 。
2
.
3 实验路线
高胚性愈伤组织经 了射线诱变和各种 E T H 浓度的选择培养基(固体和液体 )。 挑取生长
良好的愈伤组织 , 在相同 E T H 浓度的培养基上继代 3 次(每月一次 )~ 不含 E T H 的 M S 无激
素培养基上 , 诱导胚状体 , 形式再生植株。
2
.
4 离体辐射处理
根据张晓东等(19 9 2) 的研究 , 以 y 射线为诱变剂处理首信愈伤组织 。 为了获得更多的遗
传变异类型和保持愈伤组织胚胎的发生率 , 其适宜照射量为 4 一 6K R 。 本实验采用 2 、 4 、 6 K R
的照射剂量 。
2
.
5 选择培养基
以 乙硫氨酸 (E T H )为选择剂 。 M 4 (Ms + 2 , 4 D 2哩/ L + N A A Z m g / L + K T Zm g / L + 蔗糖
3 % )或 M7 (MS + 2 . 4 D o . 2 5 m g / L + 6 BA O . sm g / L + A B A O . lm g / L + 蔗糖 3 % )附加各种浓度
的 E T H 作为选择培养基 。 选择培养基采用两种形态 : 固体和液体 。
固体选择培 养基 (M 4 )的 E T H 浓度 (单位 m M ) 系列为 : 0 . 0 2 、 0 . 1 、 0 . 2 、 0 . 3 、 0 . 4 、
0
.
5
、
1
.
0
。
液体选择培养基 (M 4 或 M 7 )的 E T H 浓度 (单位 m M )系列为 : 0 . 0 2 、0 . 1 、 0 . 5 、 1 . 0
2
.
6 杭性愈伤组织 筛选
将经过 2 、 4 、 6 K R y 射线照射的愈伤组织分别接入上述各种 E T H 浓度的固体和液体选择
培养基 。
固体选择培养基 :每种 E T H 浓度接入愈伤组织 10 块 , 每块约 0 . 10 9 。 在光照条件下 、
25 ℃培养 。 一个月后挑取生长良好的愈伤组织接入相同 E T H 浓度的培养基 , 继代三次 。
液体选择培养基 : 一开始用 M4 附加 4 种 E T H 浓度 。 每种 E T H 浓度 , 30 一 50 m l液体培
养基接入愈伤组织 3 一 5 9 , 用 10 0ml 三角瓶 , 置于往复式摇床上 , 转速 1 10 rp m , 散射光 , 25 ℃ 条
件下振荡培养 。 一个月后用 60 目不锈钢网过滤 , 弃掉大块的愈伤组织 , 保留原培养液三分之
一 , 加入相同 E T H 浓度的新鲜培养液 , 以后每周继代一次 。 培养到第二个月结束时 , 将每种
E T H 浓度的培养物分成两分 , 一份继续在原相 同培养液 M 4 中继代 , 一份接入 M7 附加相 同
E T H 浓度的培养液 中继代 。
2
.
7 胚状体诱导及植株再生
将在固体选择培养基上经过三次继代筛选的愈伤组织和在液体选择培养基中经过 3 个月
振荡培养形成的小愈伤块转移至不含激素和 E T H 的 M S 培养基上诱导胚状体 , 待胚状体发育
至鱼雷胚或双子叶期时 , 转移至 1/2 MS 上萌发成长成植株 。
以上过程均在光强度 1 5 0 0 lu x , 每天光照 16 小时 , 25 ℃ 条件下进行
第 3 期 陈默君等 :首楷抗乙硫氨 (E T H )变异体的初步
2
.
8 杭性愈伤组织及其再生植株中含硫氛基酸的测定
对经 4 K R y 射线照射过 , 在各 E T H 浓度固体选择培养基上继代筛选三个月的愈伤组织进
行含硫氨基酸定量测定 。
测定从各 E T H 浓度抗性愈伤组织再生植株的含硫氨基酸量 。
测定方法 : 称 3 0 一 5 0 m g 样品 , 加 1 : 9 过氧钾酸 lm l氧化 , 0 ℃ 、 1 6 小时 , 加氢澳酸 0 . sm l放
置半小时上旋转蒸发器处理 ;用 6 N H CI 10 ml 水解 , 14 5℃ 、4 小时 , 冷却过滤定容至 50 m l; 取
lm l真空烘干加 lm l水洗后蒸干 , 用 O . 02 N H CI 上机 , 在 日立 8 35 一 50 A A 分析仪上进行含硫
氨基酸定量测定。 (样品处理及含硫氨基酸测定均 由中国农科院畜牧研究所营养室分析 )
3 结果与分析
3
.
l y 射线对愈伤组织生长的影响
经 2 、4 、6 K R 三种剂量 下射线照射后的愈伤组织 , 继续在保持培养基 M4 上培养 。 25 天内
每 5 天用肉眼观察一次 , 发现三种剂量 下射线处理的愈伤组织和对照之间 , 在增殖速度 、生长
量 、颜色和质地方面没有 明显不同 , 均能旺盛生长 。
3
.
2 不同 E T H 浓度对愈伤组织 生长的影响
固体培养基上不同 E T H 浓度对愈伤组织生长的影响 (见表 1)
表 1 E T H 浓度对愈伤组织生长的影响 ‘
T a ble 1 T h e e ffe e t s o f d iffe r e n t eo n ee n t r a tio n s o f E T H o n the g ro w th o f ea llu s
y射线剂量 愈伤组织的生长情况
(K R )7
一
ra y G ro u t h 。o n d itio n o f C allu s
E T H 浓度(m M )
G 〕n ee n t r a tio n o f E T H
0
.
0 2 0
.
1 0
.
2 0
.
3 0
.
4 0
.
5 1
.
0
生长旺盛 Pro lifie a l g ro w th 9 8 8 3 5 4 8 1 0 0 0
生长一般 O r d in a ry g ro w th 2 1 5 39 7 2 3 4 0 0
2 生长差或不生长 S lo w g r o w th 0 2 7 1 0 2 1 6 3 5 0
褐化 Bro w n e d 0 0 0 1 0 3 5 3 7 5 0
愈伤增殖受阻率 % R es ist a n t ra te t o e a llu s g ro w th 0 2 7 2 0 5 6 1 0 0 1 0 0
生长 旺盛 Pro lifie a l gr o w th 9 6 7 0 5 8 3 0 1 0 0 0
生长一般 O rd in a ry g r (〕w t h 4 2 6 3 1 4 1 2 5 12 4
4 生长差或不生长 Sl o w g r o w th 0 4 1 1 2 4 2 9 3 2 2 5
褐化 B ro w n ed 0 0 0 5 3 6 5 6 7 0
愈伤增殖受阻率 % R es ista n t ra te to c allu s g ro w th 0 3 1 1 29 6 5 8 8 9 5
生长旺盛 B ro lifiea l g ro w th 9 4 1 4 4 9 3 1 1 2 0 0
生长一般 Or d in a ry g ro w th 6 56 4 1 37 1 2 7 3
6 生长差或不生长 Sl o w g ro w th 0 0 5 7 2 6 5 5 63
褐化 B ro w n e d 0 0 2 2 5 5 0 3 8 3 4
愈伤增殖受阻率 % R es ist a n t r a te to c allu s g ro w th 0 0 10 3 2 7 6 9 3 7
注 :每个浓度 E T H 接入 10 块愈伤组织 , 四周·后统计 。
随着 E T H 浓度的提高 , 愈伤组织增殖受阻的块数逐渐增多 , 而正常生长 (包括生长 旺盛 ,
生长一般 )愈伤组 织的 比例逐渐下降。 当 E T H 浓 度为 0 . 4 m M 时 , 愈 伤组织增 殖受阻率 为
56 % 以上 ; E T H 的浓度为 0 . sm M 时 , 受阻率为 8 % 以上 ; E T H 的浓度为 1 . om M 时 , 受阻率
达 97 % 以上 , 三种剂量 y 射线处理过的愈伤组织 , 受 E T H 的浓度影响的情况没有明显不同 ,
均表现出相同的趋势。 E T H 在固体培养基上对 T re kl 愈伤组织的 “半致死剂量” 为 0 . 4 m M 。


草 地 学 报 19 96 年
表 3 来自 E T H 抗性愈伤组织的再生株含硫氨基酸 ! (% ) 二
T a ble 3 S C AA co
n te n t in t he r e g en e r a te Pla n tlete d o f th e re s ist a n t e al lu s on E T H
氨 基 酸 E T H 浓 度(m M )
E T H eo n ee n tr a tio n
A八 0 0 . 0 2 0 . 1 0
胧 氨 酸 CyS 一 C yS 0 . 06 0 . 12 0 . 3 7
蛋 氨 酸 M e t 0 . 06 0 . 1 0 0 . 1 3
胧氨酸 + 蛋氨酸
Cys 一 C ys + M e t
0
.
12 0
.
2 2 0
.
50
, 愈伤组织经过 4 K R y 射线照射
从表 3 可以看出 , 0 . 02 和 0 . 10 m M E T H 抗性愈伤组织通过胚状体途径再生的植株 , 其体
内的含硫氨基酸量比对照分别提高了 1 . 83 和 4 . 17 倍 , 其中胧氨酸提高了 2 . 0 和 6 . 2 倍 , 蛋氨
酸提高了 L 67 和 2 . 17 倍 。
结果表 明 : 经过筛选得到的愈伤组织 E T H 抗性能在植株水平表达出来 , 而且很 明显提高
植株体内的含硫氨基酸量 。
4 讨论
4
.
1 由于时间关系 , 没有在高选择压力(高抑制的浓度 )的培养基上进行继代筛选 ; 未将选择
培养基上的愈伤组织接入到空白培养基上进行抗性鉴定 , 未对再生植株进行抗性鉴定 。 本实
验的结果只说明 , 在培养基中加入 E T H 作选择剂 , 能提高愈伤组织中的含硫氨基酸量 , 并且
愈伤组织的 E T H 抗性能在植株水平上表达 。
4
.
2 关于供诱变 、筛选原始材料及培养系统的选择 。 选择细胞突变体的理想材料应该是 : 单
细胞 (最好是单倍体 ) ;简单 , 短期和能够重复的分离程序 ;能容易地再生植株 ;长期而方便地保
存 ;有所需要 的 、稳定的和能够遗传的性状 ;知道突变性状的遗传和生化基础 , 缪树华(19 90 )。
在实际研究工作中 , 完全满足上述条件的材料是基本没有的。 根据研究性质选择一种合适的
诱变 , 筛选原始材料和采用一个切实可行的培养系统 , 是选择成功的关键。 本实验采用高胚性
的 T re kl 作为起始材料 , 从理论上讲有以下优点 , ¹ 通过体细胞胚胎发生途径形成的植株最初
来 自单个胚性细胞 , 在培养过程中发生在胚性细胞中的任何遗传变异和突变 , 都可以完整地保
留在由它所发育的单体植株中 , 克服了组织培养中再生植株的遗传嵌合体问题 。 罗纬等
( 19 82 )º 细胞系具有高胚胎发生能 力 , 为选择培养系统提供了方便有效 地的条 件 , M ar iot ti
等 , ( 19 8 3 ) 。
本实验采用了固体选择培养基和液体选择培养基两种培养系统 。 从愈伤组织对培养基中
E T H 浓度的敏感性看 , 愈伤组织在 固体培养基上能耐受的 E T H 浓度 比在液体培养基 中高 。
这是 由于在液体培养基中 , 整块愈伤组织和细胞可以同培养基直接接触 , E T H 的效能得到充
分发挥的缘故 。 这和 R ei sh 等人 ( 19 8 1) 的看法一致 。 T re kl 的愈伤组织接入液体选择培养基
后 , 在 E T H 为 0 . 02 m M 和 0 . lm M 的培养液中 , 经过 2一 3 月的振荡培养 , 建成了胚性悬浮细
胞系 , 这提示如果在液体培养基中加入适 当浓度的 E T H 作选择剂 , 待建成胚性悬浮 细胞系
后 , 再按一般应用悬浮培养细胞分离突变体的方法 , 即将悬浮培养的细胞以一定密度转移至高
第 3 期 陈默君等 : 首楷抗乙硫氨(E T H )变异体的初步
选择压力的固体培养基上进行筛选分离高抗 E T H 的突变体 。 这种方法 的优点在于 , 悬浮培
养细胞在液体培养基中已经经受了一定选择压力的筛选 , 产生了一定程度的变异或突变 , 再将
这些细胞接种到高选择压力的固体培养基上 , 就有利于获得高抗 E T H 的突变体或变异体 , 提
高筛选效率 。 用固体选择培养基筛选抗性细胞系 , 在许多作物上成功地获得了突变体 。 这种
方法的优点是操作简单 , 突变细胞在愈伤组织中容易存活 。 缺点是需要的筛选时间较长 , 效率
较低 。
4
.
3 关于杭性表达及遗传
在进行氨基酸或氨基酸类似物的抗性突变体筛选及其它抗性突变体筛选时 , 抗性表达的
水平和抗性能否有稳定遗传是人们关注的两个问题 。 选择的抗性有的在细胞水平上表达而在
植株水平上不表达 , 或者相反 。 有的抗性能稳定的遗传 , 有的是后生遗传(E p ig en et i。) , 它是由
生理适应性引起 , 不能稳定遗传。 另外 , 选择开始只能针对某一种所需的性状(比如过量合成
氨基酸的突变 )进行 , 但选择到的突变体可能会影响其它重要的农艺性状 , 如产量 , 抗病等也是
一个问题 , 缪树华等(19 90 )。
R ei sh 等人 (19 8 1) 从二倍体首蓓(H C 2) 细胞系筛选到的 1 10 个 E T H 抗性细胞系接种到含
lm M E T H 的培养基上 , 只有 15 个抗性细胞系的生长明显比对照好 。 他们认为抗性细胞系丢
失 E T H 抗性的原因之一 , 就是后生遗传发生变化 , 即 由生理原因引起的暂时性 E T H 抗性 , 在
缺乏 E T H 的空白培养基上继代时 , 又 回复成原来正常的基因型 。 他们发现在筛选得到的抗
性细胞系中存在正常细胞和突变细胞的嵌合现象 。 经检验发现再生的 25 棵植株中只有 7 棵
保持了对 E T H 的抗性 。 他们还对来源于 E T H 抗性细胞的再生植株 , 进行了生长及形态变异
方面的研究 。 这些植株有多种类型 的变异 , 有可遗传的 , 有不遗传的 , 有显性的也有隐性的 。
表现很复杂。
由 R e ish 等 , N o v o z h ilo v 等 , B in a ro v a 等和 v la kho v i等人进行的首蓓抗 E T H 突变体筛选研
究结果可以看出 , 虽然存在抗性突变体筛选中常有的问题 , 但也充分证明了 , 利用蛋氨酸类似
物 (如 E T H )作选择剂 , 在细胞水平上筛选高含硫氨基酸的突变体 , 是首借品质育种中一条可
行的途径 。
参 考 文 献
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