全 文 ：第 17 卷 第 6 期
Vol. 17 No. 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2009 年 11 月
Nov. 2009
含硫氨基酸蛋白与 GFP融合基因的表达分析
关 宁1 , 王涌鑫1 , 李 聪1* , 苗丽宏1 , 张 博2
( 1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所牧草遗传育种研究室, 北京 100193;
2.新疆农业大学草地资源与生态自治区重点实验室, 乌鲁木齐 830052)
摘要: 提高饲用植物中的含硫氨基酸水平已成为动物营养学家关注的焦点, 含硫氨基酸对奶制品、肉类及羊毛产量
有重要影响。C- z ein 和 z eolin (C-z ein 和菜豆球蛋白的融合基因)编码 2 种含硫氨基酸蛋白基因, 利用基因轰击法将
质粒 pCBz ein、pCBz eolin 和 pCAMBIA1302 分别转入洋葱( A llium cepa L . )表皮细胞,激光共聚焦扫描显微结果表
明 C-z ein 和 z eol in 在洋葱表皮细胞的细胞核、内质网及细胞壁中均有表达。采用冻融法分别将表达载体 pCBz ein、
pCBzeolin 和 pCAMBIA1302 导入根癌农杆菌 ( Agrobacter ium tumef aciens )菌株 LBA4404, 利用该菌株转化烟草
( N icotiana tabacum ) ; 在 H yg rom ycin 选择压力下获得烟草抗性不定芽和再生植株; 激光共聚焦扫描显微结果表明
C-z ein 和 z eolin 蛋白以颗粒的形式不均匀地分布在烟草原生质体中, 并验证表达载体 pCBz ein 和 pCBz eolin 的选
择基因、目的基因和报告基因均得到了表达, 为进一步开展豆科牧草营养品质改良奠定了基础。
关键词:含硫氨基酸基因; 绿色荧光蛋白;洋葱; 烟草;基因表达
中图分类号: Q946. 1 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2009) 06-0706-07
Expression Analysis of Fusion Gene Sulphur-amino acid
Protein with Green Fluorescent Protein
GUAN Ning
1
, WANG Yong-x in
1
, L I Cong
1*
, M IAO L-i hong
1
, ZHANG Bo
2
( 1. Forag e Plantsc Genetics and Breeding Lab oratory, In st itu te of Animal Sciences, C hinese Academ y of Agricultural Sciences,
Beijin g 100193, China; 2. Key Laboratory of Grassland Resource and Ecology, Xinjiang Agricultural University, U rumqi 830052, Ch ina)
Abstract: Improvement of the sulfur-containing amino acids level in forage plants has been the focus of at-
tention of the animal nutr it ionists. Sulphur-containing amino acids play an impo rtant ro le in the ef f iciency
of dairy, meat and w oo l product ion.C- z ein and z eol in ( fused w ithC-zein and phaseo lin ) are the genes enco-
ding sulphur-containing amino acids proteins. Plasm ids pCBzein, pCBzeolin and pCAMBIA 1302 w ere
tr ansferred into epidermal cells o f onion by gene-gun bombardment technique , respect ively. T he r esults of
confocal laser scanning micr oscope ( CLSM ) show ed that C-zein and z eol in expressed in cell nuclear, endo-
plasm ic r et iculum and cell w all of onion epidermal cells t ransformed C- z ein-GFP and z eolin-GFP . Expres-
sion vectors pCBzein, pCBzeo lin and pCAMBIA1302 were t ransferr ed into Ag robacter ium tumef aciens
LBA4404 by freeze- thaw method, and then w ere t ransformed into N icot iana tabacum mediated by stain
LBA4404. Resistant advent itious shoots and regenerat ion plants w ere obtained under the selection pressure
of Hyg romycin. The results of CLSM conf irmed that C-zein and zeo lin accumulated in granular form s w ere
dist ributed heterogeneously in the protoplast of tobaccoes, and pr oved that the selection gene, targ et genes
and repo rt gene f rom the plant expression vectors pCBzein and pCBzeolin w ere w orking w ell detected by
PCR and CLSM .
Key words: Sulphur-am ino acid genes; Gr een f luor escent pro tein; A l lium cepa L. ; N icotiana tabacum ;
Gene expression
含硫氨基酸可显著增加羊的生长量和羊毛的产
量及质量,提高奶牛产奶量[ 1~ 3] 。含硫氨基酸(主要
为甲硫氨酸和半胱氨酸)在豆科牧草中含量较少, 常
是第一限制性必需氨基酸[ 4, 5]。因此, 利用基因工
程技术培育高含硫氨基酸的牧草品种是当前牧草营
养品质改良的研究热点之一。
目前已经从玉米( Zea may s L. )、水稻 ( Ory z a
sativa L. )、向日葵( H el ianthus annuus )等作物中
分离得到富硫氨基酸蛋白及其编码基因 [ 6~ 8]。玉米
醇溶蛋白 ( z ein) 是玉米重要贮藏蛋白质, 在胚乳
收稿日期: 2009-08-05; 修回日期: 2009-09-09
基金项目:国家十一五科技支撑计划( 2006BAD01A19) ;新疆农业大学草地资源与生态自治区重点实验室开放课题( XJDX0201-2005- 03)
作者简介:关宁( 1981- ) ,女,满族,辽宁辽阳人, 博士研究生, 研究方向为牧草遗传育种与生物技术, E-mail: caasguan@ yahoo. com . cn ;
* 通讯作者: Author for corresponden ce, E-mail: licong0520@ s ina. com
第 6期 关宇等:含硫氨基酸蛋白与 GFP 融合基因的表达分析
中以蛋白体的形式存在, 可分为 A-、B-、C-和 D-z ein4
种主要类型,其中 B-、C-和 D-z ein 富含甲硫氨酸和半
胱氨酸 [ 9]。玉米醇溶蛋白具有在反刍动物瘤胃中稳
定而在肠中降解的特性, 可作为改良牧草品质的候
选基因[ 10]。 z ein 基因已在拟南芥 ( Ar abidop sis
thal iana)、烟草( N icot iana tabacum )等模式植物及
白三叶草( Tr i f olium r ep ens L. )、紫花苜蓿( Med i-
cago sativa L. )和百脉根( L otus corniculatus L. )等
豆科牧草植物中成功表达 [ 11~ 15] ,对增加牧草可食性
组织的含硫氨基酸含量具有重要指导意义。z eolin
基因是部分 C-z ein 基因与菜豆球蛋白 ( p haseolin)
基因的融合基因。本研究将 C- z ein和 z eolin 基因
分别与植物表达载体 pCAMBIA1302的 GFP 报告
基因融合,通过遗传转化研究了C- z ein-GFP 和 z eo-
l in-GFP 基因在洋葱表皮细胞和烟草中的表达情
况,并验证所构建植物表达载体的正确性,为进一步
研究三叶草、紫花苜蓿等豆科牧草营养品质改良奠
定了良好基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
洋葱 ( A ll ium cepa L. ) 和烟草 ( N icotiana
tabacum )种子由本实验室提供。
1. 2 菌株与质粒
所用克隆载体为 pMD18-T ( T aKaRa公司) , 大
肠杆菌( E . col i)菌株为 DH5A(天根公司) ;植物表达
载体 pCAMBIA1302、根癌农杆菌菌株 LBA4404均
由本实验室保存。质粒 pDHA 和 pROK. T G1LK
均由意大利 CNR的 Michele Bel lucci博士惠赠。
1. 3 工具酶及主要试剂
植物基因组 DNA小量提取试剂盒购自北京普
博欣生物公司, DNA 片段回收试剂盒为美国 Pro-
mega公司产品, LongAmp T aq、T 4 DNA 连接酶和
各种限制性内切酶购自美国 NEB 公司, P rimeST-
AR TM HS DNA Polymerase 购自 T aKaRa 公司, 其
余常规药品均为国产或进口分析纯级。
1. 4 受体材料培养
洋葱和烟草组织培养的基本培养基为 MS 培养
基( M urashige and Skoog, 1962) , pH 5. 8, 121 e 高
压灭菌 20 min。
将洋葱的外皮剥去,取中间幼嫩部位的表皮细胞。
用手术刀在洋葱表皮切下约 3 cm@ 3 cm的小块,揭下
表皮细胞的一角,沿对角线方向轻轻地撕下,铺平放于
MS培养基中。25 e培养 4 h,准备基因枪轰击。
挑选饱满的烟草种子, 用 70%酒精振荡 30 s,
放入 0. 1% HgCl2 溶液振荡灭菌 8- 10 min, 无菌
水冲洗 4~ 6次, 用无菌滤纸吸去多余水分,接种于
无外源激素的 MS 培养基。培养温度 25 ? 1 e , 光
照周期 12 h/ d,光照强度 3000 Lux。取 20- 30 d的
无菌苗叶片作为遗传转化的受体。
1. 5 表达载体构建
以 pROK. T G1LK 和 pDHA 质粒 DNA 为模
板,由 Invit rogen 公司分别合成 C- z ein 基因引物
P1/ P2和 z eolin基因引物 P3/ P4[ 15]。PCR 采用 25
LL 反应体系, 含 5 @ Pr imeST ARTM Buffer 5 LL,
dNTP 2 LL, 上下游引物 ( 10 LM ) 各 1 LL, 模板
DNA 0. 5 Lg, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase
1. 5U。PCR 反应程序 ( 2 Step 法) : 95 e , 5 min;
98 e , 10 sec, 68 e 4 min, 30 cycly es; 72 e , 8 min。
回收纯化目的条带,与 pMD18-T 载体连接, 重组质
粒分别命名为 pMD18zein和 pMD18zeolin。
用 Bg l Ò/ Nco Ñ双酶切质粒 pMD18zein 和
pMD18zeolin,回收纯化 C- z ein片段和 z eolin 片段,
定向插入到经相同酶切的植物表达载体 pCAM-
BIA1302中, 重组表达载体分别命名为 pCBz ein和
pCBz eol in。
1. 6 C-zein和 zeol in 基因转化烟草
挑取 pCBz ein/ LBA4404、pCBz eolin/ LBA4404
和 pCAMBIA1302/ LBA4404 单菌落, 分别接种于
20 mL 附加 15 mg/ L Rif、50 mg/ L Str、50 mg / L
Kan的 YM 液体培养基中, 28 e 振荡过夜培养至
OD600为 0. 6~ 0. 8。4000 rpm ,离心 10 m in, 用 MS
液体培养基重新悬浮菌体, 并稀释至原体积的 20~
50倍,用于烟草叶盘的侵染。取20- 30 d的烟草无
菌苗叶片,用打孔器打成0. 5 cm @ 0. 5 cm 左右的叶
盘,在制备好的农杆菌菌液中侵染 10 min 后, 用无
菌滤纸吸干植物材料表面的菌液, 接种到加盖一层
无菌滤纸的共培养培养基上。28 e 暗培养 3 d 后,
转至芽诱导分化的筛选培养基上。
烟草共培养培养基: M S 培养基+ 0. 1mg / L
IAA+ 1. 0 mg/ L 6-BA;筛选培养基: MS 培养基+
0. 1 mg/ L IAA+ 1. 0 mg/ L 6-BA+ 500 mg / L Cef
+ 50 mg/ L H yg; 诱导生根培养基: M S 培养基+
300 mg/ L Cef+ 25 mg/ L H yg。
707
草 地 学 报 第 17卷
1. 7 烟草抗性再生植株的 PCR检测
参考普博欣公司植物基因组 DNA 小量提取试
剂盒说明书提取烟草转化植株的基因组 DNA,以此
为 PCR模板。根据 C- z ein和 z eol in 基因的开放读
码框序列分别设计 PCR引物 P5/ P6与 P7/ P8 [ 15]。
以非转基因烟草植株作为阴性对照,分别以质
粒 pCAMBIA1302、pCBz ein和 pCBz eol in作为阳性
对照。PCR反应程序为 95 e , 5 m in; 95 e , 10 sec,
55 e , 30 sec, 65 e , 1 min, 35, cycles; 65 e , 8 m in。
取 4 LL PCR产物在浓度为 1. 2%的琼脂糖凝胶上
进行电泳检测。
1. 8 绿色荧光蛋白的检测
1. 8. 1 z eol in和 C- z ein蛋白的瞬时表达检测 利
用基因枪轰击法分别将质粒 pCBz eol in、pCBz ein和
pCAMBIA1302 中的 z eolin-GFP、C-z ein-GFP 和
GFP 基因转化洋葱表皮细胞。将轰击后的洋葱表
皮细胞置于 25 e , 暗培养 48 h后,用共聚焦显微镜
(型号: Nikon TE2000E)蓝色激发光( 488 nm) ,目镜为
10@ ,激发并检测洋葱表皮细胞中绿色荧光的表达情
况。以转化 GFP 基因的洋葱表皮细胞作为对照。
1. 8. 2 z eolin和 C- z ein蛋白在烟草中的表达检测
将 PCR检测为阳性的抗性烟草无菌苗 25 e , 暗培
养 48 h。取经暗培养处理的抗性烟草无菌苗叶片 1
g,剪成 2~ 3 cm 长条或小块( 1 mm2 ) , 下表皮朝下
置于 8~ 10 mL CPW9溶液中[ 16] ,回收纯化原生质
体,压片,置于共聚焦显微镜(型号: Nikon TE2000E)
下观察 GFP 的表达情况,蓝色激发光( 488 nm) ,目镜
为10 @。以转 GFP 烟草植株作为对照。
2 结果与分析
2. 1 表达载体 pCBzein和 pCBzeol in的构建
将重组质粒载体 pMD18z ein 和 pMD18z eolin
进行 BglÒ/ Nco Ñ双酶切鉴定, 由图 1可知,可以切
出 C- z ein(约 720 bp)和 z eolin(约 1. 6kb)片段。
将质粒 pMD18z ein 和 pMD18z eol in 双酶切,
回收 C-z ein 和 z eolin 片段, 将其分别与 pCAM-
BIA1302线性片段进行定向连接, 重组获得植物表
达载体 pCBz ein和 pCBz eol in。EcoRÑ / BglÒ双酶
切质粒 pCBz ein 和 pCBz eol in 的酶切图谱表明
C- z ein 和 z eol in 片段已经插入植物表达载体
pCAMBIA1302中(图 2)。并将鉴定为阳性的菌液
送往中国农业科学院重大科学工程开放实验室测
序,结果证明插入的目的基因与 C- z ein和 z eol in 基
因序列相一致。
采用冻融法将质粒 pCBz ein、pCBzeol in和 pCAM-
BIA1302分别导入 LBA4404 感受态细胞。提取质粒
DNA, PCR鉴定后,即可用于洋葱和烟草转化。
2. 2 C-zein和 zeol in 基因转化烟草
用 pCAMBIA1302/ LBA4404、pCBz ein/ LBA4404
和 pCBz eol in/ LBA4404分别侵染烟草叶盘, 共培养
3 d后, 接种至筛选培养基中。14 d 后诱导分化出
抗性不定芽 (图 3-A ) , 抗性芽的平均诱导率为
57. 5%。对照(未侵染的烟草叶盘)逐渐褪绿,白化
死亡(图 3-C) , 说明潮霉素( Hyg )选择基因得到了
正确表达并且显示了其应有的作用。当抗性芽长至
2~ 3 cm 时(图 4-A) , 将其移入生根培养基中诱导
生根。约 10 d后, 一般每株幼苗均可长出 12~ 20
条长约 6 cm 的根(图 4-B) , 去掉封口膜在培养间中
锻炼 3 d后,小心取出幼苗,将根部培养基用自来水
708
第 6期 关宇等:含硫氨基酸蛋白与 GFP 融合基因的表达分析
冲洗干净后,移栽到蛭石和泥土( 1B 1)的花盆中。为
保持环境湿润在花盆上罩塑料袋, 3- 5 d后逐渐打开
塑料袋扎口,成活率可达 95%。温室培养,最终共获
13株抗性再生植株,且生长正常(图 4-D~ F)。
2. 3 烟草抗性植株的 PCR检测
用C- z ein( P5/ P6)、z eolin( P7/ P8)和 GFP( F: 5c-
GATACGCACAATCCCACT -3c; R: 5c-TATGTTG-
CATCACCTTCACCC-3c)基因的特异引物,以抗性再
生植株和非转基因植株的基因组 DNA 为模板,进行
PCR扩增。电泳结果显示转化 C- z ein基因的 4株样
品均可扩增出 290 bp左右的预期片段(图 5-A) ,转化
z eolin基因的 7株样品均可扩增出 890 bp左右的预
期片段(图 5-B) ,转化 GFP 基因的 2株样品均可扩
增得到 200 bp的预期片段(图 5-C) ,非转基因烟草
植株均未扩增出任何目的条带, 表明 C- z ein、z eolin
和 GFP 基因已分别整合到烟草基因组中。
2. 4 GFP蛋白的检测
2.4. 1 C- z ein和 z eolin蛋白的瞬时表达检测 将去
掉终止密码子的 C- z ein和 z eolin开放阅读框连接在
GFP 基因的 5c端, 使 C- z ein-GFP 和 z eolin-GFP 基因
在CaMV35S启动子的驱动下表达,以基因枪轰击法
转化洋葱表皮细胞后, 获得瞬时表达, 在共聚焦显微
镜下观测绿色荧光,由图 6可知, 转化 C- z ein-GFP 和
z eolin-GFP的洋葱表皮细胞在细胞核、内质网及细
胞壁中均检测到绿色荧光(图 6-B,-D) ,以转化 GFP
基因的洋葱表皮细胞作为对照, 其绿色荧光分布在
整个细胞中,细胞壁中有微弱荧光(图 6-F) , 推测 C-
z ein和 z eol in蛋白属于分泌型蛋白。
2. 4. 2 C- z ein和 z eol in 蛋白在烟草中的表达检测
通过农杆菌侵染法,筛选得到长势良好的转 C- z e-
in-GFP、z eol in-GFP 和 GFP 基因烟草植株。取其
幼嫩叶片置于酶解液 12- 14 h, 回收纯化原生质
体, 压片, 置于共聚焦显微镜下观察 C- z ein-GFP、
z eol in-GFP 和 GFP 的表达情况。由图 7 可知, 转
C- z ein和 z eol in 基因烟草叶片分离的原生质体均激
发出较强的绿色荧光点, 呈颗粒状(直径约 1~ 2
Lm)不均匀地分布于整个原生质体中(图 7-B, D) ,
以转化 GFP 的烟草抗性植株作为对照,其烟草叶片
分离的原生质体在共聚焦显微镜的蓝色激发光下,
绿色荧光较为均匀地分布在整个细胞中 (图 7-F) ,
推测 z eolin 和 C- z ein 蛋白可能以蛋白体 ( Protein
bodies)的形式不均匀地分布在整个细胞中, 这与
Bel lucci等的研究结果相一致 [ 9]。
3 讨论与结论
3. 1 本试验中目的基因 C- z ein和 z eol in 具有重复
序列区和 GC 含量高等特点,在进行载体构建试验
前研究了 Ex T aq、LA Taq、Py robest DNA Poly-
merase、Pr imeST ARTM HS DNA Po lymerase 4 种
DNA 聚合酶的保真性。结果表明由高到低依次为:
P rimeST ARTM HS DNA Polymerase、Ex Taq、LA
Taq、Pyrobest DNA Polymerase。因此, 本试验选用
PrimeSTAR
TM
HS DNA Polymerase对目的基因进行
克隆, PCR反应体系与文献[ 15]中的有所不同。
3. 2 为检验所构建的植物表达载体的正确性, 本试
验用植物表达载体 pCBz ein、pCBz eol in进行模式植
物烟草的转化。在试验中, 经过 Hyg 筛选和 GFP
绿色荧光蛋白观察, 分别证明了 Hyg 选择基因和
GFP 报告基因正确无误, 均得到正确表达。在所构
建的植物表达载体中, CaMV35S 启动子、目的基因
(C- z ein和 z eol in 基因)和 GFP 报告基因按照顺序
紧密相连在一起, 报告基因得到表达,连锁在两者之
间的 C- z ein 和 z eolin 基因丢失的几率几乎为零。
而且,通过 PCR方法检测分别证明 C- z ein和 z eol in
基因的存在, 表明植物表达载体 pCBz ein和 pCBz e-
ol in可用于牧草遗传转化的研究。
3. 3 蛋白质分子的功能与其在细胞内的定位密切
相关,同时也决定分子功能的特异性。绿色荧光蛋
白( g reen f luo rescent protein, GFP)在真核或原核
细胞内表达后,可在蓝光或紫光的激发下产生明亮
的绿色荧光[ 17] 。GFP 荧光的产生无需辅助因子和
底物。GFP 荧光的检测可以在活细胞或组织中进
行,也可是固定样品。绿色荧光蛋白在转基因植物
研究中已经成为一个非常有效的报告基因。GFP
已经转化拟南芥、烟草等植物,研究表明 GFP 不会
对植物的生长发育产生毒害 [ 18~ 21]。GFP 的融合表
达载体可作为基因表达的报告基因和用于基因编码
蛋白的定位,并可通过共聚焦显微镜和流式细胞仪
进行研究。本试验通过基因枪轰击法, 将植物表达
载体 pCBz eol in和 pCBz ein转化洋葱表皮细胞后,
在共聚焦显微镜下 z eolin-GFP 和 C- z ein-GFP 基因
的瞬时表达, 结果显示在洋葱表皮细胞的细胞核、内
质网及细胞壁上均有绿色荧光,表明 z eol in和 C- z ein
蛋白在细胞核、内质网及细胞壁上表达。虽然通过
709
草 地 学 报 第 17卷710
第 6期 关宇等:含硫氨基酸蛋白与 GFP 融合基因的表达分析
PredictNLS serv er ( Predict ion and analy sis of nu-
clear localization signals, www . rost lab. Org / o ld
_before2008/ predictNLS/ )等核定位信号工具对序
列进行分析,没有发现 z eol in和 C- z ein氨基酸序列
内有某些核定位信号,但是 z eol in和 C- z ein 蛋白的
核定位现象也许是其执行功能所必须的, 这就可能
711
草 地 学 报 第 17卷
存在着另一种分子机制来调控 z eolin 和 C- z ein 蛋
白的核定位现象。此外, 本实验筛选得到转 z eolin
和 C- z ein的烟草抗性植株,用共聚焦显微镜观察烟
草原生质体中外源蛋白的表达情况, 表明 z eol in 和
C- z ein蛋白以颗粒的形式不均一的分布在整个胞浆
中,推测 z eol in和 C- z ein 蛋白具有一定特异性, 分
布在内质网、线粒体或高尔基体等细胞器中。这与
玉米醇溶蛋白的合成运输相一致, Gehring 研究指
出新合成的醇溶蛋白沉积在内质网内腔中, 内腔开
始膨胀, 脱离内质网形成 1~ 2 Lm 的蛋白体 [ 22] , 本
试验结果表明外源基因 z eolin 和 C- z ein在烟草中
进行了正确的表达, 为 z eolin和 C- z ein 正确执行其
功能奠定了基础。
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