全 文 ：书犇犗犐：１０．１１６８６／犮狔狓犫２０１４３０７ 犺狋狋狆：／／犮狔狓犫．犾狕狌．犲犱狌．犮狀
张玉，白史且，李聪．农杆菌介导含硫氨基酸γｚｅｉｎ转化菊苣的初步研究．草业学报，２０１５，２４（９）：７３７９．
ＺＨＡＮＧＹｕ，ＢＡＩＳｈｉＱｉｅ，ＬＩＣｏｎｇ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｈｉｃｏｒｙｕｓｉｎｇｔｈｅｓｕｌｐｈｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｇｅｎｅ，γｚｅｉｎ，ｍｅｄｉａｔｅｄｂｙ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿
狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀．ＡｃｔａＰｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｅＳｉｎｉｃａ，２０１５，２４（９）：７３７９．
农杆菌介导含硫氨基酸γ狕犲犻狀转化菊苣的初步研究
张玉１，白史且１，李聪２
（１．四川省草原科学研究院，四川 成都６１１７３１；２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１０００９４）
摘要：含硫氨基酸具有动物营养与免疫相关的重要生理功能，为提高菊苣中含硫氨基酸含量，采用根癌农杆菌介导
法将玉米种子贮藏蛋白含硫氨基酸基因γｚｅｉｎ和绿色荧光蛋白ＧＦＰ融合基因转入到菊苣无菌苗叶片中，经过共培
养、潮霉素抗性筛选、分化、再生和炼苗，得到抗性植株。对抗性植株进行ＰＣＲ、ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ、斑点杂交和ＲＴ－
ＰＣＲ分析，结果表明，外源目的基因已经整合到菊苣基因组中并且得到了表达，为提高菊苣含硫氨基酸含量，改善
其品质奠定了基础。
关键词：γｚｅｉｎ基因；菊苣；农杆菌转化；含硫氨基酸
犘狉犲犾犻犿犻狀犪狉狔狊狋狌犱犻犲狊狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犮犺犻犮狅狉狔狌狊犻狀犵狋犺犲狊狌犾狆犺狌狉犪犿犻狀狅犪犮犻犱犵犲狀犲，γ狕犲犻狀，
犿犲犱犻犪狋犲犱犫狔犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀
ＺＨＡＮＧＹｕ１，ＢＡＩＳｈｉＱｉｅ１，ＬＩＣｏｎｇ２
１．犛犻犮犺狌犪狀犌狉犪狊狊犾犪狀犱犛犮犻犲狀犮犲犃犮犪犱犲犿，犆犺犲狀犵犱狌６１１７３１，犆犺犻狀犪；２．犐狀狊狋犻狋狌狋犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲，犆犺犻狀犲狊犲犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾
犛犮犻犲狀犮犲，犅犲犻犼犻狀犵１０００９４，犆犺犻狀犪
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｓｕｌｆｕｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｍｉｎｏａｃｉｄｓｈａｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｒｅｌａｔｅｄｔｏａｎｉｍａｌｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｓｕｌｆｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｈｉｃｏｒｙ，ｌｅａｖｅｓｏｆｃｈｉｃｏｒｙｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅ
Ｓｕｌｐｈｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｇｅｎｅγｚｅｉｎ，ａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｏｌａｍｉｎｓｔｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍ犣犲犪犿犪狔狊ａｎｄａｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）ｇｅｎｅｕｓｉｎｇＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．Ａｆｔｅｒｃｏｃｕｌｔｕｒｅ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．ＲｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇＰＣＲ，ＰＣＲ
ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ｄｏｔｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄＲＴＰＣＲ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅγｚｅｉｎｇｅｎｅｓｈａｄｂｅｅｎｉｎｔｅ
ｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｃｈｉｃｏｒｙａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｎａｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌｅｖｅｌｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：γｚｅｉｎｇｅｎｅｓ；ｃｈｉｃｏｒｙ（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊）；ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｓｕｌｐｈｕｒａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ
蛋白短缺包括蛋白含量短缺和营养品质低下，是２１世纪全球性的严重问题，在尽快提高作物品种的蛋白质
含量的同时，积极改善蛋白质的氨基酸组成，提高营养价值，具有重要意义。
含硫氨基酸如甲硫氨酸（也称为蛋氨酸，ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍｅｔ）、胱氨酸、半胱氨酸（ｃｙｓｔｅｉｎｅ，Ｃｙｓ）等是合成蛋白
质的重要氨基酸，蛋白质中含硫氨基酸的含量与种子萌发、生长和作物品质均有密切关系。含硫氨基酸是人体必
需氨基酸之一，也是形成动物毛发角蛋白的必需组分，并且研究表明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛产量
第２４卷 第９期
Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．９
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２０１５年９月
Ｓｅｐ，２０１５
收稿日期：２０１４０７０７；改回日期：２０１５０３１０
基金项目：四川省十二五牧草育种攻关（２０１１ＮＺ００９８１１），四川省应用基础项目（２０１３ＪＹ０１１１）和国家牧草产业技术体系阿坝综合试验站资助。
作者简介：张玉（１９７５），女，四川仁寿人，博士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈｙｆｏｒａｇｅ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ．
２２％以上，增产的幅度在２２％～１０４％［１２］，同时还可增加牲畜的重量，含硫氨基酸的这种独特作用是别的氨基酸
不具有的［２］。如能提高牧草或动物饲料中含硫氨基酸的含量，对提高动物重量、改善动物品质，具有重要的经济
价值。是稳定畜产品价格和确保畜产品安全的有效途径之一［３］。
菊苣（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊）为菊科菊苣属多年生宿根草本植物，其适应性广，根系发达，产量高，营养丰富，粗
蛋白质１６．４４％～２７．３５％，菊苣常用作牧草饲料、蔬菜、制糖原料及咖啡的替代品，也是工业和药品的生产原
料［３４］。虽然菊苣蛋白质含量高，但是蛋白质中氨基酸组成不平衡，含硫氨基酸含量较低。
近年来，基因工程的诞生使人类的农业生产史发生了巨大的变化，通过转基因技术提高植物抗性、改善织物
品质，具备并已展现了巨大的应用价值和经济价值［５］。目前已经从玉米（犣犲犪犿犪狔狊）、水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）、向日
葵（犎犲犾犻犪狀狋犺狌狊犪狀狀狌狌狊）及豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）等中分离得到富含硫氨基酸的蛋白及其编码基因。玉米醇溶蛋
白（ｚｅｉｎ）是玉米种子中的主要贮藏蛋白质，可分为α、β、γ和δｚｅｉｎ４种主要类型。其中β、γ和δｚｅｉｎ富含蛋氨
酸和半胱氨酸２种含硫氨基酸［６］。通过转γｚｅｉｎ基因来提高植物的含硫氨基酸已经在拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊
狋犺犪犾犻犪狀犪）［７］、烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）［８］、白三叶草（犜狉犻犳狅犾犻狌犿狉犲狆犲狀狊）［９］、紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）［１０１１］等
中取得良好的结果。γｚｅｉｎ基因的成功转入和表达为增加牧草可食性组织的含硫氨基酸含量提供了新的途径，
但这在菊苣上还没见报道。本文通过农杆菌介导将ＧＦＰ和γｚｅｉｎ融合基因转化菊苣，对获得的转基因植株进行
检测，以期提高菊苣植株含硫氨基酸的含量，改善菊苣品质，同时也为菊苣新品种的培育提供中间材料。
１ 材料与方法
图１ 植物表达载体狆犆犅犌犉犘狕犲犻狀结构
犉犻犵．１ 犛犮犺犲犿犪狋犻犮犿犪狆狊狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀
狏犲犮狋狅狉狊狆犆犅犌犉犘狕犲犻狀
ＬＢ为左边界ＬｅｆｔＴｂｏｒｄｅｒ；ＲＢ为右边界ＲｉｇｈｔＴｂｏｒｄｅｒ．
１．１ 植物材料
普那菊苣（犆犻犮犺狅狉犻狌犿犻狀狋狔犫狌狊ｃｖ．ｐｕｎａ）由四川省
草原科学研究院提供。普那菊苣是一个产量高、抗虫
性强的国家登记牧草品种。
１．２ 质粒及菌种
本实验中使用根癌农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４、植物表
达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２和γｚｅｉｎ基因均由中国农业
科学研究院畜牧兽医研究所李聪实验室提供。质粒图
谱见图１。该质粒包括ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、γｚｅｉｎ、ＧＦＰ
蛋白基因。
１．３ 试验用培养基成分
见表１。
１．４ 方法
１．４．１ 菊苣无菌苗的获得 选取饱满菊苣种子，经
体积分数７５％乙醇浸泡２ｍｉｎ，倒出浸泡液，再用
０．１％的升汞浸泡１０ｍｉｎ，无菌水反复清洗４～５次，
无菌滤纸吸干水分后，接种于１／２ＭＳ培养基上，放于温室，待植株成苗。
表１ 培养基成分
犜犪犫犾犲１ 犜犺犲犮狅犿狆狅狊犻狋犻狅狀狅犳犿犲犱犻犪
培养基 Ｍｅｄｉａ 组成Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
预培养培养基Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＩＢＡ
共培养培养基Ｃｏｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａ ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＩＢＡ＋１００μｍｏｌ／ＬＡＳｐＨ５．４～５．８
分化培养基Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ ＭＳ＋２．０ｍｇ／Ｌ６ＢＡ＋０．２ｍｇ／ＬＩＢＡ＋２０ｍｇ／ＬＨｙｇ＋５００ｍｇ／ＬＣｅｆ
生根培养基Ｒｏｏｔｍｅｄｉａ １２／ＭＳ＋０．１ｍｇ／ＬＮＡＡ＋１０ｍｇ／ＬＨｙｇ＋２５０ｍｇ／ＬＣｅｆ
４７ 草 业 学 报 第２４卷
１．４．２ 菌液的活化 参照王关林和方宏药（２００２）的方法，略有变动。取－８０℃加入１５％甘油保存的菌液于
碎冰上融化，用接种针蘸取少量菌液，在添加有５０ｍｇ／ＬＫａｎ和５０ｍｇ／ＬＳｔｒ的固体平板培养基上划线，于２８℃
恒温培养箱中倒置暗培养２ｄ。待长出单菌落后，用牙签挑取单菌落于含５０ｍｇ／ＬＫａｎ和５０ｍｇ／ＬＳｔｒ的液体
ＬＢ或ＹＭＢ培养基中，振荡培养１６～２４ｈ至对数生长期，然后按１∶１００比例转入不含抗生素的新鲜液体培养基
中继续振摇培养至ＯＤ６００达０．６左右。无菌条件下取新鲜菌液于５０ｍＬ离心管中于常温５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０
ｍｉｎ，去除上清液，用１／２ＭＳ无菌液体培养基重悬沉淀至需要的ＯＤ值，用于侵染转化。
１．４．３ 转基因抗性植株的获得 选取无菌苗中上部充分展开、生长健壮、均匀一致的幼嫩叶片，用５～１０ｍｍ
打孔器制取叶盘外植体，将其接种在预培养基中预培养２ｄ后，用ＯＤ６００＝０．４Ａｂｓ农杆菌菌液浸泡１０ｍｉｎ，其
间不断摇动，取出后用无菌滤纸吸取受体表面多余菌液，迅速将受体材料移置铺有一层无菌滤纸的共培养基上，
黑暗中共培养到有肉眼可见微菌落。共培养结束后，将其转入含２５ｍｇ／ＬＨｙｇ和５００ｍｇ／ＬＣｅｆ的筛选培养基
中筛选得到抗性芽。当抗性芽长到１ｃｍ时，转入含１５ｍｇ／ＬＨｙｇ和５００ｍｇ／ＬＣｅｆ的分化培养基中扩繁，将扩
繁芽转入含１０ｍｇ／ＬＨｙｇ和２５０ｍｇ／ＬＣｅｆ的生根培养基中进行生根培养，直到长成完整的小植株，然后驯化移
栽，得到转基因抗性植株。
１．４．４ 抗性植株的检测 １）ＰＣＲ检测
用ＣＴＡＢ法和普博欣植物基因组ＤＮＡ小量提取试剂盒提取抗性植株及对照（未转化植株）的总ＤＮＡ，根据
标记基因ＧＦＰ和目的基因γｚｅｉｎ序列用ｐｒｉｍｅｒ５．０设计引物进行ＰＣＲ扩增，ＧＦＰ引物序列为：
５′ＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧ３′
５′ＣＧＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧ３′
预期扩增长度为５３８ｂｐ。
γｚｅｉｎ引物序列为：
５′ＴＧＣＣＡＣＴＡＣＣＣＴＡＣＴＣＡＡＣＣＧ３′
５′ＧＧＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴ３′
预期扩增长度为２８３ｂｐ。
以质粒ｐＣＢＧＦＰｚｅｉｎ作为阳性对照，以未转化的植株作为阴性对照。ＰＣＲ反应体系为：１０×ＰＣＲＲｅａｃｔｉｏｎ
Ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，基因
组ＤＮＡ１μｇＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μＬ）０．５μｇ，添加ｄｄＨ２Ｏ 补充到２５μＬ。ＰＣＲ反应程序为：９４℃４
ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５０℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３０个循环，最后７２℃１０ｍｉｎ。电泳完后，取５μＬＰＣＲ扩增产物在浓度
为１．５％的琼脂糖凝胶上电泳，检测扩增结果。
２）ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ
以质粒ｐＣＢＧＦＰγｚｅｉｎＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ，对ＰＣＲ产物进行回收，用回收产物做探针标记，具体标记方
法见Ｒｏｃｈｅ公司的ＤＩＧＨｉｇｈＰｒｉｍｅＤＮＡＬａｂｅｌｉｎｇａｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＫｉｔＩ，然后对ＰＣＲ产物进行电泳、转
膜、预杂交、杂交和显色检测，具体方法见Ｒｏｃｈｅ公司的说明书。
３）斑点杂交
对阳性植株ＤＮＡ变性，冰中速冷。在带正电荷尼龙膜上用钝铅笔划０．５ｃｍ×０．５ｃｍ方格网，先用蒸馏水
浸润尼龙膜，然后用２０×ＳＳＣ浸泡，用Ｔｉｐ将变性ＤＮＡ点于膜上，以质粒ｐＣＢＧＦＰｚｅｉｎＤＮＡ为阳性对照，以未
转基因植株为阴性对照，每个样点２～１０μｇＤＮＡ，室温晾干，烘烤，进行预杂交、杂交和显色检测
［１２］。
４）转基因植株ＲＴ－ＰＣＲ检测
利用ＴＲＩｚｏｌ法对菊苣阳性转化植株和非转化植株的总ＲＮＡ进行提取、纯化，然后对ＲＮＡ进行反转录。逆
转录反应体系为２５μＬ，含模板ＲＮＡ２μｇ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５Ｐｒｉｍｅｒ１μＬ，ＭＭＬＶＲｅａｃｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ５μＬ，Ｄｎｔｐ（１０
ｍｍｏｌ／Ｌ）５μＬ，ＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ１μＬ，ＭＭＬＶＲＴ２００Ｕ，加ＤＥＰＣ水补足２５μＬ。用γｚｅｉｎ基因引物对
反转录的ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ检测和电泳分析。
５７第９期 张玉 等：农杆菌介导含硫氨基酸γｚｅｉｎ转化菊苣的初步研究
２ 结果与分析
２．１ 转基因菊苣获得
菊苣无菌苗叶片预培养２ｄ后，叶片边缘开始膨大，用含ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ的ＬＢＡ４４０４浸染，浸染后的菊苣叶片
（图２Ａ）在黑暗下共培养２～３ｄ，转于含２０ｍｇ／ＬＨｙｇ和５００ｍｇ／ＬＣｅｆ的筛选培养基上，２０ｄ后分化出具有抗
性的不定芽（图２Ｂ），将抗性芽转入含１５ｍｇ／ＬＨｙｇ和５００ｍｇ／ＬＣｅｆ的分化培养基中扩繁１～２周 （图２Ｃ），再
转入含１０ｍｇ／ＬＨｙｇ和２５０ｍｇ／ＬＣｅｆ的生根培养基中进行生根培养，２～３周后植株生根（图２Ｄ）发育成完整植
株（图２Ｅ），炼苗室内盆栽，最终获得４８株形态特征正常的菊苣抗性再生植株 （图２Ｆ）。
图２ 转化菊苣分化与再生
犉犻犵．２ 犇犻犳犳犲狉犲狀狋犻犪狋犻狅狀犪狀犱狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱犮犺犻犮狅狉狔
Ａ：浸染后的菊苣叶片Ｌｅａｆｓｏａｋｅｄｏｆｃｈｉｃｏｒｙ；Ｂ：不定芽的筛选（箭头指向为抗性芽）ＳｃｒｅｅｎｔｈｅＨｙｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓ（ｔｈｅａｒｒｏｗｅｄ
ｐｌａｃｅｓａｒｅｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｂｕｄｓ）；Ｃ：抗性植株生根培养ＲａｄｉｃａｔｉｎｇｏｆｔｈｅＨｙｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓ；Ｄ：抗性芽的分化ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＨｙｇ
ｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｂｕｄｓ；Ｅ：完整的抗性植株Ｉｎｔａｃｔｐｌａｎｔ；Ｆ：移栽成活的抗性植株 ＴｈｅｓｕｒｖｉｖａｌＨｙｇｒｅｓｉｓｔａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄｔｏ
ｐｌａｔｅ．
２．２ 抗性植株的ＰＣＲ检测
图３ 转基因植株γ狕犲犻狀犘犆犚检测
犉犻犵．３ 犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳γ狕犲犻狀犵犲狀犲犳狉狅犿狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱犮犺犻犮狅狉狔
１：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２：ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ质粒ＰｌａｓｍｉｄｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ；
３：阴性对照（非转基因菊苣）Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）；４～１０：转
化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
提取转化抗性植株ＤＮＡ，用ＧＦＰ基因和γｚｅ
ｉｎ基因引物分别对转化植株及非转基因植株总
ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，结果显示转化的４８株抗性再
生植株中有２９株能扩增出γｚｅｉｎ基因的２８３ｂｐ预
期片段，只列出部分ＰＣＲ图（图３），有２６株能扩增
出ＧＦＰ基因５３８ｂｐ的预期片段（图４，只列出部分
ＰＣＲ图），而非转基因植株均未扩增出任何条带（图
３，图４）。
２．３ 抗性植株的ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ检测
对ｇｆｐ和γｚｅｉｎ基因ＰＣＲ检测都为阳性的植
株进行γｚｅｉｎＰＣＲ———Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，检测结果（图５）表明：检测的植株都为阳性，初步说明外源目的基因γｚｅ
ｉｎ已经转化到菊苣基因组中。
６７ 草 业 学 报 第２４卷
图４ 转基因植株犵犳狆犘犆犚检测
犉犻犵．４ 犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犵犳狆犵犲狀犲犳狉狅犿狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱犮犺犻犮狅狉狔
图５ 转基因植株γ狕犲犻狀犘犆犚犛狅狌狋犺犲狉狀检测
犉犻犵．５ 犘犆犚犛狅狌狋犺犲狉狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳γ狕犲犻狀犵犲狀犲犳狉狅犿狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱犮犺犻犮狅狉狔
Ｍ：ＤＬ２０００ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ；Ｐ：ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ质粒ＰｌａｓｍｉｄｐＣＢ
ｇｆｐｚｅｉｎ；ＣＫ：阴性对照（非转基因菊苣）Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）；１～７：转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
１：ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ质粒 ＰｌａｓｍｉｄｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ；２：阴性对照（非转基因
菊苣）Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）；３～７：转化植株 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｐｌａｎｔｓ．
２．４ 抗性植株的斑点杂交检测
图６ 转基因植株γ狕犲犻狀斑点杂交检测
犉犻犵．６ 犇狅狋犫犾狅狋犺狔犫狉犻犱犻狕犪狋犻狅狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳γ狕犲犻狀犵犲狀犲
Ｐ：ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ质粒ＰｌａｓｍｉｄｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ；ＣＫ：阴性对照（非转基因
菊苣）Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）；１～８：转化植株 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｐｌａｎｔｓ．
图７ 提取的植株犚犖犃
犉犻犵．７ 犚犖犃犲狓狋狉犪犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋狊
图８ 转基因植株γ狕犲犻狀犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．８ 犚犜－犘犆犚犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳γ狕犲犻狀犵犲狀犲
１：ＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；２：ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ质粒ＰｌａｓｍｉｄｐＣＢｇｆｐｚｅｉ；
ＣＫ：阴性对照（非转基因菊苣）Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）；３～８：
转化植株Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｐｌａｎｔｓ．
对上面检测均为阳性的转基因植株ＤＮＡ进行
斑点杂交，所用探针为ｐＣＢｇｆｐｚｅｉｎ质粒ＤＮＡ的
γｚｅｉｎＰＣＲ回收产物，杂交结果显示（图６）：除阴性
对照外，转基因植株都有杂交信号，说明γｚｅｉｎ已经
整合到菊苣基因组中。
２．５ 抗性植株的ＲＴ－ＰＣＲ检测
采用ＴＲＩｚｏｌ法对菊苣转化植株和未转化植株
提取ＲＮＡ，经检测ＲＮＡ质量良好（图７），经过ＲＴ
－ＰＣＲ检测，结果表明（图８），除１株为阴性外其余
都为阳性，表明大部分基因在转基因菊苣植株中得
到了表达。检测表明阴性的植株是假阳性，还是在
ＲＮＡ上沉默，还有待Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的进一步检测。
３ 结论与讨论
改进农作物品质历来为各国科学工作者所重
视。菊苣中缺乏蛋氨酸和半胱氨酸，蛋氨酸和半胱
氨酸成了其营养限制，菊苣是一个多用途的经济作
物、药用植物和饲料作物，提高其蛋氨酸和半胱氨
酸含量具有巨大的潜在经济价值。该论文以菊苣无
菌苗叶片为外植体，利用根癌农杆菌介导法对含硫
氨基酸γｚｅｉｎ基因和ＧＦＰ基因的融合基因转移到
菊苣的研究，迄今还未见报道。在菊苣中利用基因
工程法进行基因转化的报道并不多见，目前在国内
外报道的只有与花发育相关 ＡＦＬ２基因［１３］、βｇｌｕ
ｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ｕｉｄＡ）基因［１４］、抗坏血酸过氧化物酶
（ＡＰＸ）基因［１５］、ｐＢＩ１２１ＧＦＰ载体［１６］、菊苣中分离
克隆的ＤＲＥＢ基因［１７］和茅液泡膜Ｎａ＋／Ｈ＋逆向转
运蛋白基因（ＡＬＮＨＸ）［１８］被导入菊苣，并且这些报
道都只做了最初的ＰＣＲ检测，没有在ＲＮＡ的表达
上进行检测。
７７第９期 张玉 等：农杆菌介导含硫氨基酸γｚｅｉｎ转化菊苣的初步研究
在植物遗传转化中，预培养的主要作用是促进细胞分裂，因为处于分裂状态的细胞更易整合外源ＤＮＡ，提高
转化率。研究发现菊苣预培养时间比较短，只需要２ｄ即可，如果预培养时间超过３ｄ，外植体边缘除了膨大外，
还开始分化出绿点，影响转化效率。根癌土壤农杆菌只能感染植物的损伤部位，在植物细胞损伤及修复过程中，
植物细胞释放出一些化学物质（酚类物质、酸性多糖等），这些诱导物可以通过外膜蛋白将环境中的植物损伤信号
传递到农杆菌细胞内，最终引起ｖｉｒ基因的表达和ＴＤＮＡ的转移。其中诱导效果最佳的为乙酰丁香酮（ＡＳ），它
可以使农杆菌质粒上的ｖｉｒ基因活化，提高转化率。也有报道称ＡＳ对于转化效果没有明显影响。本研究中得出
共培养中ＡＳ浓度对抗性率影响差异显著，其中以浓度为１００μｍｏｌ／Ｌ最佳。有报道ＡＳ对于河北杨的侵染转化
并没有促进效果，随着施加浓度的增加反而还会产生一定的抑制作用。不同研究获得结果不一致，可能与所选用
材料、菌液浓度和菌株的类型有关系。
ＰＣＲ的高度灵敏极易产生假阳性结果。ＤＮＡ插入植物基因组后易发生重排，即使载体上的抗性基因或其
他基因能表达，目的基因也未必完整的存在于转化体中，从而造成检测结果的假阳性。而且，转基因植株存在基
因沉默等现象，影响外源基因的正常表达，因此，转基因ＰＣＲ检测结果可能不是百分之百准确，所以，除了ＰＣＲ
检测外，还有必要在ＤＮＡ水平用点杂交、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ检测，在ＲＮＡ表达水平上用ＲＮＡ－ＰＣＲ进行检测。本
文通过转化叶片进行不同浓度梯度潮霉素的筛选，分化和再生得到了菊苣抗性植株，通过ＰＣＲ、ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ
和斑点杂交检测证明了γｚｅｉｎ基因已经转化到菊苣基因组中。再通过ＲＴ－ＰＣＲ进一步证明了γｚｅｉｎ基因已整
合到菊苣基因组中，并在转录水平上得到了正确表达，并且该转化方法抗性率高，阳性率也较高，为菊苣以后的遗
传转化和育种中间材料的创制奠定了基础。一个完整的转基因植株的检测应该包括ＤＮＡ、ＲＮＡ方面的检测，还
应该包括该基因表达产物的检测。本试验中，γｚｅｉｎ基因表达的产物主要为含硫氨基酸的蛋氨酸和半胱氨酸，但
是由于含硫氨基酸在转基因菊苣中表达量的检测，需要一定量的菊苣干样并打成草粉，因此，该指标只有等到转
基因菊苣单株样品比较多的情况下才能进行测定。
犚犲犳犲狉犲狀犮犲狊：
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