全 文 ：第 26 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 6
2000 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2000
豆科牧草沙打旺抗乙硫氨酸变异系筛选X
罗建平1　贾敬芬2　顾月华1
(1合肥工业大学生物与食品工程系, 安徽合肥, 230069; 2 西北大学生物系, 陕西西安, 710069)
提　要　以N aN 3 诱变处理的沙打旺胚性愈伤组织为材料, 用甲硫氨酸类似物—乙硫氨酸为选择剂, 筛
选到 1 株抗性稳定且能再生植株的抗 0. 6 mmo l L - 1乙硫氨酸变异系。该变异系细胞对乙硫氨酸的抗性
是野生型细胞的 8 倍。当把变异系愈伤组织传入体细胞胚胎诱导培养基上, 平均体细胞胚胎发生频率为
13. 9% , 平均每 g 鲜重愈伤组织可产生 21 个体细胞胚, 分别为野生型细胞的 22. 9% 和 11. 1%。氨基酸
分析表明, 变异系愈伤组织及其再生植株游离甲硫氨酸含量分别是野生型的 2. 5 倍和 4 倍。在含选择剂
的愈伤组织诱导培养基中, 变异系再生植株茎切段愈伤组织诱导率达 72. 1% , 而野生型再生植株茎切
段无愈伤组织形成, 证明变异系对乙硫氨酸的抗性在再生植株的愈伤组织诱导和生长中也得到表达。
关键词　沙打旺; 抗乙硫氨酸变异系; 体细胞胚胎发生; 植株再生
Selection of Eth ion ine-res istan t Var ian t in the Forage L egum e
A straga lus adsu rgens Pa ll.
LUO J ian2P ing1　J IA J ing2Fen2　GU Yue2H ua1
(1 D ep artm en t of B iology and F ood F echnology , H ef ei U n iversity of T echnology , H ef ei 230069; 2D ep artm en t of B iology ,
N orthw est U n iversity , X i′an, 710069)
Abstract　O ne stab le varian t of A strag a lus ad su rg ens resistan t to 0. 6 mm o l L - 1 eth ion ine
w as iso la ted from em b ryogen ic ca lli m u tagen ized w ith 0. 1 m o l L - 1 N aN 3 fo r 3 hou rs. T he
resistance of varian t to eth ion ine w as 7 t im es h igher than tha t of the w ild type. T he varian t
ca lli w ere capab le of regenera t ing p lan t lets th rough som atic em b ryogenesis in the
d ifferen t ia t ion m edium w ithou t eth ion ine, and the m ean frequency of ca lli p roducing som atic
em b ryo s and the num ber of som atic em b ryo s per gram fresh w eigh t ca llu s w ere 13. 9% and
21. 4, on ly 22. 9% and 11. 1% of the w ild type, respect ively. T he varian t ca llu s and its
regeneran ts ana lyzed fo r free am ino acid con ten t w ere found to con ta in 2. 5 t im es and 4 t im es
as m uch m eth ion ine as the w ild type, respect ively suggest ing tha t its resistance to eth ion ine
w as due to the increase in free m eth ion ine level. Stem segm en ts from the varian t regeneran ts
show ed sim ila r ca llu s fo rm at ion on bo th no rm al and 0. 6 mm o lö L eth ion ine2con ta in ing
m edium w h ile stem segm en ts of the w ild type regeneran ts on ly fo rm ed callu s on eth ion ine2
free m edium. T h is resu lt ind ica ted clearly tha t eth ion ine resistance w as exp ressed du ring
ca llu s induct ion and grow th of the varian t.
Key words 　 A strag a lus ad su rg ens Pall. ; E th ion ine2resistan t varian t; Som atic
em b ryogenesis; P lan t regenera t ion
沙打旺 (A strag a lus ad su rg ens Pall. )是我国特有的豆科牧草, 营养丰富, 生产力高, 人工
栽培已近百年[ 1 ]。然而, 同其它豆科植物一样, 沙打旺缺乏必需氨基酸甲硫氨酸, 限制了动
X 本文由国家自然科学基金和博士后科学基金资助。
通讯作者: 罗建平。E2m ail: jp luo@ustc. edu. cn
收稿日期: 1999203226, 接受日期: 1999212218

物对氨基酸的协调吸收, 进而影响畜牧产品的产量和质量[ 2 ] , 因此培育出能过量积累甲硫氨
酸的沙打旺牧草品种对农牧业的发展具有重要价值。植物细胞抗氨基酸及其类似物突变体的
筛选为此提供了一条可行的技术途径。在以提高植物甲硫氨酸含量为目的的突变体筛选工作
中, 用甲硫氨酸、乙硫氨酸和蛋氨酸2亚砜亚胺为选择剂已在多种植物中获得甲硫氨酸过量合
成的抗性细胞系, 有些还得到稳定的抗性植物[ 3～ 9 ]。迄今, 有关沙打旺细胞遗传操作的研究
甚少[ 10 ] , 未见抗性突变体筛选的报告。本文以沙打旺胚性愈伤组织为材料, 用乙硫氨酸为选
择剂, 从经N aN 3 诱变处理的培养物中分离出特异积累甲硫氨酸的抗性细胞系并培养成再生
植株, 同时在不同水平上检测了变异系的抗性稳定性。
1　材料和方法
1. 1　筛选材料和培养条件　　分离抗乙硫氨酸变异细胞的材料是沙打旺 (A strag a lus
ad su rg ens Pall. )胚性愈伤组织。胚性愈伤组织诱导方法见前文[ 10 ] , 并在含 1. 0 m g L - 1 2, 42
D 和 0. 5 m g L - 1 BA 的M S 培养基上, 24±2℃、30Lm o l m - 2 s- 1光照条件下 (16 h ö d) 继代培
养, 每 3 周转接 1 次。筛选过程中使用的培养基组成 (除说明加入诱变剂或选择剂外) 和培养
条件均同继代培养。
1. 2　NaN3 诱变处理条件的确定　　将胚性愈伤组织分成均匀小块 (32±5 m g 鲜重 ö 块) , 置
于 0. 1 m o l L - 1 N aN 3 溶液 (液体M S 培养基配制)中处理不同时间后取出, 用无N aN 3 的液体
M S 培养基洗涤 5 次, 然后接种在固体M S 培养基中培养, 3 周后测定愈伤组织的相对生长率
(R ela t ive grow th ra te, % ) , 以确定诱变处理时间。实验重复 5 次。
相对生长率 = 处理条件下愈伤组织鲜重增长倍数对照条件下愈伤组织鲜重增长倍数 × 100 à
1. 3　乙硫氨酸全致死剂量的确定　　未经诱变处理的胚性愈伤组织小块 (32±5 m g 鲜重ö
块)接入含不同浓度乙硫氨酸的M S 培养基中, 培养 3 周后测定愈伤组织的相对生长率, 以确
定乙硫氨酸的全致死剂量。实验重复 5 次。
1. 4　抗乙硫氨酸变异系的筛选　　将胚性愈伤组织分成均匀小块 (32±5 m g 鲜重 ö 块) , 置
于 0. 0 和 0. 1 m o l L - 1 N aN 3 溶液中处理 3 h, 经液体M S 培养基洗涤 5 次后放在含 0. 6 mm o l
L - 1乙硫氨酸的固体M S 培养基 (选择培养基 SM )中连续培养。9 周后将存活的愈伤组织块转
入不含乙硫氨酸的固体M S 培养基 (非选择培养基N SM ) 继代培养 3 代 (每代 3 周) , 然后再
转入 SM 中培养 3 代, 最后把选出的抗性细胞系在N SM 上培养 6 代后进行下述分析。
1. 5　变异系对乙硫氨酸的抗性反应　　将变异系和野生型愈伤组织分别转入含不同浓度乙
硫氨酸的M S 培养基中, 3 周后测定愈伤组织的相对生长率, 每个处理重复 3 次。
1. 6　变异系的植株再生和染色体观察　　将变异系和野生型愈伤组织按前文[ 10 ]分别接入含
有和不含有 0. 6 mm o lL - 1乙硫氨酸的附加 0. 1 m g L - 1 NAA 和 1. 0 m g L - 1 BA 的M S 分化培
养基上诱导体细胞胚胎发生, 设 3 个重复。5 周后统计体细胞胚胎发生频率和形成的体细胞
胚数, 并把有体细胞胚的愈伤组织转入无激素的 1 ö 2M S 培养基上促进小植株的生长发育, 取
10 株野生型再生苗和 57 株变异系再生苗根尖常规压片法镜检染色体[ 11 ] , 每条根尖观察 20～
30 个有丝分裂中期细胞。
1. 7　变异系及再生苗的游离氨基酸分析　　一定量干重材料于 4% 磺基水杨酸研磨提取,
10000×g 离心后, 取上清液用日立835—50型氨基酸分析仪测定游离氨基酸。实验重复3次。
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图 1　　0. 1 mo l L - 1 N aN 3 溶液诱变处理对
沙打旺愈伤组织生长的影响
F ig. 1　　Effect of 0. 1 mo l L - 1 N aN 3 t reatm ent
on callus grow th of A strag a lus ad su rg ens
1. 8　变异系再生苗的愈伤组织诱导　　取变异系和
野生型再生苗茎切段于诱导培养基中诱导愈伤组织,
方法同前[ 10 ]。诱导培养基中含或不含乙硫氨酸, 3 周
后统计愈伤组织诱导率。
2　结果
2. 1　N aN 3 诱变处理条件的确定　　用 0. 1 m o l L - 1
N aN 3 溶液处理沙打旺胚性愈伤组织, 随处理时间延
长 , 愈伤组织生长呈负指数曲线明显下降 ( r= -
0. 9219) (图 1)。处理 3. 0 h, 愈伤组织生长只有对照
的 28%。实验选此处理时间诱变处理愈伤组织。
2. 2　乙硫氨酸全致死剂量的确定　　乙硫氨酸严重
抑制沙打旺愈伤组织的生长, 当培养基中乙硫氨酸
表 1　　沙打旺抗乙硫氨酸变异系的筛选程序
Table 1　　Selection procedure of eth ion ine-resistan t var ian ts from A. adsurgens ca llus
筛选程序 Selection p rocedure
N aN 3 浓度
N aN 3 concentration (mo l L - 1)
0. 0 0. 1
To tal num ber of treated callus p ieces 764 698
↓
N um ber of surviving callus p ieces after 3 w eek s on SM 0 8
↓
N um ber of surviving callus p ieces after 6 w eek s on SM 0 3
↓
N um ber of surviving callus p ieces after 9 w eek s on SM 0 3
↓
N um ber of surviving callus p ieces after 3 passages
(3×3 w eek s) on N SM 0 3
↓
N um ber of surviving callus p ieces after 3 passages
(3×3 w eek s) on SM 0 3
浓度为 0. 6 mm o l L - 1
时, 愈伤组织块全部
褐化死亡 (表 1 和图
2 ) , 因而以该浓度作
为筛选的全致死剂量。
2. 3　抗乙硫氨酸变异
系的筛选　　将经过
诱变处理的沙打旺愈
伤组织转入选择培养
基 (SM ) 中进行筛选,
同时设不含 N aN 3 的
液体培养基浸泡的平
行处理 (表 1)。698 块
经诱变处理的愈伤组
织块在 SM 中大多全部褐化死亡, 培养 3 周后, 有 8 块愈伤组织存活, 连续培养至 6 周, 仅有
3 块愈伤组织在表面出现淡黄色小点, 生长极为缓慢, 其余全部褐化死亡, 培养 9 周, 淡黄色
小点逐渐长大, 生长开始加快 (图 3A )。将其转入非选择培养基 (N SM ) 和 SM 中各培养 3 代,
得到 3 株较为稳定的沙打旺抗乙硫氨酸变异系 SER 21、SER 22 和 SER 23。用不含N aN 3 的液
体培养基平行处理的 764 块愈伤组织, 经选择未能获得存活的愈伤组织, 表明 0. 6 mm o l L - 1
乙硫氨酸作为筛选的全致死剂量是适合的。
2. 4　抗乙硫氨酸变异系的抗性分析　　抗性变异系脱离选择压力 6 代后对乙硫氨酸仍具明
显的抗性 (图 2)。当在乙硫氨酸浓度低于 0. 6 mm o l L - 1的培养基中, 变异细胞长势良好, 在
含 0. 4 mm o l L - 1乙硫氨酸的培养基中, 变异系 SER 21 和 SER 23 的生长甚至超过对照条件下
的生长 (100% ) , 分别为 107. 2% 和 106. 7%。在全致死剂量的培养基中, 3 株变异系的生长仍
为对照条件下的 70% 左右。随乙硫氨酸浓度的提高, 变异细胞系的生长开始下降。抗性系
SER 21、SER 22 和 SER 23 的 I50 (抑制细胞生长50% 时所需的抑制剂浓度) 分别是野生细胞的
1976 期　　　　　　　　　　罗建平等: 豆科牧草沙打旺抗乙硫氨酸变异系筛选　　　　　　　　　　　　

图 2　　乙硫氨酸对抗性系和野生型愈伤组织生长的影响
F ig. 2　　Effect of eth io ine on the grow th of resistan t
and w ild type eallus in A . ad su rg ens
6. 7 倍、5. 0 倍和 8. 0 倍。
2. 5　抗乙硫氨酸变异系的植株再生　　3
株抗性变异系的分化能力不同。在不含乙
硫氨酸的培养基中, 仅 SER 23 可形成体细
胞胚, 但愈伤组织体细胞胚胎发生频率很
低, 只有野生型的 22. 9% , 平均体细胞胚
数是野生型的 11. 1% (表 2)。无论是抗性
系还是野生型的愈伤组织在含乙硫氨酸的
培养基中都无体细胞胚的产生。和野生型
(图 3B ) 相比, 抗性系再生植株叶小, 茎纤
细, 根不发达 (图 3C)。对 57 株抗性系再生
植株根尖染色体观察表明, 抗性系再生植
株的染色体数基本未发生改变 (图 3D ) , 偶
见少于 16 条, 约占观察细胞数的 2‰, 这种现象可能和体细胞胚胎发生需要多个基因协同表
达相关[ 12 ]。
2. 6　抗乙硫氨酸变异系及再生植株的游离氨基酸分析　　游离氨基酸分析表明 (表 3) , 在抗
图 3　　沙打旺抗乙硫氨酸变异系的筛选和植株再生
F ig. 3　　Selection and p lan t regeneration of eth ion ine2resistan t varian t in A . ad su rg ens
A Surviving callus on SM , B and C P lan tlets regenerated from w ild type and eth ion ine2resistan t varian t SER 23 callus respec2
t ively, D Som atic m etaphase ch romo som es (2n= 16) in roo t t ip cell from regeneran t of varian t SER 23 (×1000).
表 2　　沙打旺抗乙硫氨酸变异系和野生型细胞系的植株再生
Table 2　　Plan t regenerated from resistan t and wild type cell l ines of A. adsurgens
细胞系
Cell line
在含不同乙硫氨酸培养基中愈伤组织体
细胞胚胎发生频率 (% )
F requency (% ) of calli p roducing som atic em bryo s on
differen tiat ion m edium w ith eth ion ine (mmo l L - 1)
0. 0 0. 6
在含不同乙硫氨酸培养基中每克愈伤
组织产生的体细胞胚数
N um ber of som atic em bryo s per g fw. callus p iece on
differen tiat ion m edium w ith eth ion ine (mmo l L - 1)
0. 0 0. 6
W ild type 60. 8±4. 5 0. 0 188. 7±30. 8 0. 0
SER 21 0. 0 0. 0 0. 0 0. 0
SER 22 0. 0 0. 0 0. 0 0. 0
SER 23 13. 9±6. 2 0. 0 21. 4±14. 5 0. 0
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性变异系 SER 23 中, 所有天冬氨酸族氨基酸含量均比野生型有不同程度的增加, 以天冬氨酸
(A sp )和甲硫氨酸 (M et)最为明显, 各增加 1. 5 倍; 在抗性系再生植株中, 除异亮氨酸外, 其
余天冬氨酸族氨基酸含量增加显著, 甲硫氨酸和苏氨酸 (T h r)各比野生型增加了 3 倍。
表 3　　沙打旺抗乙硫氨酸变异系 SER-3 和野生型细胞系及其再生植株游离氨基酸的分析
Table 3　　Free am ino ac id con ten ts in ca ll i and regeneran ts from SER-3 and wild type cell l ines of A. adsurgens
氨基酸
Am ino acid
愈伤组织中的含量 (毫克ö 100 克干重)
Conten t in calli (m g ö 100 g D. W t. )
W ild type SER 23
再生植株中的含量 (毫克ö 100 克干重)
Conten t in regeneran ts (m g ö 100 g D. W t. )
W ild type SER 23
A sp 221. 9 565. 6 380. 8 540. 7
L ys 191. 3 265. 4 39. 7 111. 4
T h r 149. 9 229. 6 50. 4 203. 1
Ile 135. 7 171. 5 18. 6 17. 8
M et 33. 2 83. 6 20. 5 85. 5
2. 7　抗乙硫氨酸变异系再生苗愈伤组织的诱导　　抗性系再生苗茎切段在 0. 6 mm o l L - 1乙
硫氨酸培养基中可形成愈伤组织 (表 4) , 和无乙硫氨酸培养基中愈伤组织诱导结果无显著差
异。而对照再生苗茎切段只能在正常培养基中形成愈伤组织, 在含乙硫氨酸的培养基中外植
体全部褐化死亡。
表 4　　沙打旺抗乙硫氨酸变异系 SER-3 与野生型细胞系再生苗的愈伤组织诱导
Table 4　　Callus induction from regeneran ts of SER-3 and wild type cell l ines of A. adsurgens
材料来源
Source naterial
在含不同乙硫氨酸培养基中用于愈伤
组织诱导的茎外植体数
N um ber of stem exp lan ts p laced onto callus
induction m edium w ith eth ion ine (mmo lö L )
0. 0 0. 6
在含不同乙硫氨酸培养基中产生愈伤
组织的茎外植体数
N um ber of stem exp lan ts p roducing calli on callus
induction m edium w ith eth ion ine (mmo lö L )
0. 0 0. 6
W ild type 118 127 102 0
(40) a (40) (86. 4) b (0)
SER 23 95 86 83 62
(40) (40) (87. 4) (72. 1)
　　a N um ber of regeneran ts fo r p reparation of stem segm ents. b F requency (% ) of stem exp lan ts p roducing calli.
3　讨论
乙硫氨酸是甲硫氨酸的类似物, 它可以代替甲硫氨酸掺入蛋白质造成低活性蛋白质或无
活性蛋白质, 以及掺入 SAM (S2腺苷甲硫氨酸)中降低细胞内 SAM 库水平, 从而对细胞产生
毒性[ 13 ]。因此, 选择甲硫氨酸合成过量的变异细胞系, 由于过量合成的甲硫氨酸与乙硫氨酸
竞争掺入蛋白质和 SAM 中, 从而使细胞抗乙硫氨酸。利用植物细胞和组织培养技术, 已从
胡萝卜[ 3 ]、烟草[ 4 ]、大豆[ 5 ]、苜蓿[ 6 ]、豇豆[ 7 ]和石刁柏[ 8 ]中分离出抗乙硫氨酸变异细胞系, 这
些细胞系中游离甲硫氨酸积累均显著高于野生细胞系。本实验以沙打旺胚性愈伤组织为材
料, 通过诱变—筛选—扩增—再筛选过程选择到一株能再生植株的抗乙硫氨酸变异系, 并过
量积累了游离甲硫氨酸。该细胞系无论是在细胞生长水平上, 还是在再生苗茎切段诱导愈伤
组织诱导过程中, 抗性表型均较稳定。
在分离细胞突变体中, 对于使用诱变剂的必要性还缺乏足够的证据[ 14 ]。但在筛选沙打旺
抗乙硫氨酸变异系中, 对分离材料进行诱变处理是必须的。A hm ed 等[ 7 ]在分离豇豆抗乙硫氨
酸细胞系中证明, 用N —甲基—N ′—硝基—N —亚硝基胍 (N T G, N —m ethyl—N ′—no tro—
3976 期　　　　　　　　　　罗建平等: 豆科牧草沙打旺抗乙硫氨酸变异系筛选　　　　　　　　　　　　

N —n it ro soguan id ine) 诱变悬浮细胞可使抗性细胞出现频率由 10- 7提高到 10- 5。M adison 和
T hom p son 分离出的 26 个过量合成游离甲硫氨酸的大豆抗乙硫氨酸细胞系中, 其中 20 个细
胞系是来自N T G 诱变处理组的, 并且它们积累游离甲硫氨酸量高于非诱变处理组所分离出
的细胞系[ 5 ]。
在植物体中, 包括甲硫氨酸在内所有天冬氨酸族氨基酸, 都是由天冬氨酸通过共同的分
支途径合成的, 该途径主要受最终产物的反馈调节[ 14 ]。在烟草[ 4 ]和石刁柏[ 8 ]抗乙硫氨酸细胞
系中, 甲硫氨酸的过量合成分别与天冬氨酸激酶 (A K)赖氨酸敏感型同工酶活性 (升高 16 倍)
和对赖氨酸及苏氨酸反馈抑制不敏感的A K 同工酶活性 (升高 2 倍) 升高有关。而在抗乙硫氨
酸的大豆细胞系中, 由于苏氨酸合酶活性降低导致磷酸高丝氨酸较多的用于甲硫氨酸合
成[ 5 ]。本文对抗性细胞系及再生植株游离氨基酸含量分析可能表明, 在沙打旺抗乙硫氨酸变
异系中, 由于分枝途径上的反馈调节酶二氢吡啶二羧酸合酶 (D S) 或高丝氨酸脱氢酶 (H SDH )
等结构或活性发生变化, 是不可能使所有天冬氨酸族氨基酸含量都增加, 因此推测是天冬氨
酸激酶 (A K) 活性升高或对反馈抑制不敏感, 使更多的天冬氨酸进入合成途径用于赖氨酸、
苏氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的合成, 造成抗性系中游离甲硫氨酸过量积累, 对乙硫氨酸表
现抗性。也有可能是氨基酸分解速率降低, 从而使细胞积累该族氨基酸。
突变是遗传物质结构的可遗传的改变。N aN 3 诱变处理多为基因突变, 极少为染色体异
常[ 14 ]。尽管沙打旺抗性系再生植株根尖细胞染色体是正常的二倍体, 但游离氨基酸含量的变
化表明, 抗性变异系天冬氨酸族氨基酸代谢途径关键酶基因或其表达调控发生了变化, 说明
DNA 分子水平上的变化是存在的。要证明突变体 (或变异体)DNA 碱基顺序的改变很困难,
近年发展起来的RA PD 技术可用于抗性变异 (或突变)的分析。RA PD 可检测DNA 扩增片段
长度的多态性, 但存在所检测出的多态性差异是与抗性有关的功能序列的差异还是其它差异
的不确定性。当找到特异引物扩增的多态性DNA 片段, 必须追踪特异多态性DNA 片段和抗
性系植株有性繁育后代 (杂交、自交) 所表现出的抗性性状是否保持一致, 只有两者相一致,
才表明 RA PD 标记的特异DNA 片段是与抗性特征相关的基因序列或是与抗性相关基因连
锁。本试验的进一步工作正在证明沙打旺抗乙硫氨酸植株的遗传稳定性, 在此基础上, 用
RA PD 技术希望标记出与乙硫氨酸抗性相关的基因。
参　考　文　献
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2　赵　忠, 贾敬芬. 植物学报, 1996, 38: 268～ 275
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