全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(6)：505～508
Journal of Wuhan Botanical Research
青花菜细胞质雄性不育系线粒体 DNA的提取与 RAPD分析
朱玉英 ，一，杨晓锋 ，侯瑞贤 ，李式军。，吴琴生。
(1．上海市农业科学院园艺研究所，上海 201106；2．上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201106；
3．南京农业大学园艺学院，南京 210095)
摘 要：利用分子生物学方法提取青花菜不育系及其保持系线粒体的 DNA，经琼脂糖凝胶电泳表明所提取的线粒
体 DNA纯度较高。通过40个引物进行随机引物多态性扩增，结果表明，由引物$66扩增出一条 1 000 bp左右的特
异条带 BMS。。，该条带是不育系 mtDNA所特有的，初步推断该特异条带可能与不育性相关。
关键词：青花菜；雄性不育系；线粒体 DNA；RAPD
中图分类号：$603．2；Q949．748．3 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2006)06-0505—04
Extraction and RAPD Analysis of M itochondrial DNA of Cytoplasmic
Male Sterile(CMS)Line in Broccoli
ZHU Yu—Ying ，YANG Xiao—Feng ，HOU Rui—Xian ，LI Shi．Jun。
， wu Qin—Sheng。
(1．Homadawal Research Institute，Shanghai Academy of Sc／ences，Shanghai 201106，China；
2．Shanghai研 Lab．ofProtected Horticultural Techad％,y，Shanghai 201106，China；3．Department ofHorticulture，
NanjingA University，Nanjing 210095，China)
Abstract：DNA from the mitochondrion(mtDNA)of CMS line BC7—1 9 and its maintaner of broccoli
(Brassica oleracea L．var．italica Plenck．)was extracted by molecular bio—technique．and was marked
using RAPD reaction．The result showed that the purity of the extracted mtDNA was high by sepharose
electrophoresis．And the result also showed that a special fragment，BMS1000，with about 1 000 bp amplifi．
cated by primer$66，was peculiar for the mtDNA of male sterile line by RAPD reaction of40 primers．and
the special fragment was initially considered to be relevan t to male sterility after sequence analysis．
Key words：Broccoli(Brasica oleracea L．Var．italica Plenck．)；Male sterile line；mtDNA；RAPD
细胞质雄性不育在高等植物界普遍存在，是作
物杂种优势利用的重要途径之一。大量的实验表
明，线粒体 DNA(mtDNA)与细胞质雄性不育关系紧
密-l J。2O世纪9O年代初建立的随机扩增多态性
DNA(RAPD)技术 —J，具有程序简便、快速灵敏等
优点，并不受发育阶段和环境因素的影响，目前在遗
传图谱构建、基因定位及亲缘关系分析中广泛应
用 ’。 。我们利用 RAPD分子标记技术对萝 卜细胞
质青花菜雄性不育系及其保持系的线粒体 DNA进
行分析，明确不育系及保持系之间的分子差异，并以
期克隆其雄性不育相关基因。
1 材料和方法
1．1 材料
供试材料为经6～7代回交转育而稳定的青花
菜(Brasica oleracea L．var．italica Plenck．)雄性不育
系 BC7—19及其保持系 A15—1．1。
1．2 方法
1．2．1 线粒体的制备 参照杨毅等 的方法略加
改动。取黄化苗在液氮中研磨成粉状，加人5 mL／g
Fw预冷 的研磨介质 Bufer A (0．4 mol／L蔗糖，
50 mmol／L Tris—HC1 pH 7．5，1 mmol／L EDTA，0．5％
PVP，0．1％ BSA，0．1％半胱氨酸)充分混匀，8层纱
布过滤，滤液用 2000 r／min离心 10 min后取上清，
然后再12000 r／min离心 10 min得粗制线粒体。在
粗制线粒体中加人 0．1 mL／g FW Bufer A，核酸酶 I
至终浓度 10 g／g，MgC12至终浓度 10 I．~mol／L，在
4℃反 应 1 h后加 人 EDTA终 止反应 (终浓 度
100 mmol／L)。再在离心管底缓缓加人 2 mL／mg
FW 的Bufer B(10 mmol／LTris—HC1，600 mmol／L蔗
糖)12000 r／min离心 15 min，弃上清后得纯化的线
粒体。
收稿日期：2006—06-26，修回日期 ：2006．08-22。
基金项 目：上海市科技兴农重点攻关项 目[农科攻字(96)第5—02号]。
作者简介：朱玉英(1963一)，女，博士，研究员，主要从事叶菜遗传育种研究。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
1．2．2 线粒体DNA的提取 在纯化的线粒体中加
入0．1 m[／g 的裂解液 (2％ CTAB，50 mmol／L
Tris．20 mmol／L EDTA，1％ PVP．360，1．4 moVL NaC1
pH 8．0)，混匀后加蛋白酶K至终浓度 lO g／g FW，
10％ SDS至终浓度2％，37％反应4 h后加等体积
酚氯仿 ，静置 5 rain后，12000 r／min离心 10 min，取
上清后加 1／10体积的乙酸钠和两倍体积的无水乙
醇，一20℃下过夜后 12000 r／min离心，沉淀用75％
的乙醇洗 1～2次后凉干，溶于3O TE后备用。
1．2．3 RAPD反应 RAPD反应所用随机引物见表
1 随机引物 购自上悔生工生物工程有限公司。
30 的 PCR反应体系中含：1 i．L 基因组 DNA；
50 mmol／L KC1；10 mmol／L Tri~ HC1，pH 9．0；0．1％
NP40； J．5 mmol／L MgCI2； 0．2 mmoVL dNTPs；
0．3~moVL随机引物；1 U Taq DNA聚合酶。使用
的PCR扩增仪为 MJ Reserch INC．PTC100。循环条
件为：95℃ 10 min；94℃ 50 s，36℃ 70 s，72℃
120 s，共45个循环 ；72 10 rain。扩增产物在 1％
的琼脂糖胶中电泳，电泳后凝胶用上海天能公司生
产的凝胶成像系统拍照分析。
表 1 随机扩增中所用引物
Table 1 Ptimem inILs,PD reaction system
引物编号 序列 引物编号 序列
Pdm ql~nce Primer S一 一 e
Sl Grr CC1℃C S3 C 1^℃CCccTc
Sll GT^ GACCCCT Sl3 TI℃CCCCCCT
s2I C C^GCC Ⅳ C S42 GGACC0 ^ CC
$44 TCTCCTG^ GC s48 GTGTGCCCC^
s58 GACACCC^ AC $59 cTGGcc^ Crr
S60 ACCCGG1℃AC S66 CA^CCC m^
S 7 GTcCCGACGA S68 rGGACCGG亿
s76 CACAC CCAc S77 rr七CCCCCAG
s81 ACGC^GGA 2 ocC^ CTG^ CG
S84 G^CGTGW G s99 CTcAGGGCAA
S100 TC1℃CCT℃^G S121 ACGG^ CTG
Sl22 C^ 0G^ 1℃CCT S125 CCGAA1了CCC
S139 CCT AGACC S140 GG T G^^ GG
Sl51 C^ G唧 C^ CC S157 CrA l、CCC田
$353 CC^ c_ crACC S364 CCCCCC^ “ C
s37l AATGCCCCAG Slo0l rCCGC^ ^CCA
Slo19 CCCA C1℃ S1020 GGAAGGTCAG
Sl036 A~tGC-CACGAG Sl143 G^1℃GGCCC ^
Sl237 ^GTTCCGCG ^ S1257 AGCGACrGCT
S1325 ACTGCACACC s1340 C^^ C1℃GCC^
I．2．4 RAPD反应产物特异片段的克隆和测序
RAPD扩增产物在 I％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳后
凝胶用上海天能公司生产的凝胶成像系统拍照分
析。特异扩增片段以低熔点胶回收、纯化 回收产
物与 T载体连接，转化DH5a，经酶切鉴定正确后测
序分析。
2 结果与分析
2．1 mtDNA的提取
琼脂糖凝胶电泳结果见图 1 由图 1可见．所
提取的mtDNA具有较高的纯度，无大量降解情况。
幽
图1 青花菜细胞质雄性不育系【59)及其保持系c 225
线粒体 DNA琼脂精凝胶电泳
Fig 1 Electrophoresis profile of mtDNA of CMS
llne(59)and its maintainer line(225)in broccoli
2．2 RAPD反应结果
RAPD反应结果见图 2。图 2是 由随机引物
$66扩增出来的，由图中可以看出不育系与其保持
系的扩增图谱存在一定的差异，在不育系(图中为
59)中扩增 出一条 1 0OO bp左 右 的特异 条带
BMS ，而在保持系(图中为 225)中则缺少这一片
段。从而初步推断，不育系中存在的这一特异片段
可能与不育性有关。
M： D A／EcoR I+ Ⅲ marker：225：Mainlainer line Al5—1—
59：CMS lne BC7—19；7Z：pGEM-7Z(+)／ Ⅲ r 盯
图2 青花菜细胞质雄性不育系及其保持
系王L^PD扩增产物图谱
Fig．2 The ampli,qed profile of mtDNA 0f CMS line and
its malntainer line th IAPD in broccoli
2．3 RAPD扩增特异片段的回收和测序
RAPD反应中，由随机引物 $66在 59中扩增出
一 条 1 00O bp左右的特异条带 BMS 0叩(图2)，为进
一 步明确该特异片段的功能，并为进一步利用该结
果进行 SCAR标记的转变奠定基础，将该特异条带
用低熔点胶回收、纯化．回收条带送上海生工测序
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第 6期 朱玉英等：青花菜细胞质雄性不育系线粒体 DNA的提取与 RAPD分析
左向测序结果为：
TI*IGCAANCNTGCATGCCTGCAGGTCGACGATIGAACGGACTCAACATIGTCAAGATCTICCCCGAGTCAGCTA
TCAAGTICCTGACATATGAAAGCTCCAAGCGCATCATCGCCAAAGCGCAGGGCCTCAAAGATCAAGAGGACAT
AGGTGGAGGAGCACGA ITCATGGCAGGTGGCGTATCTGGAATCACGTCCCAA ITCGCTATATACCCATTGGAG
ACA，rrAAAGACGAGGAT0CAAACGAG，I1ATGG，丌 ATGACGTAGGTGGAGGCGCAGGTGGAAAATCTACACA 兀
CGCTCCTGGTCACAACGGCAAAAGACATGGCAGTFCACGGCGGATGGAGGGCATACTATCGCGGCCTFGTACC
TGGTCTCGTGGGAGTCTTTCCATACGCCGCTATCGACATGTCCATATYIGAAACGTYAAAGAATGCGTACCGTC
AAACGACGTGGCGAACCAGGTGCAA ITATGATCCTCGCC I’I-rGGTACAGTCAGTGGAGCAGTFGGTGCGACAA
GCCTrrACCCTrrGAATCTrrGCAGAACGCGCTIACAAGCTCAAGGAACACCAGGCCATCCAGCGACGTACAA
GAAC ITGCGAGATGTA ITCGTGAGGACATATGCAAAAAGAGGGCG ITACGGGC ITNTATAAAGGACTCGTACC
GAC I’rrGTAAAGG IlAA ITNCCGG ITNTATCTCATGGCTGG ITATCCAAAGTTGACGGCGATN IfrAC IfrNCCGGN
AAAGGAAANNAAGNT
右向测序结果为：
TI-rANNNCCTI-rNNNNTI-rGAANTCCGAATTCGGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATrGAACGGACTCCC
CACTC ItIIGTACA ITCA ITATAGACGCCAATAAAGATA I’I-r^ CATATGTACATGCTGAATGTCCA ITATGATGACT
ACTTCTr【 rCCTr【TCCGGAAGTAATATCGCCGTCAAC，rI-rGTATAAACGAGCCATGAGATAGATACCGCGGGA
ATGACC I’ITGACAAAGTCGGTACGAGTCC I’I-rATAGAAGCCCGTAACGCCCTCTI，ITGCATATGTCCTCACGAA
TACATCTCGCAAGTTCTTGTACGTCGCTGGATGGCCTGGTGTTCCTTGAGCTTGTAAGCGCGTTCTGCAAAGATT
CAAAGGGTAAACGC ITGTCGCACCAACTGCTCCACTGAC IBTACCAAAGGCGAGGATCATAA ITGCACCTGGT
TCGCCAC( CCT兀 GACGTACGCATrCTIT A^CGT丌 CAAATATGGACATG rCGATAGCGGCGTATGGAAACAC
I℃CCACGAGACCAGGTACAAGGCCGCGATAGTATGCCC I℃CATCCGCCGGGAACTGCCATGTCT1’I’I’GCCG ITG
TGACCAGGAGCGAATGTGTAGATrrrCACCTGCGCC ITCCACCTACGTNATAACCATAACTCGN ITGCATCCTN
GNC I’rrAATGGCTCCAATGGGTATATAGCGAA ITGGGACGTGA ITCCAGAAACCCCNCTGCCATGAANCGGGC
TCTCCNN
用 PCGENE软件对测序结果进行分析，得出该特异片段的全序列为：
GAACGGACTCAACA ITGTCAAGATCTrccccGAGTCAGCTATCAAG ITCCTGACATATGAAAGCTCCAAGCGCA
TCATCGCCAAAGCGCAGGGCCTCAAAGATCAAGAGGACATAGGTGGAGGAGCACGATTCATGGCAGGTGGCG
TATCTGGAA I℃ACGTCCCAA ITCGCTATATACCCA ITGGAGACA ITAAAGACGAGGATGCAAACGAG ITATGGT
TATGACGTAGGTGGAGGCGCAGGTGGAAAATCTACACATTCGCTCCTGGTCACAACGGCAAAAGACATGGCAG
ITCACGGCGGATGGAGGGCATACTATCGCGGCC ITGTACCTGGTCTCGTGGGAGTG I’I-rCCATACGCCGCTATC
GACATGTCCAT T^I-rGAAACG1rAAAGAATGCGTACCGTCAAACGACGTGGCGAACCAGGTGCAATrATGATC
CTCGCC I’rrGGTACAGTCAGTGGAGCAG ITGGTGCGACAAGCG I’I-rACCC I’rrGAATCTTTGCAGAACGCGC IT
ACAAGCTCAAGGAACACCAGGCCATCCAGCGACGTACAAGAAC IfrGCGAGATGTA IfrCGTGAGGACATATGCA
AAAAGAGGGCG ITACGGGC ITC IIATAAAGGACTCGTACCGAC I’I-rGTCAAAGG ITCATrCCCGCGGTATCTATC
TCATGGCTCG I’I-rATACAAAG ITGACGGCGATA ITAC ITC
CGGAAAAGGAAAAGAAGTAGTCATCATAATGGACA ITCAGCATGTACATAGTAAATATCTrTA ITGGCGTCTA
TAATGAATGTACAAGAGTGGGGAGTCCG ITC
3 讨论
纯化线粒体的提取是实验成败的关键，选材不
当、提取过程中所用试剂不当都会影响线粒体的得
率、纯度及完整性，因此，本实验在线粒体制备过程
选用黄化苗，以提高线粒体的产量和纯度，加入一定
浓度的蔗糖、EDTA、半胱氨酸等，既可以维持一定的
渗透压，防止线粒体破裂，又能去除酚类物质对线粒
体的毒害作用。此外，研磨时也格外注意研磨强度，
以减少线粒体的机械破碎率。
同时，建立稳定的RAPD反应体系是 RAPD反
应顺利进行的必要保证。根据本研究结果我们认
为，RAPD的不稳定主要 由于随机引物短和模板的
结合存在一定的随机性，对 PCR反应体系的变化十
分敏感。因此，要提高RAPD反应的稳定性，必须保
证PCR体系的稳定性。本实验结果表明，DNA模板
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
溶于 1×TE后 ，在4~C下较为稳定，可存放 2～3个
月，而 一20~C冻融 1—2次后扩增条带急剧减少以至
没有扩增产物。另外，选用同一公司的 Taq DNA聚
合酶，采用合适的 PCR反应缓冲液也是保证 PCR
体系稳定的重要因素。
本实验通过 40个引物的 RAPD反应 ，由引物
$66扩增出一条 1 000 bp左右的特异条带 BMSl00，
该条带存在于不育系线粒体DNA中，而其相应的保
持系中却没有，表明差异谱带可能与不育性有关。
至于该序列的具体功能，目前尚不清楚，有待进一步
的研究。
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