全 文 ：武汉植物学研究 2002, 20 (3) : 171～ 176
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
红莲型杂交稻 (红莲 2 号)及其骨干亲本的
RAPD 分析与鉴定Ξ
段世华1, 2 毛加宁3 朱英国1ΞΞ
(1. 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉大学遗传研究所, 武汉　430072;
2. 江西井冈山师范学院生物系, 江西吉安　343009; 3. 四川乐山师范学院生物系, 四川乐山　614000)
摘　要: 利用RA PD 技术, 从 248 个随机寡核苷酸引物 (102m er)中筛选出 18 个引物对红莲型杂交稻组合红莲 2 号
及其亲本 (T 207A、T 207B、YD 6205) , 另 6 个红莲型胞质不育系的骨干恢复系和汕优 63 及其亲本共 14 份水稻材料
进行分析。共检测到 173 个多态性标记。聚类分析结果表明: 不育系与保持系间因核背景相似, 遗传差异很小; 杂种
(F 1)的基因型更倾向于恢复系; 恢复系与保持系间遗传距离相对较大, 但各恢复系之间的遗传距离较小。利用这些
标记能有效地区分杂交组合中不育系、保持系、恢复系和杂种 (F 1)。
关键词: 杂交水稻; RA PD; 骨干亲本; 遗传分析; 鉴定
中图分类号: Q 344. 4　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2002) 0320171206
Genetics Ana lys is and Iden tif ica tion of Hybr id R ice
HL -Type (Hongl ian -2) and The ir Backbone
Paren ta l w ith RAPD M arkers
DUAN Sh i2H ua1, 2, M AO J ia2N ing3, ZHU Y ing2Guo 1ΞΞ
(1. T he K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology , Institu te of Genetics, W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina;
2. D ep artm en t of B iology , J ing g ang shan N orm a l Colleg e, J i’an, J iangx i　343009, Ch ina;
3. D ep artm en t of B iology , L eshan N orm a l Colleg e, L eshan, Sichuan　614000, Ch ina)
Abstract: A to ta l of 248 arb it rary 102m er o ligonucleo t ide p rim ers w ere screened u sing RA PD
(random amp lif ied po lymo rph ic DNA ) techn ique on the genom e DNA s of 14 rice m ateria ls w h ich
included HL 2type hyb rid rice (Honglian22) and their paren ta l (T 207A , T 207B , YD 6205) , six o ther
backbone resto re lines of CM S2Honglian2type, Shanyou 63 and their paren ta l. E igh teen p rim ers
p roduced 173 po lymo rph ic fragm en ts. T he resu lts from clu ster analysis show ed: T here w as lit t le
genet ic d iversity betw een sterile lines and m ain ta iner lines becau se of their sim ilar nuclear back2
ground. T he genom e2type of hyb rid rice w as inclined to resto re lines. T here w as large genet ic vari2
at ion betw een resto rer lines and sterile lines, bu t the genet ic d istance w as sm all among resto rer
lines. U sing th is RA PD m arkers, the hyb rid rice com b inat ion s (sterile line, m ain ta iner line, resto2
rer line and hyb rid rice (F 1) ) cou ld be effect ively iden t if ied.
Key words: H yb rid rice; RA PD; Backbone paren ta l; Genet ics analysis; Iden t if ica t ion
　　植物雄性不育是作物杂种优势利用的基础。水 稻细胞质雄性不育系按其花粉败育时期和花粉败育ΞΞΞ 通讯作者。武汉大学遗传研究所, T el: 027287684560。收稿日期: 2001209217, 修回日期: 2001211227。基金项目: 国家转基因专项基金资助项目 (J992A 2002)。　作者简介: 段世华 (1968- ) , 男, 江西永新人, 在读硕士, 井冈山师范学院讲师, 从事生物化学与分子生物学教学与科研工作。
的形态特征及恢保关系可以归纳为三大类型: 野败
型 (W A )、包台型 (BT ) 和红莲型 (HL ) [1 ]。分子标记
技术的出现和发展为揭示作物的遗传差异和种质鉴
定提供了新的方法和手段。继 Grodzicker 等 (1974)
开始把限制性片段长度多态性 R FL P (R estrict ion
fragm en t length po lymo rph ism ) 作为遗传分析的工
具之后, 1990 年W illim s 等[2 ]建立了 RA PD (R an2
dom amp lif ied po lymo rph ic DNA ) 分子标记技术,
由于其程序简便、快速灵敏等特点, 所以在遗传图谱
构建、基因定位、种质鉴定和遗传关系分析中得到了
广泛的应用。利用RA PD 分子标记技术对野败型和
包台型三系杂交水稻及其亲本的遗传多样性和种质
鉴定已经开展了较多的研究[3 7 ]。但对红莲型杂交
水稻及其亲本间的遗传分析与鉴定未见报道。本研
究利用 RA PD 技术对武汉大学新近培育的红莲型
杂交水稻红莲 2 号组合 (T 207A、T 207B、YD 6205、红
莲 2 号)及其另 6 个骨干恢复系进行分析, 同时以野
败型杂交水稻汕优 63 组合参与比较研究, 以期能揭
示它们之间遗传多样性及其差异, 并为杂交育种实
践和种质鉴定提供一定的分子生物学依据。
1　材料与方法
1. 1　材料
本实验选用了武汉大学新近培育的红莲型杂交
稻红莲 2 号组合及其骨干恢复系和野败型杂交稻汕
优 63 组合共 14 份水稻材料进行RA PD 分析 (见表
1)。材料种子均由本实验室提供。
表 1　供试材料
T able 1　M ateria ls fo r the experim ent
编号
N o.
名称
N am e
类型
T ype
亲缘关系
O riginal rela t ion
1 T 207A 不育系 (红莲型)CM S2Honglian2type 杂交稻红莲 2 号亲本 (♀)Paren tal side of hybrid rice Honglian22 (♀)
2 T 207B 保持系M ain tainer line
3 红莲 2 号Honglian22 杂种H ybrid rice T 207A (♀)×YD 6205 (♂)
4 YD 6205 恢复系R esto re line 杂交稻红莲 2 号亲本 (♂)Paren tal side of hybrid rice Honglian22 (♂)
5 特青T eqing
恢复系
R esto re line
6 E3221 恢复系R esto re line
7 IR 24 恢复系R esto re line
8 IR 64 恢复系R esto re line
9 测 64Ce 64
恢复系
R esto re line
10 CDR 22 恢复系R esto re line
11 明恢 63M inghui 63
恢复系
R esto re line
杂交稻汕优 63 亲本 (♂)
Paren tal side of hybrid rice Shanyou 63 (♂)
12 汕优 63Shanyou 63
杂交稻
H ybrid rice
珍汕 97A (♀)×明恢 63 (♂)
Zhenshan97A (♀)×M inghui 63 (♂)
13 珍汕 97BZhenshan 97B
保持系
M ain tainer line
14 珍汕 97AZhenshan 97A
不育系 (野败型)
CM S- W ild abo rt ive
杂交稻汕优 63 亲本 (♀)
Paren tal side of hybrid rice Shanyou 63 (♀)
1. 2　D NA 提取
每个材料剪取幼嫩叶片提取总DNA , 按文献
[ 8 ]所介绍的方法进行。
1. 3　RAPD 反应
25 ΛL PCR 反应体系, 包括10 mmo löL T ris2 HC l (pH 910) , 50 mmo löL KC l, 01001% Gelat in,215 mmo löL M gC l2, 100 Λmo löL dN T P ( 上 海P rom ega 公司) , 014 Λmo löL RA PD 引物 (Sangon公司) , 1 U T aq2DNA 聚合酶 (上海 P rom ega 公司) , 50 ng水稻基因组DNA 模板。程序为: 94℃预
271 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷　
变性 5 m in; 再按 94℃ 1 m in, 38℃ 1 m in, 72℃
115 m in, 共 39 个循环; 72℃延伸5 m in。PCR 扩增
在 PTC2100 P rogramm ab le T herm al Con tro ller
PCR 仪上完成。RA PD 扩增产物 10 ΛL 在 115% 琼
脂糖凝胶中电泳2～ 3 h (4～ 5 V öcm ) , 经溴化乙锭
染色后, 紫外检测并照相, 然后在 Gel Doc 2000 凝
胶成像仪中扫描分析并保存文件。以 PCR m arker
为分子量标准。
1. 4　数据分析
选择重复性好, 多态性强, 扩增条带清晰的引物
作记录。将有带赋值为 1, 无带赋值为 0。用
RA PD IST 程序计算个样品间的N ei 氏遗传距离
D。D = 1- 2N x y ö(N x + N y ) , 其中N x 为样品 x 具有
带的条数,N y 为样品 y 具有的条带数,N x y为 2 样品
共有带的条数。再用 PH YL IP315c 软件包的N eigh2
bo r 程 序 按 U PGM A (U nw eigh ted pair group
m ethod w ith arithm et ic m ean) 方法进行聚类分析。
2　结果与讨论
2. 1　RAPD 扩增对杂交水稻亲本材料的区分结果
对Sangon公司的248个102m er引物进行筛选,
选择能够扩增出清晰、稳定带的18个引物进行正式
扩增并参与分析统计。18个引物共扩增出216条带,
单个引物的扩增带在7～ 16之间, 平均每个引物扩增
出12条带, 在216条带中, 173条为为多态性条带
(70109% ) , 表现出良好的多态性 (表2)。在上述18个
引物中发现 5 个RA PD 引物 , 能够分别区分所选的
2 个杂交水稻组合中各材料 (图1: A、B、C、D , 表3)。
通过对杂交组合和双亲进行分析发现杂种带型主要
表现为和扩增条带数较为丰富的一方亲本相同 (图
1: D )或者为双亲的互补 (图1: B )。从理论上讲, 杂种
包含双亲的全部遗传信息, 双亲无论任何一方能扩
增出的条带杂种也应该同时具有; 又由于RA PD 为
显性标记, 故杂种的多态性应为双亲的互补型或扩
表 2　18 个 RAPD 引物的序列及标记数
T able 2　L ist of 18 RA PD p rim ers, their sequences
and amp lificat ion resu lts
引物
P rim er
5’～ 3’ 序列
5’～ 3’
sequence
G+ C
(% )
扩增片段总数
To tal N o. of
amp lified
fragm ents
多态性片段数
N o. of
po lymo rph ic
fragm ents
S207 GGCA GGCTGT 70 14 12
S208 AA CGGCGA CA 60 13 9
S215 GGA TGCCA CT 60 9 5
S232 A CCCCCCA CT 70 7 4
S429 TGCCGGCTTG 70 16 16
S436 AA GCGA CCTG 60 13 10
S438 GGTGA GGTCA 60 12 10
S440 GGTGCTCCGT 70 8 7
S1053 CA GCCGTTCC 70 15 12
S1398 TGGTCCA GCC 70 10 8
S1418 CTGGGGTGTC 70 11 9
S1422 GTCGTCGTCT 60 15 14
S1424 A GGGGA CCTG 70 12 9
S1483 GAA GGA GGCA 60 10 8
S1492 GA CGCA CTTC 60 9 6
S1494 GGTGCGCA CT 70 14 12
S1496 TCCCGGTGA G 70 14 11
S1520 TGCGCTCCTC 70 12 9
To tal 18 216 173
图 1　A、B、C 和D 分别为 RAPD 引物 S436、S438、S1398 和 S1496 的扩增图谱
(1～ 14 为材料编号同表 1,“M ”为DNA 分子量标准,“! ”表示多态性位点)
F ig. 1　A ,B, C and D are the amp lified p rofile w ith p rim er S436, S438, S1398 and S1496, 1～ 14 rep resen ts
the accession num ber listed in tab le 1 on fig 1～ 4.“M ”indicates DNA m arker: PCR m arker,
“! ”indicates po lymo rph ism locus
371　第 3 期　　　　　　　　段世华等: 红莲型杂交稻 (红莲 2 号)及其骨干亲本的 RA PD 分析与鉴定
增条带较为丰富的一方亲本相同, 即便是不完全显
性或部分显性的标记带, 杂种带的强度 (或亮度) 可
能较对应的亲本带弱些或介于双亲之间, 一般不会
出现双亲或双亲之一具有而杂种却不具有的扩增
带, 或杂种出现双亲不具有的扩增带[9 ]。
表 3　杂交水稻 (F1)及其亲本的 RAPD 多态性标记
T able 3　RA PD m arkers in hybrid rice (F 1) and their paren tal
引物
P rim er
分子量
M arker
size (bp )
杂交水稻 (F 1) ö亲本　　　　　H ybrid rice (F 1) öPaternal
T 207A T 207B 红莲 2 号Honglian22 YD 6205 明恢 63M inghui263 汕优 63Shanyou263 珍汕 97BZhenshan297B 珍汕 97AZhenshan297A
S436 1 700 - + - - - - + -
S438 1 560 - + - - - - + -
1 150 - - + + + + - -
S1398 1 100 - - - - + + - -
S1492 1 200 + + + - - + + +
1 100 + + + - - + + +
S1496 600 - - + + + + + +
注: + 、- 分别代表随机扩增片段的有无, 仅记录具有较好重复性的多态性片段。
N o tes: + o r - rep resen ts the po lymo rph ic sta te, + p resen t; - absen t. T he rep roducib le and po lymo rph ism frag2
m ents w ere reco rded.
　　通过对表 3 结果的分析和比较, 我们发现一些
标记只在杂种和其恢复系 (父本)中出现而在不育系
(母本) 和保持系中不存在, 故这些标记能有效地用
于鉴定杂种, 尤其是用于区别杂种与其不育系和保
持系。如表 3 中的 S438ö1150, S1398ö1100 等标记。
也有一些标记在保持系中出现而在不育系中则不存
在, 如 S436ö1700 标记, 能用于对不育系和保持系的
区分。
2. 2　杂交水稻亲本遗传关系分析
根据 18 个强多态性引物的扩增结果, 计算出
N ei 氏遗传距离 (见表 4) 并进行聚类分析 (见图 2)。
聚类结果表明: 不育系和保持系之间, 由于它们具相
同的核背景, 遗传差异很小。T 207A、T 207B 是分别
从粤泰A、粤泰B 中经过高度纯化选育的同核异质
体, 它们的相似系数 (GS )非常高, 达到 0199; 恢复系
与不育系间的遗传距离相对较大, 这说明了杂种优
势的原因; 各恢复系之间遗传差异较小, 从一定程度
上反应了恢复系遗传基础的匮乏; 杂种 (F 1) 的基因
型更倾向于恢复系, 而与不育系遗传距离大些。在
GS = 0177 处, 可将 14 个供试材料聚为两大类: 第一
表 4　杂交水稻 (F 1)及其亲本之间的遗传距离3
T able 4　Genetic distance betw een hybrid rice (F 1) and their paren tal
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 0. 0000
2 0. 0209 0. 0000
3 0. 1813 0. 1938 0. 0000
4 0. 2998 0. 3282 0. 1447 0. 0000
5 0. 3210 0. 3354 0. 3210 0. 2655 0. 0000
6 0. 5806 0. 5993 0. 5442 0. 3952 0. 6280 0. 0000
7 0. 2998 0. 2998 0. 3427 0. 3282 0. 2521 0. 4920 0. 0000
8 0. 5993 0. 5993 0. 5993 0. 4920 0. 5353 0. 4669 0. 4752 0. 0000
9 0. 3282 0. 3282 0. 2193 0. 1567 0. 2929 0. 3354 0. 2723 0. 4107 0. 0000
10 0. 2860 0. 2998 0. 2193 0. 2587 0. 3210 0. 4264 0. 2723 0. 4752 0. 1938 0. 0000
11 0. 3210 0. 3500 0. 2521 0. 2257 0. 3427 0. 4029 0. 3210 0. 4669 0. 1875 0. 1507 0. 0000
12 0. 2587 0. 2723 0. 1813 0. 2323 0. 3500 0. 4920 0. 3427 0. 5091 0. 1813 0. 2193 0. 1751 0. 0000
13 0. 1938 0. 1813 0. 2723 0. 2860 0. 2929 0. 5442 0. 2998 0. 5806 0. 2998 0. 3427 0. 3952 0. 2064 0. 0000
14 0. 2064 0. 2193 0. 2723 0. 2860 0. 2929 0. 5442 0. 3282 0. 5806 0. 2860 0. 3282 0. 3799 0. 1813 0. 0423 0. 00003 材料序号同表 1。3 T he accession num ber of m ateria ls is the sam e as tab le 1.
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图 2　根据 RAPD 数据用 UPGM A 法构建的树状图
F ig. 2　T he dendrogram generated by RA PD
data using U PGM A m ethod
类包含 12 个水稻材料。在GS = 0188 处, 又可以将
12 个材料分为 3 个亚类; 2 种类型的不育系与其相
应的保持系聚在一起后并为É 类; Ê 类包含有杂种
与其相应的父本 (恢复系)及CDR 22 和测 64 两个恢
复系; Ë 类为 E3221、IR 24 两个恢复系。特青和 IR 64
两个恢复系聚为第二类。从聚类结果也反应出红
莲22号组合较强于汕优 63 组合, 这与本实验室的育
种实践相符。
3　讨论
分子标记技术对作物的遗传关系和种质鉴定研
究与以往的形态标记、系谱分析、配合力表现及同工
酶等方法比较, 其表现出明显的优越性。RA PD 技
术由于引物短 (102m er) , 退火温度较低, 易导致引物
与模板的错配, 因此相对于其它分子标记, 如
R FL P、A FL P (Amp lif ied fragm en t length po lymo r2
ph ism )和 SSR (Simp le sequence repeat)等来说稳定
性较低[10 ]。但其快速、简便、灵敏度高和检测区域广
等特点, 使之在众多的分子标记技术中仍具有较大
的应用空间。许多研究表明, 只要严格控制反应条
件, 重复结果是可以得到的[6, 11, 12 ]。本研究中所选用
的 18 个引物在稳定的扩增条件下, 均表现出非常好
的重复性, 并对所选的水稻材料具良好的区分效果。
我国水稻雄性不育系遗传资源丰富, 但在生产
中应用面积较大的雄性不育系数量不多, 而大多数
集中在对野败型雄性不育系的选育和利用, 它们的
遗传背景比较单一。为了避免出现遗传的脆弱性, 防
止因遗传单一而造成的潜在危机, 需加大对不同细
胞质不育类型的不育系和保持系的开发力度, 使在
生产中的胞质不育类型向多极化发展。红莲型细胞
质雄性不育系的遗传特点, 虽然与其它类型的胞质
不育特点不同, 但从它们的选育过程来看却与其它
类型有着相同的来源[1 ] , 因此在聚类分析中表现出
较近的亲缘关系。另外, 生产中推广的籼型不育系的
恢复性基本上含有东南亚地区品种或品系的血
缘[13 ] , 因此它们之间也表现出较大的遗传相似性,
这也就导致它们在实际生产应用上具有很大的局限
性。本研究表明, 具有强优势组合的恢复性与不育系
之间, 表现出较远的遗传距离, 但由于它们的遗传背
景的单一性, 也提示我们利用现有的这些籼型不育
系和恢复系配制超高产组合的可能性较小。为了实
现杂交水稻的超高产, 有待于开发新的稻种资源, 充
分利用籼粳间遗传变异 (粳型或籼粳型不育系、恢复
系) , 引进新的有利基因。因此, 在分子水平了解杂交
水稻各亲本间的遗传关系, 对指导亲本的选配, 加快
育种进程具有非常重要的意义。
致谢: 在本论文的写作和修改过程中, 武汉大学遗传研
究所的李绍清博士对论文提出了宝贵的修改意见, 在此表示
衷心感谢!
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