全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (1) : 31～ 36
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
基于细胞核 rD NA ITS 片段的水青冈属的分子系统发育
李建强Ξ , 王恒昌, 李晓东, 李新伟
(中国科学院武汉植物研究所ö武汉植物园, 武汉　430074)
摘　要: 对山毛榉科水青冈属 6 种、1 亚种、1 栽培变种的 IT S 区片段进行了测序和分析, 并对其中 2 个具有 IT S 序
列多态性的分类群进行了 IT S 区克隆。水青冈属 IT S 系统发育树聚成两支, 位于基部的是分布于北美的大叶水青
冈, 另一分支则包括了欧洲和东亚的类群。在欧洲和东亚分支中, 又包括两支, 其中日本北部的波叶水青冈位于基
部, 台湾水青冈和欧亚大陆的水青冈形成另外一支。 IT S 区分析与现行的水青冈属基于形态学性状的属下分类系
统有一定差异, 而与本属现存物种的地理分布格局较为一致。各类群之间 IT S 区序列差异较小, 显示属内现存物种
的分化时间不是太长。
关键词: 水青冈属; 山毛榉科; 分子系统发育; 生物地理学; n rDNA ; IT S
中图分类号: Q 949. 736. 3　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0120031206
M olecular Phylogenetic Inference in F agus (Fagaceae) Based on ITS
( In terna l Tran scr ibed Spacer) Sequence of Nuclear R ibosomal D NA
L I J ian2Q iangΞ , W AN G H eng2Chang, L I X iao2Dong, L I X in2W ei
(W uhan B otan ica l Gard enöW uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, W uhan　430074, Ch ina)
Abstract: T he n rDNA IT S sequences of 6 species, 1 sub species and 1 cu lt iva ted variety of F ag us
w ere at ta ined and analyzed. O f them , tw o taxa w ith po lymo rph ic IT S sequences w ere iden t if ied
and cloned. T he mo st parsimony phylogenet ic t ree revealed tw o divergen t clades ex isted. In one
clade, the tw o cloned accession s of N o rth Am erican F. g rand if olia appeared in the basal po sit ion
of the tree. In ano ther clade, the Eu ropean and East A sian species included. T he Japan F. crena ta
w as rela t ively basal and sister to o ther tw o b ranches —— the tw o cloned accession s of F. hay a tae
sub sp. hay a tae (a sub species endem ic to T aiw an ) w h ich fo rm ed a b ranch, w h ile the Eu rasian
taxa, F. sy lva tica , F. sy lva tica cv. P u rp u rea , F. long ip etiola ta , F. hay a tae sub sp. p ashan ica and F.
eng leriana fo rm ed ano ther b ranch. R esu lt d id no t suppo rt the cu rren t F ag us infrageneric system
based on mo rpho logica l characters, nevertheless, very co incided w ith the genu s’s d ist ribu t ion pat2
tern. Since on ly a few varia t ion s of IT S sequences w ere found in the sequence alignm en t, specia2
t ion p rocess of the ex tan t F ag us m ay be occu rred no t too early.
Key words: F ag us; Fagaceae; M o lecu lar phylogeny; B iogeography; n rDNA ; IT S
　　水青冈属 (F ag us L. ) 是山毛榉科的一个小属,
仅 13 种、7 亚种[1 ] , 或 10 种[2 ]。该属植物为高大的落
叶乔木, 分布区从北纬 60°(挪威和瑞典) 到北纬
1915°(墨西哥) , 即包括了东亚、欧亚大陆西部和北
美东部的广大地区[3 ]。该属具有重要的经济价值, 同
时也是北半球森林植被的重要建群种, 是研究植物Ξ 收稿日期: 2002211203, 修回日期: 2003201209。基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39770062)。作者简介: 李建强 (1954- ) , 男, 研究员, 主要从事植物系统学研究。通讯作者 (A utho r fo r co rrespondence)。
系统演化和植物地理学的关键类群之一, 长期为植
物生态学家和植物系统学家所关注[4 6 ]。沈中桴
(1992) 主要依据形态学特征将水青冈属的 13 个物
种分为 2 亚属、4 组。他根据叶是否具有初生的ö次
生的小巢 (P rim aryöSecondary pocket2dom atia) 和
脉间区内是否具有发育完好的小脉将水青冈属分成
水青冈亚属 ( subgen. F ag us) 和米心水青冈亚属
( subgen. E ng leriana Camp ex Shen ) , 后者仅含 3
种、1 亚种, 分布于东亚。他进一步根据小坚果是否
具翅、表面是否有条纹、营养器官具有的毛被类型、
壳斗附属物的形态、气孔器的形态将水青冈亚属分
成 4 个组, 即长柄水青冈组 ( sect. L ong ip etiola tae
Shen ) , 含 4 种, 分布于中国; 光叶水青冈组 (sect.
L ucid ae Shen) , 含 3 种、2 亚种, 分布东亚; 水青冈组
(sect. F ag us) , 含 1 种、2 亚种, 分布欧亚大陆西部;
大叶水青冈组 ( sect. G rand if oliae Shen) 1 种、2 亚
种。有许多学者从形态学[7, 8 ]、孢粉学[9, 10 ]方面对本
属进行了研究, 且上述资料对于属的系统分类提供
了有益的线索; 此外,D enk 等采用基因、形态学和古
植物学证据对于水青冈属植物类群在欧亚大陆西部
的进化历史进行了研究[11 ]。但迄今为止, 还没有对
该属进行系统的分子系统发育分析的资料发表。核
rDNA 的 IT S 序列在植物系统与进化研究中, 尤其
在属和属下分类等级的系统学和分子地理学研
究[12 15 ]、杂交以及多倍化等研究中[14, 16 18 ]得到广泛
的应用。使用 IT S 序列讨论山毛榉科和邻近的南山
毛榉科属下分类系统只限很少报道[19 ]。本研究目的
在于: ①利用分子资料重建水青冈属的系统发育; ②
揭示分子系统发育与其地理分布之间的关系。
1　材料和方法
水青冈属 7 个物种 8 份实验材料取样, 包括了
2 个亚属 4 个组的代表植物 (表 1)。三棱栎属
(T rig onoba lanus)、栎属 (Q uercus)、栗属 (Castanea )
和南山毛榉科 (N o thofagaceae ) 的南山毛榉属
(N othof ag us) 的 IT S 序列与水青冈属的 IT S 序列
比较后, 发现栗属和南山毛榉属与水青冈属的 IT S
序列差别太大, 所以未选为外类群, 而选择轮叶三棱
栎 (T rig onoba lanus verticilla ta ) 和麻栎 (Q uercus a2
cu tissim a ) 为外类群。实验材料主要采自野外生境
(表 1)。凭证标本保存在中国科学院武汉植物研究
所标本馆 (H IB )。
表 1　实验材料来源、凭证标本号和基因库样品序号
T able 1　L ist of studied taxa w ith info rm ation of sourceövoucher specim ens, and GenBank accession num bers
Species　　　 SourceöV oucher GenBank accession
米心水青冈 F ag us eng leriana Seem. 湖北兴山, 黄汉东 01 A Y220148
台湾水青冈 F. hay a tae Palib in et H ay. ssp. hay a tae 台湾, 沈中桴 0010 A Y220142
巴山水青冈 F. hay a tae ssp. p ashann ica (C. C. Yang) Peters ex J. Q. L i 湖北兴山, 黄汉东 02 A Y220149
水青冈 F. long ip etiola ta Seem. 湖北兴山、黄汉东 03 A Y220147
波叶水青冈 F. crena ta B lum e 日本北海道, 周进 001 A Y220145
欧洲水青冈 F. sy lva tica L. 密西根州立大学校园栽培 A Y220146
紫叶水青冈 F. sy lva tica cv. Purpurea 密西根州立大学校园栽培
大叶水青冈 F. g land if olia Eh rh. 密西根州立大学校园栽培 A Y220143
轮叶三棱栎 T rig onoba lanus verticilla ta Fo rm an A F098413
麻栎Q uercus acu tissim a Carr. A F098428
　　从新鲜或硅胶干燥后的叶片中采用 CTAB
法[20 ]提取总DNA。 IT S 片段扩增采用以下 PCR 循
环: ( 1) 94℃, 115 m in; ( 2～ 31) 94℃, 115 m in;
55℃, 1 m in; 72℃, 115 m in; 和 (32) 72℃, 10 m in。
IT S4 和 IT S5 作为引物用来对 IT S 片段扩增和测
序[12, 14 ]。PCR 产物的纯化, 通过 110% 的凝胶电泳后
再进行 GenC lean (B io 101)。纯化产物通过AB I737
DNA 自动测序仪测序。所有 IT S 序列存放在 Gen2
Bank (表 1)。
少数实验材料的 IT S 区 PCR 产物直接测序产
生噪音干扰的序列 (N o isy sequence)。这些材料的
PCR 产物使用 TO PO TA 克隆, k its 被克隆进入质
粒 (P lasm id) 中。对于每份材料, 10 到 20 个正确插
入的 (经过EcoR I 消化所确定)、经过H inf É 限制性
内切酶酶切片段比较的克隆被筛选, 具有明显差别
的限制性片段类型的克隆被用于测序。
IT S 区序列采用C lu sta l W [21 ]和人工检测的方
法进行矩阵排列。PAU P 410 软件[22 ]用于数据分
析。空白 (Gap s)被编码为缺失 (M issing)。简约性分
析采用如下选项完成, 即: 树二组重新连接 (TBR )、
启发式搜索 (H eu rist ic search)、多重性选择 (M UL 2
TR EES op t ion)、A CCTRAN 优化和 100 次随机的
23 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
附加的重复、自展分析 (Boo tst rap ) 1 000 次重复[23 ] ,
‘M axT rees’设置到 500 次。基因树之间形状上的不
一致性采用软件中 T emp leton 检测法[24 ]评估。
2　结果
IT S 区序列共含 691 个碱基对。大多数具有 1
或 2 个碱基对的空位 (gap s) , 排列后的 IT S1、IT S2
和 518S rDNA 的长度分别为 258, 257 和 164 bp。在
所有的矩阵位点中, 含 152 个变异位点, 其中 74 个
为 信息位点。简约性分析得到 179 个最简树
(M PT s) , 严格一致性分析得到一个岛屿 (O ne is2
land) , 其步长 179, 一致性指数 (C I) 01939 8, 保持性
指数 (R I) 01943 8。随机抽样选出的最简树见图 1。
本研究共选取水青冈属 8 份实验材料, 其中 2
份从 PCR 产物直接测序的材料, 即台湾水青冈 (F.
hay a tae) 和大叶水青冈 (F. g rand if olia ) , 表现出
IT S 序列在复合的核苷酸位点上的多态性。这些
PCR 产物经过克隆, 趋异性的 IT S 被重复扩增, 经
过测序, 各个克隆得到了清晰的 IT S 序列, 并且应
用到系统发育分析中。
图 1　水青冈属基于细胞核 rD NA ITS 区的 178 棵最简约树之一
(树长= 179, 一致性指数= 01939 8, 保持性指数= 01943 8)
分类群名称后的数代表克隆数, 位于分支上的数值为自展支持率
F ig. 1　O ne of 178 mo st parsimony trees inferred from nrDNA IT Sö5. 8s region of F ag us
( tree length= 179, C I= 0. 939 8, R I= 0. 943 8)
A num ber fo llow ing a taxon nam e rep resen ts clone num ber. Boo tstrap values are indicated above the branch
　　分析表明, 本属的 7 个物种, 8 份材料聚成两
支, 并得到较高的自展支持率 (Boo tst rap value
84% )。如图 1, 分支É 为水青冈亚属大叶水青冈组
的大叶水青冈的 2 个克隆, 位于系统发育树的基部
(BV 94% )。米心水青冈亚属与水青冈亚属的其它 3
个组形成一个单系, 即分支Ê。这一支又包括 2 个亚
支, 其中分布于日本北部的波叶水青冈 (F. crena ta)
位于相对基部的位置; 另外一个亚支又分成 2 个小
支, 台湾特有的台湾水青冈的 2 个克隆 (BV 97% )
与欧亚大陆的类群构成姐妹群。欧亚大陆的 3 个种、
1 个亚种和 1 个栽培变种组成了系统发育树最大的
一支, 但自展率较低 (BV 57% )。从结果不难看出,
水青冈亚属并不组成一个单系, 这表现出与传统分
类学处理的不同。
33　第 1 期　　　　　　　　　　李建强等: 基于细胞核 rDNA IT S 片段的水青冈属的分子系统发育
3　讨论
沈中桴 (1992) 曾对水青冈属有比较全面的研
究, 他提出一个水青冈属 2 亚属、4 组的分类系
统[1 ]。IT S 区分析的结果却与之有较大的差异。即大
叶水青冈的 2 个克隆形成一支, 位于树的基部, 并得
到高自展支持率。该亚种曾被放在水青冈亚属, 作为
一个较为特化的大叶水青冈组的成员之一。 IT S 区
分析表明, 大叶水青冈代表了水青冈属的原始类群,
与基于形态性状建立的属下分类系统存在较大分
歧。本种与属内其它类群在外部形态上的显著差别
在于, 其三棱形坚果的棱脊上具发育完好的翅; 壳斗
附属物具有从线形到匙状叶形, 即从狭窄到宽阔多
种类型; 壳斗的表面具多条纵向排列的棱脊; 叶片
大, 侧脉多达 22 条, 边缘有锯齿或牙齿。如果 IT S
系统发育树正确反映了水青冈属的系统发育, 那么,
三棱形坚果的棱脊上具发育完好的翅, 以及壳斗的
表面具有多条纵向排列的棱脊, 可能代表了水青冈
属的近裔衍征 (Synapomo rphy)。从壳斗附属物具有
多种类型似乎可以推测该种经历了较长时间的进化
过程。
分支Ê 中, 波叶水青冈位于基部。该亚种曾被
放在水青冈亚属, 作为一个较为特化的光叶水青冈
组, 波叶水青冈系 (series C rena tae) 的成员之一。在
外部形态上它与本属其它类群的显著差别在于, 其
三棱形坚果的棱脊上略具翅; 壳斗附属物线形、反
卷, 至少在基部具有匙状叶形壳斗附属物; 侧脉最多
12 条, 叶边缘明显呈波状。如果 IT S 系统发育树正
确反映了水青冈属的系统发育, 那么, 叶边缘明显呈
波状则可能代表了水青冈属的另一个近裔衍征。
位于此分支Ê 中的台湾水青冈是一个十分有趣
的类群, 该种曾被作为台湾的特有种。20 世纪 70 年
代以后, 在中国大陆相继发表了与台湾水青冈近缘
的类群[24, 25 ] , 如四川的巴山水青冈 F. p ashann ica 和
浙江的浙江水青冈 F. hay a tae var. z hej iang ensis。后
来发现在湖北神农架分布的原来定名为光叶水青冈
F. lucid a 实际上是台湾水青冈[26 ]。关于台湾水青冈
的分类处理, 多数学者认为可以用地理亚种来区别,
原亚种分布于中国台湾, 其余分布于中国大陆上的
类群归并在一起, 作为亚种巴山水青冈[1, 27 29 ]; 少数
学者认为只保留台湾水青冈, 即将巴山水青冈、浙江
水青冈归并到台湾水青冈中[2 ]。台湾水青冈和巴山
水青冈在外部形态上与水青冈属其它类群的显著差
别在于其叶片、壳斗和坚果较小, 壳斗附属物线形,
粗壮而且先端向外反卷, 坚果明显具翅。以上依据外
部形态特征建立的台湾水青冈和它的近缘类群之间
的系统演化关系, 与 IT S 区的分析结果有些分歧。
台湾水青冈的两个克隆子独立地聚合成一支 (BV
97% ) , 而巴山水青冈未能与台湾水青冈聚合, 却先
与欧亚大陆分布的物种群, 尔后与长柄水青冈聚合
在一起 (BV 56% ) , 显示出水青冈属分子系统学的
结果与其地理分布格局较为一致。台湾水青冈复合
群的系统发育关系有待进一步采用多分子标记的研
究。
水青冈属 IT S 系统发育树相对特化的一支包
括了分布于欧亚大陆的类群 (BV 57% ) , 它们曾被
放在不同的亚属和组, 即欧洲水青冈 F. sy lva tica 和
其栽培变种紫叶水青冈 F. sy lva tica cv. Pu rpu rea,
长柄水青冈、巴山水青冈属于水青冈亚属, 而米心水
青冈 F. eng leriana 属于米心水青冈亚属。从外形上
看, 该群植物之间差别明显, 如欧洲水青冈叶片的背
面密被单细胞长毛, 叶边缘波状或齿状, 但决无锯
齿; 长柄水青冈叶片的背面被短的单细胞毛, 叶边缘
略有锯齿, 齿状或略为波状; 巴山水青冈叶片的背面
疏被单细胞长毛, 叶边缘有锯齿到有齿状或为波状;
米心水青冈叶片的背面被稀疏的丝状单细胞长毛,
且宿存在中肋和侧脉, 叶边缘略为波状或略为齿状
或略为锯齿状。基于 IT S 区序列的系统发育树不能
将上述物种区分, 上述物种在 IT S 片段碱基对之间
替换变异也极小。水青冈属各类群之间 IT S 区序列
差异较小 (图 2) , 显示属内现存物种的分化时间可
能不是太长。化石证据表明在中国第三纪植被组成
中, 水青冈属植物决不是一种重要的组成成分。可以
相信中国现存的水青冈林的最终发育形成很可能是
在第三纪以后[29 ]。分子和化石证据在现存水青冈属
植物分化的时间上是比较一致的。
水青冈属的起源, 依据不同资料, 不同作者有不
同的观点, 但基本上可以归为两种意见, 即本属起源
于亚洲还是北美? IT S 区分析的结果比较支持
T ralau 和 T anai 的观点[30, 31 ] , 他们依据化石资料提
出大叶水青冈是属内原始类群, 不太支持 T akh ta2
jian 提出的本属起源于亚洲东南部, 以及H ank s 和
Fairb ro thers 提出的起源于中亚南部的观点[32, 33 ]。
化石表明, 水青冈属植物可能在早渐新世时起源于
北美[34 ] , 至中新世时, 本属植物在古北大陆即可能
有了较广泛的分布。山毛榉科植物的现代地理分布
式样的形成, 应与大陆漂移而造成的隔离分化、气候
条件的剧烈变化、植物自身的生物学特性以及对于
43 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　
图 2　水青冈属的基于 K imura 双参数距离的邻接树
F ig. 2　T he neighbo r2jo in ing tree of F ag us based on K im ura tw o2param eter distances
不良环境的适应能力有关[3 ]。IT S 区分析表明, 本属
植物的形成与大陆漂移而引起的隔离分化存在着较
明显的对应关系 (图 2)。北美东部的大叶水青冈可
能代表了现存的水青冈属早出的类群, 它暗示欧亚
大陆与北美大陆分离的地史事件最早对于水青冈属
的物种形成产生影响。波叶水青冈分布于日本北部
本州岛西北部和北海道, 它的出现暗示日本与欧亚
大陆之间的分离; 而分布于台湾北部的台湾水青冈
的形成对应台湾岛和中国大陆之间分离关系。欧亚
和北美于白垩纪中期分离, 同时大西洋开始扩
张[35 ]。亚洲和美洲两大陆的联接一直到晚第三纪为
止, 所以两大陆的植物区系有很多相同之处, 借助于
早第三纪动物迁移的化石记录也可以获得证明[35 ]。
第三纪始新世和渐新世时, 黄海东海同日本部分陆
地相连。此后, 大陆架下沉而成为边缘浅海。琉球、
台湾都沉降为前缘深海, 并和太平洋连成一片[36 ]。
台湾海峡在渐新世时期和大陆相连, 由中新世化石
和海滩沉积可资证明, 到上新世闽南漳浦一带[37 ]。
这三次地质历史事件发生的次序与水青冈属 IT S
系统发育关系的较好吻合并非偶然, 它可能表明
IT S 区, 作为一个较好的分子标记, 对于植物分子地
理学研究具有潜在的价值。 IT S 区序列对于揭示植
物的物种形成与地史事件之间的相关性具有比较重
要的意义。
致谢: 桑涛博士提供了实验条件, 沈中桴博士和周进博
士提供部分实验材料, 在此一并致谢。
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