全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(４): ５０７~５１２
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ４０５０７
慈姑 ４５Ｓ ｒＤＮＡ和端粒序列检测及核型分析
佘朝文１ꎬ２ꎬ３∗ꎬ 蒋向辉１ꎬ２ꎬ３
(１. 怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室ꎬ 湖南怀化 ４１８００８ꎻ ２. 怀化学院湘西药用植物与
民族植物学湖南省高校重点实验室ꎬ 湖南怀化 ４１８００８ꎻ ３. 怀化学院生命科学系ꎬ 湖南怀化 ４１８００８)
摘　 要: 以 ４５Ｓ ｒＤＮＡ和拟南芥型端粒序列为探针对慈姑(Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.)有丝分裂中期染色体进行单色和双
色荧光原位杂交分析ꎬ 并用银染方法检测慈姑 ４５Ｓ ｒＤＮＡ位点的表达ꎬ 最后结合染色体测量数据和 ４５Ｓ ｒＤＮＡ杂交
信号建立慈姑的核型ꎮ 结果显示ꎬ 慈姑的单倍基因组总长度为 ７６􀆰 ９ ± １􀆰 ３８ μｍꎬ 最长染色体为 １１􀆰 ５５ ±
０􀆰 １０ μｍꎬ 最短染色体为 ４􀆰 ５４ ± ０􀆰２７ μｍꎻ 慈姑的核型公式为: ２ｎ ＝ ２２ ＝ ２ｍ ＋ ２ｓｍ ＋ １４ｓｔ ＋ ４ｔꎬ 核型不对称
性参数 ＣＩ、 Ａ１、 Ａ２、 Ａｓ Ｋ(％)、 ＡＩ分别为 １９􀆰 ８６ ± １１􀆰０６、 ０􀆰７２、 ０􀆰２７、 ７８􀆰 ８２、 １５􀆰２９ꎬ 核型属于 Ｓｔｅｂｂｉｎｓ类
型中的 ３Ｂ型ꎮ 慈姑具有 ３对 ４５Ｓ ｒＤＮＡ位点ꎬ 分别位于第 ８、 ９、 １０ 号染色体的短臂末端ꎮ 拟南芥型端粒序列
的杂交信号出现在慈姑每一条染色体的长、 短臂末端ꎮ 银染检测到 ６ 个 Ａｇ￣ＮＯＲ 和 ６ 个核仁ꎬ 表明 ３ 对 ４５Ｓ
ｒＤＮＡ 位点在间期核都有表达ꎮ 本研究结果为药食兼用植物慈姑提供了分子细胞遗传学基础资料ꎮ
关键词: 慈姑ꎻ 核型ꎻ ４５Ｓ ｒＤＮＡꎻ 端粒序列ꎻ 荧光原位杂交ꎻ 银染
中图分类号: Ｑ９４３　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０４￣０５０７￣０６
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣１２￣１７ꎬ 退修日期: ２０１５￣０１￣２８ꎮ
　 基金项目: 湖南省科技计划重点项目(２０１３ＦＪ４３２４)ꎮ
　 作者简介: 佘朝文(１９６４－)ꎬ 男ꎬ 博士ꎬ 教授ꎬ 研究方向为植物分子细胞遗传学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｈｅｃｈａｏｗｅｎ＠ｔｏｍ.ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｈｅｃｈａｏｗｅｎ＠ｔｏｍ.ｃｏｍ)ꎮ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.
ＳＨＥ Ｃｈａｏ￣Ｗｅｎ１ꎬ２ꎬ３∗ꎬ ＪＩＡＮＧ Ｘｉａｎｇ￣Ｈｕｉ１ꎬ２ꎬ３
(１. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｔｈｎｏｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｈｕａｉｈｕａꎬ Ｈｕｎａｎ ４１８００８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
２. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｘｉａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｅｔｈｎｏｂｏｔａｎｙ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ Ｈｕａｉｈｕａꎬ Ｈｕｎａｎ ４１８００８ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
３. Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈｕａｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈｕａｉｈｕａꎬ Ｈｕｎａｎ ４１８００８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｂａｓｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄａｔａ ｆｏｒ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.ꎬ ｓｉｎｇｌｅ￣
ａｎｄ ｄｕａｌ￣ｃｏｌｏｒ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ (ＦＩＳＨ) ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ
ｏｆ Ｓ. ｔｒｉｆｏｌｉａ ｗｉｔｈ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ￣ｔｙｐｅ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄꎬ ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｔｅｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｏｆ ｔｈｉｓ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｒＤＮＡ ＦＩＳＨ ｓｉｇｎａｌｓ.
Ｔｈｅ ｍｅａｎ ｈａｐｌｏｉｄ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ７６􀆰９０ ± １􀆰３８ μｍꎬ ｔｈｅ ｌｏｎｇｅｓｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｒ ｗａｓ
１１􀆰 ５５ ± ０􀆰１０ μｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔｅｓｔ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｒ ｗａｓ ４􀆰 ５４ ± ０􀆰２７ μｍ. Ｔｈｅ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ
ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｉｎｄｉｃｅｓꎬ ＣＩꎬ Ａ１ꎬ Ａ２ꎬ Ａｓ Ｋ(％) ａｎｄ ＡＩ ｗｅｒｅ １９􀆰 ８６ ±１１􀆰０６ꎬ ０􀆰７２ꎬ ０􀆰２７ꎬ ７８􀆰 ８２ ａｎｄ
１５􀆰２９ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｋａｒｙｏｔｙｐｅ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ３Ｂ ｔｙｐｅ ｏｆ Ｓｔｅｂｂｉｎｓ’
ｃａｔｅｇｏｒｙ. Ｔｈｒｅｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ
ａｒｍｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｐａｉｒｓ ８ꎬ ９ ａｎｄ １０ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. ＦＩＳＨ ｓｉｇｎａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ￣ｔｙｐｅ
ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｅｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ ａｒｍｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ｐａｉｒ. Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｓｉｘ Ａｇ￣ＮＯＲｓ ｏｎ ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｎｅ ｔｏ ｓｉｘ ｎｕｃｌｅｏｌｉ ｉｎ
ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｃｅｌｌｓꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ４５Ｓ ｓｉｔｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｔ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａꎻ Ｋａｒｙｏｔｙｐｅꎻ ４５Ｓ ｒＤＮＡꎻ Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ
ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ (ＦＩＳＨ)ꎻ Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ
　 　 慈 姑 ( Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.) 是 泽 泻 科
(Ａｌｉｓｍａｔａｃｅａｅ)慈姑属的多年生草本植物ꎬ 分布
于亚洲大部分地区ꎬ 在我国各地也有分布ꎮ 慈姑作
为药食兼用植物在我国被广泛栽培ꎮ 慈姑球茎富含
淀粉、 蛋白质、 多种维生素和钾、 磷、 锌等微量元
素ꎬ 对人体机能有调节促进作用ꎮ 慈姑性味苦甘、
微寒ꎬ 用于行血通淋ꎬ 治产后血闷、 胎衣不下、 淋
病、 咳嗽痰血[１]ꎮ 关于慈姑细胞遗传学研究ꎬ 已
有常规核型分析以及与慈姑属、 泽泻属其他物种核
型比较的研究报道[２－４]ꎬ 但还未见有对慈姑进行分
子细胞遗传学研究的报道ꎮ
采用荧光原位杂交( ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙ￣
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎꎬ ＦＩＳＨ)技术在染色体上定位 ｒＲＮＡ 基
因( ｒＤＮＡ)序列ꎬ 不仅可以确定 ｒＤＮＡ 在染色体上
的位置ꎬ 还可以为染色体的识别提供有效标
记[５－７]ꎮ 绝大多数高等植物染色体的末端都具有拟
南芥型端粒序列ꎬ 但也有少数例外[８ꎬ ９]ꎬ 采用
ＦＩＳＨ技术可以检测某个物种的染色体是否存在拟
南芥型端粒序列[１０]ꎮ 银染技术是较普遍应用于检
测核仁组织区(ＮＯＲ)在染色体上位置的方法[１１]ꎮ
根据分裂期染色体上是否产生深褐色的银染核仁组
织区(Ａｇ￣ＮＯＲ)能够确定 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 位点在间期核
是否表达[１２]ꎮ
本研究对慈姑的有丝分裂中期染色体进行 ４５Ｓ
ｒＤＮＡ和拟南芥型端粒序列的单色和双色 ＦＩＳＨ 分
析ꎬ 用银染方法检测慈姑 ４５Ｓ ｒＤＮＡ位点的表达情
况ꎬ 并结合染色体测量数据和 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 杂交信
号ꎬ 建立慈姑的分子细胞遗传学核型ꎬ 为慈姑基因
组的进一步研究提供基础资料ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料来源及染色体制片
实验材料慈姑(Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.)由武汉大
学生命科学学院胡中立教授提供和鉴定ꎮ 按照
Ｓｏｎｇ等的方法[１３]进行慈姑根尖有丝分裂染色体制
片ꎮ 取盆栽慈姑的根尖ꎬ 用饱和 α￣溴萘在室温下
预处理 ３ ｈꎬ 然后用甲醇 ∶ 冰醋酸(３ ∶ １)固定ꎻ 将
固定的根尖用水清洗后ꎬ 再用 １％的纤维素酶(ｃｅｌ￣
ｌｕｌａｓｅ ＲＳ)、 １％的果胶酶(ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ Ｙ２３)及 １％
的蜗牛酶(ｃｙｔｏｈｅｌｉｃａｓｅ)的混合液(用柠檬酸缓冲
液配制ꎬ ｐＨ ４􀆰 ５)在 ２８℃下酶解 ２􀆰 ５ ｈꎮ 用火焰干
燥法制片ꎮ 染色体装片置于－２０℃冰箱中贮存、
备用ꎮ
１􀆰 ２　 探针标记、 原位杂交和检测
４５Ｓ ｒＤＮＡ来自番茄基因组ꎬ 由美国 Ｎｅｂｒａｓ￣
ｋａ大学 Ａｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎ 教授提供ꎮ ４５Ｓ ｒＤＮＡ 片
段长度为 ９􀆰１ ｋｂꎬ 包括 ５􀆰８Ｓ、 １８Ｓ 和 ２５Ｓ 亚单位
和非转录的间隔区( ＩＧＳ)ꎬ 克隆载体为 ｐＵＣ１８ꎮ
用地高辛￣１１￣ＵＴＰ 缺口平移标记试剂盒 (Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ)标记分离纯化的 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 质粒ꎮ 端
粒序列克隆(ｐＡｔＴ４)来自拟南芥ꎬ 端粒重复 ＤＮＡ
片段的长度为 ４００ ｂｐꎬ 用生物素￣１６￣ＵＴＰ 缺口平
移试剂盒(Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ)标记分离纯化的端
粒序列质粒ꎮ
按照 Ｓｈｅ等的方法[１４]进行 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 单色原
位杂交和 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 与端粒序列的双色原位杂交ꎮ
用羊抗地高辛￣Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ(Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ)和
兔抗羊￣Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ (Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)检测和
放大地高辛标记的 ４５Ｓ ｒＤＮＡ杂交信号ꎮ 用链亲和
素￣ＣＹ３ (Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)和生物素化抗链
亲和素(Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)检测和放大生物素标
记的端粒序列杂交信号ꎮ
１􀆰 ３　 银染
按照 Ｈｏｗｅｌｌ和 Ｂｌａｃｋ的方法[１１]进行银染ꎮ 将
染色体制片在 ６５℃下干燥 ３０ ｍｉｎꎬ 然后取 ２０％明
胶溶液 １００ μＬ和 ５０％硝酸银溶液 ２００ μＬ(新配制
的)ꎬ 混合均匀ꎬ 涂布于装片的材料部位ꎻ 装片置
于培养皿中ꎬ 并于 ６０℃水浴处理 ５~６ ｍｉｎꎬ 取出
后用流水冲洗ꎬ 再加 ５％硫代硫酸钠处理 ４ ~
５ ｍｉｎꎬ 流水冲洗后于空气中干燥ꎮ
１􀆰 ４　 观察和拍照
在装有 ＣＣＤ 照相系统 ( Ｐｈｏｔｏｍａｔｒｉｃｓ Ｃｏｏｌ
ＳＮＡＰ ＥＺ)的 Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０ 荧光显微镜下观察
装片ꎬ 其照相系统采用 ＭｅｔＭｏｒｐｈ图像软件控制ꎮ
用含 ３０％抗淬灭剂(Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄꎬ Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａ￣
ｔｏｒｉｅｓ)的 ４′ꎬ６￣二脒基￣２￣苯基吲哚 (ＤＡＰＩ)溶液
８０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
(３ μｇ / ｍＬ) 对染色体进行复染ꎬ 分别用紫外
(ＵＶ)、 蓝色(ＷＢ)和绿色(ＷＧ)激发滤光片观察
ＤＡＰＩ染色、 地高辛标记和生物素标记的杂交信
号ꎮ 银染后的装片用 Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６０ 荧光显微镜
在普通光源下观察并拍照ꎮ 图片用 Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ 软
件处理ꎮ
１􀆰 ５　 核型分析
选取 ５个分散且形态良好的染色体中期分裂
相ꎬ 用 Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ 软件测量ꎬ 并按照李懋学和陈
瑞阳[１５]的方法分别计算单倍基因组绝对长度、 各
染色体的相对长度[(染色体长度÷ 单倍基因组总
长度)× １００％]和臂比(长臂÷短臂)、 染色体长度
比(最长染色体长度÷ 最短染色体长度)ꎬ 确定各
染色体的类型和 Ｓｔｅｂｂｉｎｓ 核型类型ꎮ 按 Ｒｏｍｅｒｏ
Ｚａｒｃｏ的方法[１６]计算染色体内不对称指数(Ａ１)和
染色体间不对称指数(Ａ２)ꎬ 按 Ａｒａｎｏ的方法[１７]计
算单倍染色体组中所有长臂占总长的比例[Ａｓ Ｋ
(％)]ꎬ 按 Ｐａｓｚｋｏ 的方法[１８]计算平均着丝粒指数
(ＣＩ)和核型不对称指数(ＡＩ)ꎮ 染色体按从长到短
顺序排列ꎮ 结合染色体测量数据和 ４５Ｓ ｒＤＮＡ信号
数据绘制核型模式图ꎮ
２　 结果与分析
慈姑的荧光原位杂交和银染结果见图版Ⅰꎮ 其
中ꎬ 图版Ⅰ: ａꎬ ｂ 分别是有丝分裂中期染色体及
其 ４５Ｓ ｒＤＮＡ荧光原位杂交图像ꎻ 图版Ⅰ: ｃ 是有
丝分裂中期染色体端粒序列与 ４５Ｓ ｒＤＮＡ双色荧光
原位杂交图像ꎻ 图版Ⅰ: ｄ是 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 荧光原位
杂交核型ꎻ 图版Ⅰ: ｅ 是有丝分裂染色体银染图
像ꎻ 图版Ⅰ: ｆ ~ｍ 是间期核银染图像ꎮ 慈姑的核
型分析数据见表 １ꎬ 核型模式图见图 １ꎮ
选取慈姑有丝分裂染色体凝缩最短的 ５个中期
分裂相(包括图版Ⅰ: ａꎬ ｂ 所示的分裂相)ꎬ 测得
单倍基因组总长度为 ７６􀆰 ９０ ± １􀆰 ３８ μｍꎬ 最长染色
体的长度为 １１􀆰 ５５ ± ０􀆰１０ μｍꎬ 最短染色体的长度
为 ４􀆰 ５４ ± ０􀆰 ２７ μｍꎮ 图版Ⅰ: ａꎬ ｂ所示的中期分
裂相的单倍基因组总长度为 ７８􀆰 ４９ μｍꎬ 最长染色
体为 １１􀆰 ６１ μｍꎬ 最短染色体为 ４􀆰 ８２ μｍꎻ 图版Ⅰ:
ｃ所展示的中期分裂相ꎬ 其染色体凝缩程度相对较
低ꎬ 其单倍基因组总长度为 １０２􀆰 ９８ μｍꎬ 最长染
色体为 １５􀆰 ８３ μｍꎬ 最短染色体为 ５􀆰 ８０ μｍꎮ 从表
１可以看出ꎬ 慈姑的核型公式为 ２ｎ ＝ ２２ ＝ ２ｍ ＋
２ｓｍ ＋ １４ｓｔ ＋ ４ｔꎬ 即除第 １ 号染色体为中部着丝
粒染色体、 第 １１号为近中部着丝粒染色体外ꎬ 有
７对染色体为近端部着丝粒染色体、 ２ 对染色体
(第 ２、 １０ 号染色体)为端部着丝粒染色体ꎮ 在前
期和中期染色体上没有观察到随体ꎮ 核型不对称性
参数 ＣＩ、 Ａ１、 Ａ２、 Ａｓ Ｋ(％)、 ＡＩ分别为 １９􀆰 ８６ ±
１１􀆰 ０６、 ０􀆰 ７２、 ０􀆰 ２７、 ７８􀆰 ８２、 １５􀆰 ２９ꎮ 基因组中
臂比大于 ２􀆰 ０ 的染色体占 ８２％ꎬ 染色体长度比为
２􀆰 ５９ꎬ 因此核型属于 Ｓｔｅｂｂｉｎｓ 类型中的 ３Ｂ 型ꎬ
即一种相当不对称的核型ꎮ
表 １　 慈姑染色体测量数据
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ Ｌ.
染色体编号
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｎｏ.
相对长度 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｅｎｇｔｈ (％)
短臂 ± ＳＤ
Ｓ ± ＳＤ
长臂 ± ＳＤ
Ｌ ± ＳＤ
总长度 ± ＳＤ
Ｔｏｔａｌ ± ＳＤ
臂比 ± ＳＤ
Ａｒｍ ｒａｔｉｏ ± ＳＤ
染色体类型
Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｙｐｅ
１ ７.２６ ± ０.２１ ７.８５ ± ０.１３ １５.１１ ± ０.２５ １.０８ ± ０.０４ ｍ
２ １.２７ ± ０.０４ ９.５２ ± ０.０５ １０.７９ ± ０.０８ ７.５２ ± ０.２２ ｔ
３ １.６５ ± ０.０６ ８.８９ ± ０.６１ １０.５４ ± ０.６６ ５.３８ ± ０.１９ ｓｔ
４ １.４５ ± ０.２１ ８.１７ ± ０.３１ ９.６２ ± ０.３２ ５.７１ ± ０.８８ ｓｔ
５ １.４９ ± ０.１３ ７.４５ ± ０.２０ ８.９４ ± ０.１８ ５.０２ ± ０.５４ ｓｔ
６ １.３７ ± ０.０７ ７.０２ ± ０.１７ ８.３９ ± ０.１２ ５.１３ ± ０.３７ ｓｔ
７ １.３１ ± ０.２２ ６.６７ ± ０.４５ ７.９８ ± ０.４０ ５.２２ ± １.１６ ｓｔ
８ １.２７ ± ０.１０ ６.６９ ± ０.２２ ７.９６ ± ０.３０ ５.２９ ± ０.３５ ｓｔ
９ １.１９ ± ０.０７ ６.３７ ± ０.２７ ７.５６ ± ０.３０ ５.３８ ± ０.３３ ｓｔ
１０ ０.９２ ± ０.１３ ６.３５ ± ０.２６ ７.２７ ± ０.２４ ７.０４ ± １.１３ ｔ
１１ １.９９ ± ０.１０ ３.８５ ± ０.１４ ５.８４ ± ０.２５ １.９４ ± ０.０８ ｓｍ
　 　 注: Ｓ和 Ｌ分别代表短臂和长臂ꎻ ＳＤ为标准差ꎮ
Ｎｏｔｅｓ: Ｓ ａｎｄ Ｌ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓｈｏｒｔ ａｒｍ ａｎｄ ｌｏｎｇ ａｒｍꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. ＳＤ: ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ.
９０５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 佘朝文等: 慈姑 ４５Ｓ ｒＤＮＡ和端粒序列检测及核型分析
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0
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%&() Chromosome number designated
图 １　 慈姑核型模式图(图中灰色表示 ４５Ｓ ｒＤＮＡ位点)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｉｄｉｏｇｒａｍ ｏｆ Ｓａｇｉｔｔａｒｉａ ｔｒｉｆｏｌｉａ (ｇｒｅｙ ｂｌｏｃｋｓ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｔｅｓ)
４５Ｓ ｒＤＮＡ单色 ＦＩＳＨ、 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 与端粒序列
的双色 ＦＩＳＨ均显示ꎬ 慈姑具有 ３ 对 ４５Ｓ ｒＤＮＡ 位
点(图版Ⅰ: ｂ ~ ｄ)ꎬ 分别位于第 ８、 ９、 １０ 号染
色体的短臂末端ꎬ 其中第 ８ 号染色体的 ４５Ｓ 位点
信号较强ꎬ 第 ９、 １０ 号染色体的 ４５Ｓ 位点信号较
弱且程度相近ꎮ 端粒序列探针在慈姑所有染色体的
长、 短臂的末端都产生了杂交信号ꎬ 并且在 ３ 对
４５Ｓ位点的顶端也能检测到端粒杂交信号(图版
Ⅰ: ｃ)ꎮ 不同染色体及不同染色体臂的端粒杂交
信号强弱存在差异ꎬ 少数染色单体的短臂或长臂末
端没有显示出杂交信号(图版Ⅰ: ｃ)ꎮ
慈姑的有丝分裂染色体经银染后显示出 ６ 个
Ａｇ￣ＮＯＲ信号(图版Ⅰ: ｅ)ꎬ 间期核显示出 １、 ２、
３、 ４和 ５ 个核仁ꎬ 最多有 ６ 个核仁(图版Ⅰ: ｆ ~
ｍ)ꎬ 表明慈姑的间期细胞具有明显的核仁融合现
象ꎮ 此外ꎬ 还观察到银染核仁即使数目相同ꎬ 但有
些细胞的几个核仁大小相近(图版Ⅰ: ｈꎬ ｋ)ꎬ 而
另一些细胞的几个核仁大小有较大(或很大)差别
(图版Ⅰ: ｇꎬ ｉꎬ ｊꎬ ｌꎬ ｍ)ꎮ
３　 讨论
李林初[３]和陈家宽[４]曾报道慈姑核型公式为
２ｎ ＝ ２ｍ ＋ ２ｓｍ ＋ １０ｓｔ ＋ ８ｔ和 ２ｎ ＝ ２ｍ ＋ ２ｓｍ ＋
１８ｓｔ(ＳＡＴ)ꎬ 核型属于 ３Ｂ 型ꎮ 本研究结果与他们
的基本相同ꎬ 即: 第 １对染色体为中部着丝粒染色
体ꎬ 第 １１对染色体为亚中部着丝粒染色体ꎬ 其余
染色体为近端部或端部着丝粒染色体ꎮ 但我们测得
的端部着丝粒染色体数与他们不同ꎬ 这可能是材料
和分析方法的差异所致ꎮ 我们测得的慈｀姑单倍基
因组长度显著长于陈家宽[４]的结果ꎬ 而略短于黄
国振等[２]和李林初[３]的结果ꎮ 有研究表明ꎬ 对同
一物种根尖有丝分裂进行阻断的方法和时间不同
会产生不同凝缩程度的中期染色体ꎬ 并导致染色
体长度产生较大差异[７] ꎮ 黄国振等[２]和李林初[３]
测得慈姑单倍基因组长度分别为 １１１􀆰 １６ μｍ 和
１１５􀆰 ４２ μｍꎬ 与本研究图版Ⅰ: ｃ所示的中期分裂
相的单倍基因组长度接近ꎮ 他们所展示的染色体的
凝缩程度也与本文图版Ⅰ: ｃ的染色体相似ꎬ 而明
显低于图版Ⅰ: ａ所示的染色体ꎮ
本研究荧光原位杂交结果显示ꎬ 慈姑具有 ３对
位于染色体短臂末端的 ４５Ｓ ｒＤＮＡ位点ꎬ 这也是慈
姑 ｒＤＮＡ物理定位的首次报道ꎮ 其 ３ 对 ４５Ｓ ｒＤＮＡ
杂交信号可以帮助我们准确地识别 ３对染色体ꎬ 提
高了核型分析的准确性ꎮ ＤＡＰＩ 染色观察发现ꎬ 这
３对 ４５Ｓ 位点没有形成随体结构ꎬ 这与黄振国
等[２]和李林初[３]的观察结果一致ꎬ 而与陈家宽[４]
观察到 １对随体染色体的结果不同ꎮ 本研究中 ３对
４５Ｓ位点没有形成随体结构可能与这些位点所含的
４５Ｓ ｒＤＮＡ 拷贝数较低有关ꎮ 有研究表明ꎬ ＦＩＳＨ
杂交信号的大小与 ｒＤＮＡ 位点所含的 ｒＲＮＡ 基因拷
贝数呈正相关[１９]ꎬ 我们的研究结果中除第 ８ 号染
色体的 ４５Ｓ位点信号较强外ꎬ 第 ９和 １０号染色体
上的信号都较弱ꎬ 说明这些位点的基因拷贝数较
低ꎮ 然而ꎬ 分裂期染色体和间期核的银染结果都表
明这 ３对 ４５Ｓ 位点在间期有表达ꎬ 即都是具有转
录活性的 ＮＯＲ[１２]ꎬ 而且存在明显的核仁融合现
象ꎮ 我们观察到慈姑的 ３对 ｒＤＮＡ位点大小差别不
大ꎬ 但核仁大小有显著差异ꎬ 这可能是由于非同源
和同源位点间 ｒＲＮＡ基因表达活性的差异而非位点
间 ｒＤＮＡ拷贝数的差异所致[２０]ꎮ
端粒作为染色体的重要功能元件ꎬ 对维持染色
体的完整和稳定十分重要ꎮ 已有研究表明ꎬ 大多数
植物的端粒是由拟南芥型的保守重复 ＤＮＡ 序列
５’ ￣(ＴＴＴＡＧＧＧ) ｎ￣３’构成ꎬ 仅在葱属(Ａｌｌｉｕｍ)和芦
荟属(Ａｌｏｅ)的物种中发现了例外[８ꎬ９]ꎮ 我们的研究
证实慈姑染色体的端粒是由拟南芥型端粒序列构
成ꎬ 并且双色 ＦＩＳＨ证明所有 ４５Ｓ 位点的末端都存
在端粒序列ꎮ 拟南芥型的端粒重复序列阵列的长度
在不同物种间和同一物种的不同染色体末端间均存
０１５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
在差异ꎬ 具有较少或很少端粒序列拷贝数的端粒ꎬ
即便在对杂交信号进行放大的情况下其检出的重现
性也不是很高[１０ꎬ２１]ꎬ 这可能是本研究中少数染色
单体末端没有显示杂交信号的原因ꎮ
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１１５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 佘朝文等: 慈姑 ４５Ｓ ｒＤＮＡ和端粒序列检测及核型分析
佘朝文等: 图版 Ⅰ ＳＨＥ Ｃｈａｏ￣Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ.: Ｐｌａｔｅ Ⅰ
d
a c
1
2
3
4 5
6
7
8
9
10
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
b
1
2
3
4
5
67
8
9
10
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
f g h i
j k l me
慈姑 ４５Ｓ ｒＤＮＡ和端粒序列探针荧光原位杂交的有丝分裂中期染色体、 银染的早中期染色体及间期核ꎮ ａ: ＤＡＰＩ染色
的有丝分裂中期染色体ꎻ ｂ: ４５Ｓ ｒＤＮＡ单色 ＦＩＳＨꎬ 显示 ３ 对 ４５Ｓ ｒＤＮＡ位点(绿色)ꎻ ｃ: ４５Ｓ ｒＤＮＡ 和端粒序列双色
ＦＩＳＨꎬ 绿色为 ４５Ｓ信号ꎬ 红色为端粒信号ꎻ ｄ: 显示 ４５Ｓ杂交信号的核型ꎻ ｅ: 银染的有丝分裂早中期染色体ꎬ 显示 ６
个深染 Ａｇ￣ＮＯＲꎻ ｆ~ｍ: 银染的间期核ꎬ 分别显示 １~６ 个深染的核仁ꎮ ｂ 和 ｃ 中的数字为核型分析确定的染色体编
号ꎮ 标尺为 ５ μｍꎮ
Ｍｉｔｏｔｉｃ ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｆｔｅｒ ＦＩＳＨ ｗｉｔｈ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓꎬ ａｎｄ ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｎｕｃｌｅｉ ａｆｔｅｒ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ Ｓ. ｔｒｉｆｏｌｉａ. ａ: Ｍｉｔｏｔｉｃ ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ
ＤＡＰＩꎻ ｂ: ＦＩＳＨ ｗｉｔｈ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｏｂｅ ｏｎｌｙꎬ ｓｈｏｗｉｎｇ ｔｈｒｅｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ４５Ｓ ｓｉｔｅｓ (ｇｒｅｅｎ)ꎻ ｃ: ＦＩＳＨ ｗｉｔｈ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ｔｅ￣
ｌｏｍｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｗｈｉｃｈ ｇｒｅｅｎ ａｎｄ ｒｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ４５Ｓ ａｎｄ ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｓｉｇｎａｌｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ ｄ: Ｋａｒｙｏｔｙｐｅ
ｓｈｏｗｉｎｇ ４５Ｓ ｒＤＮＡ ＦＩＳＨ ｓｉｇｎａｌｓꎻ ｅ: Ｍｉｔｏｔｉｃ ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｉｎｇ ｓｉｘ ｄｅｅｐｌｙ
ｓｔａｉｎｅｄ Ａｇ￣ＮＯＲｓꎻ ｆ －ｍ: Ｓｉｌｖｅｒ￣ｓｔａｉｎｅｄ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｎｕｃｌｅｉ ｓｈｏｗｉｎｇ １－６ ｄｅｅｐｌｙ ｓｔａｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｌｉꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｂ ａｎｄ ｃ ａｒｅ ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ. Ｂａｒｓ ＝ ５ μｍ.
(责任编辑: 张 平)
２１５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷