全 文 ：植物科学学报 ２０１５ꎬ ３３(４): ４９９~５０６
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ＤＯＩ:１０ １１９１３ / ＰＳＪ ２０９５－０８３７ ２０１５ ４０４９９
盐穗木钾转运蛋白基因 ＨｃＫＵＰ１２的
克隆及在盐胁迫下的表达分析
杨中敏ꎬ 王 艳∗
(新疆大学生命科学与技术学院ꎬ 新疆生物资源基因工程重点实验室ꎬ 乌鲁木齐 ８３００４６)
摘 要: 利用 ＲＡＣＥ技术从盐生植物盐穗木(Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ)中克隆获得了一个钾离子转运体基因ꎬ 经
ＢＬＡＳＴ同源比对发现该基因与拟南芥钾离子转运蛋白 ＡｔＫＵＰ１２ 基因最为相似ꎬ 命名为 ＨｃＫＵＰ１２ꎮ ＨｃＫＵＰ１２
基因 ｃＤＮＡ全长为 ２９５３ ｂｐꎬ 含有 ２５４４ ｂｐ的阅读框、 ２６２ ｂｐ的 ５′￣ＵＴＲ和 １４７ ｂｐ的 ３′￣ＵＴＲꎬ 编码 ８４７个氨基
酸ꎬ 分子质量为 ９３３１ ｋＤꎬ 理论等电点为 ７１９ꎮ 利用实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析了 ＨｃＫＵＰ１２ 基因在
６００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ处理下胁迫 ２４ ｈ的表达模式ꎬ 结果显示该基因在盐胁迫下表达量显著增加ꎬ 至处理 ２４ ｈ时达
到最高(为对照的 ２２５倍)ꎬ 初步推测其可能是与盐穗木耐盐相关的一个候选基因ꎮ
关键词: 盐穗木ꎻ 钾转运蛋白基因 ＨｃＫＵＰ１２ꎻ 克隆ꎻ 盐胁迫ꎻ 表达分析
中图分类号: Ｑ９４３２ 文献标识码: Ａ 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０４￣０４９９￣０８
收稿日期: ２０１５￣０２￣１６ꎬ 退修日期: ２０１５￣０３￣３１ꎮ
基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金项目(３１４００７２９)ꎮ
作者简介: 杨中敏(１９８７－ )ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为盐生植物抗逆的分子机制(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙａｎｇｚｈｏｎｇｍｉｎ１６１２２０＠１２６ ｃｏｍ)ꎮ
∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗａｎｇｙａｎｘｊｕ＠１２６ ｃｏｍ)ꎮ
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ (ＨｃＫＵＰ１２) ｆｒｏｍ
Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｕｎｄｅｒ Ｓａｌｔ Ｓｔｒｅｓｓ
ＹＡＮＧ Ｚｈｏｎｇ￣Ｍｉｎꎬ ＷＡＮＧ Ｙａｎ∗
(Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｕｒｕｍｑｉ ８３００４６ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ ｂｙ
ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥꎬ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＢＬＡＳＴ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ
ＡｔＫＵＰ１２ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａꎬ ｓｏ ｎａｍｅｄ ＨｃＫＵＰ１２. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＨｃＫＵＰ１２
ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ ２６２ ｂｐ ５′￣ＵＴＲꎬ １４７ ｂｐ ３′￣ＵＴＲ ａｎｄ ２５４４ ｂｐ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ８４７
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ９３３１ ｋＤ ａｎｄ ａｎ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ７１９. Ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｗａｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ６００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ ｓｔｒｅｓｓ ｄｕｒｉｎｇ ２４ ｈ ｕｓｉｎｇ
ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑＲＴ￣ＰＣＲ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｎｄ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ (２２５ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ) ａｆｔｅｒ ２４ ｈ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ. Ｔｈｉｓ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓａｌｔ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａꎻ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ＨｃＫＵＰ１２ꎻ Ｃｌｏｎｉｎｇꎻ Ｓａｌｔ
ｓｔｒｅｓｓꎻ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
盐分是限制农作物生长以及造成作物减产的最
严重的非生物胁迫之一[１ꎬ２]ꎬ 高盐胁迫将会引发一
些对植物不利的次生胁迫ꎬ 如渗透胁迫、 离子毒
害、 营养失衡等ꎮ 植物对盐的耐受能力主要体现在
对 Ｎａ＋毒害的适应能力以及本身 Ｋ＋的营养状况[３]ꎮ
Ｋ＋在高等植物的多种细胞活动中起着非常重要的
作用ꎬ 如气孔运动、 细胞延伸、 酶功能、 信号转导
以及维持细胞膜电位稳定等[４]ꎮ 植物对 Ｋ＋的吸收、
转运与分配主要通过钾离子通道和转运蛋白完
成[５]ꎬ 而钾离子转运蛋白主要承担了植物对 Ｋ＋的
高亲和吸收[６]ꎮ ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ ( Ｋ＋ Ｕｐｔａｋｅ Ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ / Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｋ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ / Ｋ＋ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ)
家族是一个受 Ｋ＋饥饿诱导表达的钾转运体大家
族[７]ꎬ 其成员广泛分布在植物的不同组织和器官ꎮ
ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ转运蛋白自首次在大麦中发现和报
道以来ꎬ 已在多种高等植物中相继被克隆与鉴
定[８]ꎬ 如在拟南芥中有 １３个成员[９]ꎬ 水稻中有 ２７
个成员[５]ꎮ ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 为 Ｈ＋ / Ｋ＋的同向转运
体[１０]ꎬ 并具有一些保守结构域ꎬ 例如 ＫＱＸＸＡＬ￣
ＧＣＦＰＫＸＫＩＶＨＴＳＸＫＸＸＧＱＩＹＩＰＥＮＷＩＬＭ[１１]和ＧＸＸＸＧ￣
ＤＸＸＸＳＰＬＹ[１２]ꎮ Ｏｓａｋａｂｅ 等[１３]研究表明ꎬ ＫＵＰ /
ＨＡＫ / ＫＴ转运蛋白家族参与了植物中的 Ｋ＋稳态以
及渗透调节ꎬ 在植物的生长发育、 逆境胁迫以及信
号转导途径中发挥着重要作用ꎮ
盐穗木(Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ Ｄｒｏｂ.)为藜科
盐穗木属盐生、 旱生的稀盐多汁半灌木植物ꎬ 对盐
分的适应性极强ꎬ 是重要的盐土荒漠植物之一[１４]ꎬ
也是盐生植物群落的建群种、 优势种或主要伴生
种[１５]ꎮ 笔者所在课题组前期建立了盐穗木在
６００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ处理下不同胁迫时间点的盐抑制
差减文库[１６]ꎬ 本研究以其中受盐胁迫诱导表达显
著上调编码 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 钾离子转运蛋白的 ＥＳＴ
序列 Ｈｃ５ｃ８ (ＧｅｎＢａｎｋ 序列号: ＨＳ５８６４９０１)作
为研究的靶序列ꎬ 利用 ＲＡＣＥ 技术克隆获得了该
基因全长ꎬ 经 ＢＬＡＳＴ 同源比对发现该基因与拟南
芥钾离子转运蛋白基因 ＡｔＫＵＰ１２ 最为相似ꎬ 命名
为 ＨｃＫＵＰ１２ꎻ 并对其在盐胁迫下的表达模式进行
初步研究ꎬ 为进一步探讨 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 家族成员
在盐穗木耐盐生物学机制中的作用途径解析提供
依据ꎮ
１ 材料与方法
１ １ 实验材料
将采自新疆通古特沙漠 １０３ 团盐穗木种子置
于温室中萌发ꎬ 培养条件: 基质为营养土 ∶珍珠岩
∶蛭石 ＝ ２∶ １∶ １ꎬ 温室内平均温度 ２５℃ꎬ 光照时间
１６ ｈ / ｄꎬ 相对湿度 ４０％ꎮ 待盐穗木幼苗生长至 ４
个月左右时ꎬ 取其同化枝作为实验材料ꎮ
１ ２ 实验方法
１ ２ １ 总 ＲＮＡ的提取
取约 ０１ ｇ盐穗木幼苗同化枝ꎬ 参照天根生化
科技有限公司植物组织试剂盒 (ＲＮＡｐｒｅｐ ｐｕｒｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ)的操作说明书并结合该公司的 ＲＮＡ￣
Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ试剂提取其总 ＲＮＡꎮ ＲＮＡ 的浓度和
纯度分别用 ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ分光光度计和琼脂糖凝胶
电泳进行检测ꎮ
１ ２ ２ ｃＤＮＡ的合成
根据 ＴａｋａＲａ公司Ｍ￣ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ
反转录合成 ｃＤＮＡ第一链ꎬ 用于基因全长的克隆和
定量分析ꎮ
１ ２ ３ ５′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ￣ｃＤＮＡ和 ３′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ￣
ｃＤＮＡ的合成
根据盐穗木盐抑制文库中 Ｈｃ５ｃ８ 的 ＥＳＴ 序
列ꎬ 按照 ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ 要求ꎬ 以 ＲＮＡ 为模板反转录合成 ５′￣ＲＡＣＥ￣
Ｒｅａｄｙ￣ｃＤＮＡ 和 ３′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ￣ｃＤＮＡꎻ 再利用
软件 Ｐｒｉｍｅｒ ５０分别设计 ２条 ５′￣ＲＡＣＥ引物(ＨｃＫ￣
ＵＰ１２ＧＳＰ１ 和 ＨｃＫＵＰ１２ ＮＧＳＰ１)和 ２ 条 ３′￣ＲＡＣＥ
引物 (ＨｃＫＵＰ１２ＧＳＰ２和 ＨｃＫＵＰ１２ＮＧＳＰ２)ꎬ 并委
托上海生物工程技术服务有限公司合成引物序列
(表 １)ꎮ
１ ２ ４ ５′￣ＲＡＣＥ末端和 ３′￣ＲＡＣＥ末端的扩增
参照 ＳＭＡＲＴｅｒＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ试剂盒说明书ꎬ
以 ５′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ￣ｃＤＮＡ和３′￣ＲＡＣＥ￣Ｒｅａｄｙ￣ｃＤＮＡ
表 １ 扩增引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列(５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＨｃＫＵＰ１２ ＧＳＰ１ ＴＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＴＣＣＡＴ
ＨｃＫＵＰ１２ ＮＧＳＰ１ ＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧＡＴ
ＨｃＫＵＰ１２ ＧＳＰ２ ＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＣ
ＨｃＫＵＰ１２ ＮＮＧＳＰ１ ＧＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＡＴＧ
ＨｃＫＵＰ１２ ＮＮＮＧＳＰ１ ＡＴＧＴＣＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡＧＣ
ＨｃＫＵＰ１２ ＮＧＳＰ２ ＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＴＡＴＣＧＧＴＧＴＧ
ＨｃＫＵＰ１２ ＦＰ１ ＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡＧＡＡＧ
ＨｃＫＵＰ１２ ＦＰ２ ＴＣＡＡＡＣＣＡＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＣＣＣ
ＲｑＨｃＫＵＰ１２ Ｐ１ ＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＣ
ＲｑＨｃＫＵＰ１２ Ｐ２ ＣＡＣＡＣＣＧＡＴＡＣＴＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＴＣ
Ｒｑａｃｔｉｎ Ｐ１ ＣＣＡＡＡＧＧＣＣＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＴ
Ｒｑａｃｔｉｎ Ｐ２ ＴＧＡＧＡＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡ
００５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷
为模板进行扩增ꎬ 获得 ３′￣ＲＡＣＥ 末端及部分 ５′￣
ＲＡＣＥ 末端ꎻ 基于部分 ５′￣ＲＡＣＥ 末端扩增的产物
序列ꎬ 我们又分别设计了 ＨｃＫＵＰ１２ ＮＮＧＳＰ１ 和
ＨｃＫＵＰ１２ ＮＮＮＧＳＰ１ 引物(表 １)进行了 ２ 次 ５′￣
ＲＡＣＥ末端的扩增ꎮ 每一次 ＰＣＲ 扩增产物均经
１０％琼脂糖凝胶电泳进行检测ꎬ 并利用 ＴＩＡＮＧＥＮ
公司的 ＰＣＲ产物回收试剂盒纯化扩增产物后ꎬ 再
连接到 ＴａＫａＲａ 公司的 ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体上ꎻ 通过转
化大肠杆菌 ＤＨ５αꎬ 利用蓝白斑筛选挑选出白斑过
夜摇菌ꎬ 菌液经 ＰＣＲ 扩增、 鉴定正确后送上海生
工生物工程股份有限公司测序ꎮ
１ ２ ５ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２基因全长的扩增
通过对已知 ＥＳＴ 序列、 扩增所获得的 ５′￣
ＲＡＣＥ 及 ３′￣ＲＡＣＥ末端 ３ 段序列进行拼接获得了
该基因全长 ｃＤＮＡ 序列ꎬ 并以此序列设计扩增开
放阅读框的引物 ＨｃＫＵＰ１２ ＦＰ１ 和 ＨｃＫＵＰ１２ ＦＰ２
(表 １)ꎻ 以盐穗木同化枝的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ 采用
ＴａＫａＲａ公司的 ＥｘＴａｑ 酶进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ 反应体
系参照说明书进行配制ꎮ ＰＣＲ 产物的检测、 回收、
转化及测序同 １ ２ ４ꎮ
１ ２ ６ 生物信息学分析
利用 ＤＮＡＭＡＮ软件对测序获得的序列进行比
对ꎬ 经拼接获得 ＨｃＫＵＰ１２ 基因的 ｃＤＮＡ 全长序
列ꎮ 运用 ＮＣＢＩ 的 ＣＤＤ (Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａ￣
ｔａｂａｓｅ)在线工具(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ /
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ. ｃｇｉ)对其功能结构域进行分
析ꎬ 并由 ＤＮＡＭＡＮ软件完成序列的多重比较ꎻ 利
用在线软件 ＥｘＰＡｓｙ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ /
ｔｏｏｌｓ / ｐｉｔｏｏ１.ｈｔｍ１)计算蛋白质的等电点及分子质
量ꎻ 利用 ＰｒｏｔＳｅａｌｅ ( ｈｔｔｐ: / / ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ /
ｐｒｏｔｓｅａｌｅ. ｈｔｍ１ ) 和 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐ: / / ｅｘｐａｓｙ.
ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ / ｐｍｔｐａｒａｍ.ｈｔｍ１)进行疏水性 /亲水性预
测ꎻ 根据在线软件 ＴＭＨＭＭ２０(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｃｂｓ.
ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ / ＴＭＨＭＭ / )分析目的蛋白的跨膜
区ꎻ 利用 ＰＳＯＲＴ(ｈｔｔｐ: / / ｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ / ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ)
分析蛋白质的亚细胞定位ꎻ 采用 ＮＰＳＡ＿ｓｅｒｖｅｒ(ｈｔ￣
ｔｐ: / / ｎｐｓａ￣ｐｂｉｌ.ｉｂｃｐ.ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?
ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｇｏｒ４.ｈｔｍｌ)和 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ(ｈｔｔｐ:
/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / )预测蛋白的二级结构
和三维空间模型ꎻ 选择 ＮＰＳ(ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.
ｉｂｃｐ.ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ / ＮＰＳＡ /
ｎｐｓａ＿ｓｅｒｖｅｒ.ｈｔｍｌ)的 ＰｒｏｓｉｔｅＳｃａｎ程序对蛋白质进
行活性位点分析ꎮ
１ ２ ７ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２基因的表达分析
将生长至 ４ 个月左右的盐穗木幼苗置于
６００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ 下进行胁迫处理ꎬ 并分别采集
处理后 ０、 １、 ６、 １２、 ２４ ｈ 时的盐穗木同化枝ꎮ
称取 ０１ ｇ样品ꎬ 参照天根生化科技有限公司植物
组织试剂盒(ＲＮＡｐｒｅｐ ｐｕｒｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ)说明书并
结合该公司的 ＲＮＡ￣Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅⅠ试剂提取植物总
ＲＮＡꎮ 根据 ＨｃＫＵＰ１２基因的 ｃＤＮＡ序列设计引物
ＲｑＨｃＫＵＰ１２ Ｐ１和 ＲｑＨｃＫＵＰ１２ Ｐ２(表 １)ꎬ 并以
β￣ａｃｔｉｎ 为内参基因ꎬ 参照 ＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ
Ｍｉｘ(Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 公
司)试剂盒说明书ꎬ 在 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７５００ 实时荧光
定量分析仪上进行 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增ꎬ 且采
用 ２－ΔΔｃｔ法分析数据ꎮ 每个取样时间点设 ３ 次生物
学重复ꎬ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 扩增设 ３ 次技术重复ꎬ 利用
Ｐｒｉｓｍ软件进行生物统计学分析ꎮ
２ 结果与分析
２ １ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２基因的克隆
根据盐穗木盐抑制差减文库中表达显著上调的
Ｈｃ５ｃ８ ＥＳＴ 序列(３０４ ｂｐ)ꎬ 分别设计了 ２ 个 ５′￣
ＲＡＣＥ和 ２ 个 ３′￣ＲＡＣＥ 的外侧扩增引物和巢式扩
增引物ꎬ 并利用 ＲＡＣＥ 技术获得了相应 ３′￣ＲＡＣＥ
末端(图 １: Ａ)ꎮ 由于该基因的片段较长ꎬ 基于上
一轮的扩增片段序列进行了 ３ 次 ５′￣ＲＡＣＥ 末端的
扩增ꎬ 最终获得了相应的 ５′￣ＲＡＣＥ 末端(图 １: Ｂ、
Ｃ、 Ｄ)ꎮ 利用 ＤＮＡＭＡＮ软件将 Ｈｃ５ｃ８ ＥＳＴ 序列、
扩增获得的 ５′￣ＲＡＣＥ 末端和 ３′￣ＲＡＣＥ 末端序列进
行拼接ꎬ 并以此拼接序列设计扩增全长的特异性引
物ꎬ 经 ＰＣＲ 扩增后获得了片段大小为 ２９５３ ｂｐ 的
ＨｃＫＵＰ１２基因全长 ｃＤＮＡ序列(图 １: Ｅ)ꎮ
２ ２ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２基因序列分析
通过生物信息学分析ꎬ ＨｃＫＵＰ１２ 基因的
ｃＤＮＡ序列包含 ２５４４ ｂｐ 的开放阅读框、 ２６２ ｂｐ
的 ５′￣ＵＴＲ(非编码区)和 １４７ ｂｐ 的 ３′￣ＵＴＲꎬ 编码
８４７个氨基酸ꎮ 经 ＮＣＢＩ 数据库中循环延迟分集
(ＣＤＤ)理论分析显示ꎬ 该蛋白属于钾离子转运超
１０５ 第 ４期 杨中敏: 盐穗木钾转运蛋白基因 ＨｃＫＵＰ１２的克隆及在盐胁迫下的表达分析
家族(图 ２)ꎮ
在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中ꎬ 将 ＨｃＫＵＰ１２ 蛋白的
氨基酸序列与拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)ＫＵＰ /
ＨＡＫ / ＫＴ钾离子转运家族的氨基酸序列进行比对分
析ꎬ 发现盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２蛋白具有 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ
家族的保守区域 ＧＸＸＸＧＤＸＸＸＳＰＬＹ 和 ＫＱＸＸＡＬ￣
ＧＣＦＰＫＸＫＩ ＶＨＴＳＸＫＸＸＧＱＩＹＩＰＥＮＷＩＬＭ (图 ３ 划线
处)ꎬ 且与拟南芥 ＡｔＫＵＰ１２ 蛋白的同源性最高(达
６９９５％)ꎮ
２ ３ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２蛋白理化性质预测分析
运用 ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｓｅｒｖｅｒ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在
线软件分析 ＨｃＫＵＰ１２ 的氨基酸理化性质表明ꎬ 该
蛋白的分子式为 Ｃ４２７２Ｈ６６９１Ｎ１０７９Ｏ１１８３Ｓ３８ꎬ 分子量大
小为 ９３３１ ｋＤꎬ 理论等电点为 ７１９ꎬ 脂肪系数为
１０４５２ꎬ 不稳定系数为 ３９０７ꎮ 采用软件 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ
和 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 对 ＨｃＫＵＰ１２ 的氨基酸进行疏水性 /
亲水性预测显示ꎬ该蛋白为疏水性蛋白ꎬ其平均
疏水性系数 ( ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙꎬ
ＧＲＡＶＹ)为 ０３５７ꎮ
根据在线跨膜区分析工具软件 ＴＭＨＭＭ ２０对
ＨｃＫＵＰ１２蛋白的跨膜区进行分析ꎬ 结果表明该蛋
白具有 １３ 个 ＴＭＳ(Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎｓ)跨
膜区(图 ４)ꎬ 其氨基酸位置分别为第 ９６ ~ １１８、
１３３ ~ １５５、 ２２５ ~ ２４７、 ２６７ ~ ２８４、 ２９１ ~ ３１３、
３１７ ~ ３３２、 ３３９ ~ ３５８、 ３６８ ~ ３９０、 ４１０ ~ ４３２、
４５８ ~ ４８０、 ４９３ ~ ５１５、 ５１９ ~ ５４１ 位ꎮ 利用
ＰＳＯＲ软件对 ＨｃＫＵＰ１２进行亚细胞定位预测ꎬ 显
示其定位于细胞质膜的可能系数最大(０８００)ꎬ 揭
示该蛋白很可能表达于细胞质膜ꎮ
利用在线工具 ＮＰＳＡ 预测 ＨｃＫＵＰ１２氨基酸序
列的二级结构ꎬ 结果显示该蛋白主要由 α￣螺旋、
延伸链、 无规则卷曲构成ꎬ 其中多肽链中 α￣螺旋
的氨基酸有 ２９３个ꎬ 占氨基酸总数的 ３４５９％ꎻ 延
伸链和无规则卷曲分别有氨基酸 ２０２ 个(２３８５％)
M1 M1 M1 M1 M2
A B C D E
Ａ: ＨｃＫＵＰ１２ ３’端扩增ꎻ Ｂ: ＨｃＫＵＰ１２ ５’端第 １次扩增ꎻ Ｃ: ＨｃＫＵＰ１２ ５’端第 ２次扩增ꎻ Ｄ: ＨｃＫＵＰ１２ ５’端
第 ３次扩增ꎻ Ｅ: ＨｃＫＵＰ１２ 开放阅读框扩增ꎮ
Ｍ１: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｍ２: ＤＬ５０００ ｍａｒｋｅｒꎻ Ａ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ３’ ￣ｅｎｄ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅꎻ Ｂ: Ａｍｐｌｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ５’ ￣ｅｎｄ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅ ( ｆｉｒｓｔ)ꎻ Ｃ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ５’ ￣ｅｎｄ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅ
(ｓｅｃｏｎｄ)ꎻ Ｄ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ５’ ￣ｅｎｄ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅ ( ｔｈｉｒｄ)ꎻ Ｅ: Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＯＲＦ
ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅ.
图 １ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２基因扩增
Ｆｉｇ １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨｃＫＵＰ１２ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ
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)*+ Superfamilies
1 125 250 375 500 625 750 847
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K trans superfamily_
图 ２ ＨｃＫＵＰ１２蛋白的保守结构域
Ｆｉｇ ２ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＨｃＫＵＰ１２ ｐｒｏｔｅｉｎ
２０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷
AtHAK5. seq
AtKUP2. seq
AtKUP3. seq
AtKUP4. seq
AtKUP5. seq
AtKUP6. seq
AtKUP7. seq
AtKUP8. seq
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HcKUP12. seq
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HcKUP12. seq
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ: ＡｔＫＵＰ１ (ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ. ＮＰ＿
１８０５６８１)ꎬ ＡｔＫＵＰ２ (ＮＰ＿５６５９３６１)ꎬ ＡｔＫＵＰ３ (ＮＰ＿１８６８５４１)ꎬ ＡｔＫＵＰ４ (ＮＰ＿１９４０９５２)ꎬ ＡｔＫＵＰ５ (ＮＰ＿
１９５０７９２)ꎬ ＡｔＫＵＰ６ (ＮＰ＿１７７１８７２)ꎬ ＡｔＫＵＰ７ (ＮＰ＿５６８２１３２)ꎬ ＡｔＫＵＰ８ (ＮＰ＿１９６９９２１)ꎬ ＡｔＫＵＰ９ (ＮＰ＿
１９３７２９２)ꎬ ＡｔＫＵＰ１０ (ＮＰ＿１７４３９７２)ꎬ ＡｔＫＵＰ１１ (ＮＰ＿００１０３１４８４１)ꎬ ＡｔＫＵＰ１２ (ＮＰ＿１７６２２２２)ꎬ ＡｔＨＡＫ５
(ＮＰ＿５６７４０４１) .
图 ３ 盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２与拟南芥 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ家族氨基酸序列的多重比对
Ｆｉｇ ３ Ｍｕｌｔｉａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｆｒｏｍ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ ｆａｍｉｌｙ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
TMHMM posterior probabilities for WEBSEQUENCE
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Pr
ob
ab
ilit
y
图 ４ 利用 ＴＭＨＭＭ分析 ＨｃＫＵＰ１２蛋白跨膜区域
Ｆｉｇ ４ ＨｃＫＵＰ１２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ
ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＴＭＨＭＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ
和 ３５２个(４１５６％)ꎬ 表明 α￣螺旋在此多肽链中占
有很大比例ꎮ 利用同源建模服务器 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ
对蛋白质三维结构的预测结果与二级结构相似(图
５)ꎬ 即 ＨｃＫＵＰ１２ 的三维空间结构主要是由 α￣螺
旋组成ꎮ
图 ５ ＨｃＫＵＰ１２的三维结构模型
Ｆｉｇ ５ Ｐｕｔａｔｉｖｅ ３Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２
利用软件 ＮＰＳ 的 ＰｒｏｓｉｔｅＳｃａｎ 程序对 ＨｃＫ￣
ＵＰ１２蛋白进行活性位点分析ꎬ 结果表明该蛋白具
有一类糖基化位点、 三类磷酸化位点、 一类豆蔻酰
３０５ 第 ４期 杨中敏: 盐穗木钾转运蛋白基因 ＨｃＫＵＰ１２的克隆及在盐胁迫下的表达分析
化位点和一类酰胺化位点(表 ２)ꎮ
２ ４ 盐胁迫下盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２的表达模式
以 β ￣ａｃｔｉｎ 作为内参基因ꎬ 采用实时荧光定量
ＲＴ￣ＰＣＲ的方法检测盐胁迫下不同处理时间点的盐
穗木同化枝 ＨｃＫＵＰ１２ ｍＲＮＡ 转录水平ꎮ 结果表
明ꎬ ６００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ 处理下ꎬ ＨｃＫＵＰ１２ 基因的
相对表达量随盐胁迫时间的延长呈现先升后降再大
幅上升的趋势ꎬ 至盐胁迫处理 ２４ ｈ 时ꎬ ＨｃＫＵＰ１２
的表达量达到最大ꎬ 且为对照的 ２２５倍(图 ６)ꎮ
３ 讨论
高等植物中钾离子的吸收和转运主要由生物膜
上的通道蛋白与载体蛋白控制ꎬ 其中植物 ＫＵＰ /
ＨＡＫ / ＫＴ家族所编码的载体蛋白介导了 Ｋ＋高亲和性
吸收及转运[１７]ꎮ 自该家族成员首次在大麦中发现以
来ꎬ 目前已在多种植物中发现其同源基因[１８ꎬ１９]ꎮ
本实验利用 ＲＡＣＥ 技术从盐穗木中克隆获得
ＨｃＫＵＰ１２基因ꎬ 通过核苷酸序列比对显示该基因
属于钾离子转运超家族成员ꎻ 氨基酸序列比对也表
明该基因编码的蛋白与拟南芥 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 转运
体具有相同保守区域(图 ３)ꎬ 且与拟南芥 ＡｔＫＴ /
ＫＵＰ１２的同源性最高ꎮ 拟南芥 ＡｔＫＴ / ＫＵＰ１２ 定位
于叶绿体膜ꎬ 并且在嫩叶中表达量最高[２０]ꎬ 钾离
子对 ＣＯ２的固定具有重要作用ꎬ 推测 ＡｔＫＴ / ＫＵＰ１２
可能参与了植物的光合作用[２１]ꎮ ＨｃＫＵＰ１２ 的跨
膜区分析显示ꎬ其具有１３个跨膜区并在２、３跨膜
表 ２ 利用 ＮＰＳ对 ＨｃＫＵＰ１２蛋白活性位点的预测分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｏｆ ＨｃＫＵＰ１２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｔｅ / ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐｒｏｓｃａｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ＮＰＳ
活性位点
Ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ
序列号
Ｐｒｏｓｉｔｅ
ａｃｃｅｓｓ Ｎｏ.
膜体类型
Ｍｏｔｉｆ ｍｏｄｅｌ
氨基酸序列
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
概率值
Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ
糖基化位点
Ｎ￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ＰＳ００００１ Ｎ￣{Ｐ} ￣[ＳＴ] ￣{Ｐ} ３３５
－３３８ ＮＧＴＱ ５.１４ｅ－０３
ｃＡＭＰ￣和 ｃＧＭＰ￣依赖性蛋白激酶磷酸化
位点 ｃＡＭＰ￣ ａｎｄ ｃＧＭＰ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
ＰＳ００００４ [ＲＫ](２) ￣Ｘ￣[ＳＴ] ８０２－８０５ ＫＫＱＳ １.５７ｅ－０３
蛋白激酶 Ｃ磷酸化位点
Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ＰＳ００００５ [ＳＴ] ￣Ｘ￣[ＲＫ]
１１－１３ ＴＬＲ ２２－２４ ＴＳＲ
５７－５９ ＳＶＫ ９２－９４ ＴＷＲ
１９５－１９７ ＳＦＲ ２１０－２１２ ＳＩＫ
２８６－２８８ ＴＳＫ ３９８－４００ ＴＥＲ
４５４－４５６ ＴＳＫ ４５５－４５７ ＳＫＫ
４８１－４８３ ＴＦＲ ５９５－５９７ ＴＶＲ
６８８－６９０ ＳＬＫ ７１７－７１９ ＳＶＲ
１.４２ｅ－０２
酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点
Ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ⅱ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ＰＳ００００６ [ＳＴ] ￣Ｘ(２) ￣[ＤＥ]
３２－３５ ＳＳＥＤ ４０－４３ ＳＫＡＥ
１２９－１３２ ＳＥＩＤ ２１０－２１３ ＳＩＫＥ
３５１－３５４ ＴＧＡＥ ３９６－３９９ ＴＫＴＥ
４０５－４０８ ＳＶＰＤ ６８８－６９１ ＳＬＫＤ
７００－７０３ ＳＡＬＥ ７５５－７５８ ＳＫＡＥ
７６９－７７２ ＳＥＤＤ
１.４８ｅ－０２
Ｎ￣豆蔻酰化位点
Ｎ￣ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ＰＳ００００８
Ｇ￣{ＥＤＲＫＨＰＦＹＷ}×
(２) ￣[ＳＴＡＧＣＮ] ￣{Ｐ}
１６－２１ ＧＳＧＧＳＧ １８－２３ ＧＧＳＧＴＳ
１９－２４ ＧＳＧＴＳＲ ２８－３３ ＧＳＥＶＳＳ
５２－５７ ＧＳＰＳＧＳ １０４－１０９ＧＡＶＹＧＤ
１６５－１７０ ＧＧＴＦＡ Ｌ ２５７－２６２ ＧＱＩＫＧＦ
３４５－３５０ ＧＣＶＬＣ Ｉ ４８７－４９２ ＧＩＡＮＡＹ
５９０－５９５ＧＳＳＬＧＴ ６０２－６０７ ＧＬＶＹＮＥ
６９６－７０１ＧＡＲＤＳＡ ７２４－７２９ ＧＡＧＡＧＡ
７２６－７３１ＧＡＧＡＧＡ ７５１－７５６ ＧＡＳＲＳＫ
１.３９７ｅ－０２
酰胺化位点
Ａｍｉｄａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ＰＳ００００９ ｘ￣Ｇ￣[ＲＫ] ￣[ＲＫ] ６２
－６５ ＬＧＫＫ ８.６４ｅ－０４
４０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷
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Treatment time
300
200
100
0
0 1 6 12 24
c
b
bc bc
a
图柱上不同字母表示基因表达量在不同处理时间点之间具显著
差异(Ｐ < ００５)ꎮ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｎｏｒｍａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ
Ｐ < ０ ０５ ｌｅｖｅｌ ａｍｏｎｇ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔｓ.
图 ６ 盐胁迫下盐穗木 ＨｃＫＵＰ１２基因的表达模式
Ｆｉｇ ６ Ｔｅｍｐｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨｃＫＵＰ１２
ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ ｃａｓｐｉｃａ ｕｎｄｅｒ
ｓａｌｔ￣ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
区之间有一个朝向胞液的长的胞质环结构(图 ４)ꎬ
这与以往文献报道的植物 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 家族成员
结构特性一致[１７]ꎮ 活性位点分析表明ꎬ ＨｃＫＵＰ１２
编码的跨膜蛋白具有多类磷酸化位点(表 ２)ꎬ 而蛋
白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式
之一ꎬ 是真核细胞中一种较普遍的调控手段ꎮ 同时
磷酸化和去磷酸化也是最主要的信号转导方式之
一ꎬ 是生物体内信号传导过程中的重要环节ꎬ 可以
调节钾离子和氯离子进出细胞[２２]ꎮ 如拟南芥
ＫＵＰ６蛋白序列中 Ｒ￣Ｘ￣Ｘ￣Ｓ / Ｔ 的丝 /苏氨酸位点被
ＡＢＡ信号受体 ＰＹＲ(Ｐｙｒａｂａｔｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ)家族的
蛋白激酶 ＳＲＫ２Ｅ / ＯＳＴ１ / ＳｎＲＫ２６ 磷酸化ꎬ ＫＵＰ６
蛋白被活化后可进一步介导信号传导致使气孔关
闭ꎬ 从而减少植物水分持续流失、 增加植物的耐旱
能力[１３]ꎮ 综上分析ꎬ 我们推测 ＨｃＫＵＰ１２ 可能参
与了盐穗木在盐胁迫下的信号转导过程ꎮ
盐生植物在干旱、 高盐和低温胁迫下会通过引
发一系列分子反应和信号传递来诱导各种生化反
应ꎬ 以适应或抵御这些不利的环境胁迫ꎬ 并维持植
物细胞的渗透平衡[２３]ꎮ 实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 分
析的结果显示ꎬ 盐胁迫下 ＨｃＫＵＰ１２ 基因的表达量
均显著高于对照ꎬ 至盐胁迫处理 ２４ ｈ 时该基因的
表达量达到最大(为对照的 ２２５ 倍)ꎬ 说明该基因
受盐胁迫显著诱导(图 ６)ꎮ 盐胁迫对植物的伤害主
要是进入细胞的大量 Ｎａ＋对细胞造成毒害ꎬ 而细胞
钠中毒的原因则是竞争性的抑制了依赖 Ｋ＋激活的
酶活化和蛋白质的生物合成ꎬ 因此胞浆中 Ｋ＋ / Ｎａ＋
比值决定了细胞的代谢能力和植物最终在盐环境中
的生存能力ꎮ ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 家族作为 Ｈ＋ / Ｋ＋同向
转运体ꎬ 在其主动转运过程中可将 Ｈ＋和 Ｋ＋同时泵
入细胞[２４]ꎮ 故我们推测盐穗木可通过增加钾离子
转运蛋白基因的表达ꎬ 提高植物对钾离子的吸收和
转运即 Ｋ＋ / Ｎａ＋比值增加ꎬ 从而使植物保持自身生
理活动的稳定以增强植物对盐胁迫的耐受性ꎮ
ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 家族中ꎬ ＡｔＨＡＫ５ 在盐胁迫、
ＡｔＫＵＰ６在干旱胁迫中的作用已研究的较为深
入[２５]ꎬ 但该家族其他成员在植物抵御胁迫中的作
用报道较少ꎮ 虽然 ＨｃＫＵＰ１２基因在盐穗木耐盐途
径中的具体作用机制尚不清楚ꎬ 但本研究对 ＨｃＫ￣
ＵＰ１２基因的克隆及其在盐胁迫下的表达模式分析
为盐穗木的耐盐性及调控机制奠定了基础ꎬ 我们后
期也将通过对野生型拟南芥的过表达以及拟南芥
ａｔｋｕｐ１２突变体的遗传转化鉴定 ＨｃＫＵＰ１２ 基因在
盐穗木耐盐性中的功能ꎮ
参考文献:
[ １ ] 杨荣超ꎬ 蔡玉静ꎬ 邓春婷ꎬ 欧阳波ꎬ 叶志彪. 番茄两
个盐胁迫响应基因的 ｃＤＮＡ克隆及其表达分析[Ｊ] .
植物科学学报ꎬ ２０１１ꎬ ２９(２): １７８－１８２.
[ ２ ] 刘洁ꎬ 胡蝶ꎬ 楚海家ꎬ 闫娟ꎬ 李建强. 花苜蓿抗旱耐
盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标记筛选[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１３ꎬ
３１(５): ４９３－４９９.
[ ３ ] Ｇｉｅｒｔｈ Ｍꎬ Ｍａｓｅｒ Ｐ. Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ
ｐｌａｎｔｓ￣ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｋ＋ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎꎬ ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ａｎｄ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ[Ｊ] . ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔꎬ ２００７ꎬ ５８１(１２):
２３４８－２３５６.
[ ４ ] Ｈｙｕｎ ＴＫꎬ Ｒｉｍ Ｙꎬ Ｋｉｍ Ｅꎬ Ｋｉｍ ＪＳ. Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅ
ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＫＴ / ＨＡＫ /
ＫＵＰ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ (Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ Ｌ.)
[Ｊ] . Ｇｅｎｅｓ Ｇｅｎｏｍꎬ ２０１４ꎬ ３(３６): ３６５－３７４.
[ ５ ] Ｙａｎｇ ＺＦꎬ Ｇａｏ ＱＳꎬ Ｓｕｎ ＣＳꎬ Ｌｉ ＷＪꎬ Ｇｕ ＳＬꎬ Ｘｕ
ＣＷ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ
ｏｆ ＨＡＫ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｒｉｃｅ
(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ.) [Ｊ] . Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００９ꎬ
３６(３): １６１－１７２.
[ ６ ] Ｇｉｅｒｔｈ Ｍꎬ Ｍａｓｅｒ Ｐꎬ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＩ. Ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＡｔＨＡＫ５ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｋ＋ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ￣ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｈｉｇｈ￣ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｋ＋ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ＡＫＴ１ Ｋ＋ ｃｈａｎ￣
ｎｅｌ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ Ｋ＋ ｕｐｔａｋｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐ￣
５０５ 第 ４期 杨中敏: 盐穗木钾转运蛋白基因 ＨｃＫＵＰ１２的克隆及在盐胁迫下的表达分析
ｓｉｓ ｒｏｏｔｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００５ꎬ １３７(３): １１０５－
１１１４.
[ ７ ] 马小娟ꎬ 戚金亮ꎬ 印莉萍ꎬ 黄勤妮. 植物钾离子转运
相关蛋白及基因研究进展[Ｊ] . 首都师范大学学报:
自然科学报ꎬ ２００４ꎬ ２５(２): ４０－４５.
[ ８ ] Ａｓｈｌｅｙ ＭＫꎬ Ｇｒａｎｔ Ｍꎬ Ｇｒａｂｏｖ Ａ. Ｐｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ
ｔｏ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ: ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ
ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ[ Ｊ] . Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔꎬ ２００６ꎬ ５７(２):
４２５－４３６.
[ ９ ] Ｍäｓｅｒ Ｐꎬ Ｔｈｏｍｉｎｅ Ｓꎬ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＩꎬ Ｗａｒｄ ＪＭꎬ
Ｓｚｅ Ｈꎬ Ｔａｌｋｅ ＩＮꎬ Ｈｉｒｓｃｈｉ Ｋꎬ Ａｍｔｍａｎｎ Ａꎬ Ｍａａｔｈｕｉｓ
ＦＪꎬ Ｓａｎｄｅｒｓ Ｄꎬ Ｈａｒｐｅｒ ＪＦꎬ Ｔｃｈｉｅｕ Ｊꎬ Ｇｒｉｂｓｋｏｖ Ｍꎬ
Ｐｅｒｓａｎｓ ＭＷꎬ Ｓａｌｔ ＤＥꎬ Ｋｉｍ ＳＡꎬ Ｇｕｅｒｉｎｏｔ ＭＬ. Ｐｈｙ￣
ｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈｉｎ ｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ
ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００１ꎬ
１２６(４): １６４６－１６６７.
[１０] Ｒｕｂｉｏ Ｆꎬ Ｓａｎｔａ￣Ｍａｒíａ ＧＥꎬ Ｒｏｄｒíｇｕｅｚ￣Ｎａｖａｒｒｏ Ａ.
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｂａｒｌｅｙ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏ￣
ｄｉｎｇ ＨＡＫ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ
ｃｅｌｌｓ[Ｊ] . Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔａｒｕｍꎬ ２０００ꎬ １(１０９): ３４－
４３.
[１１] 宋志忠ꎬ 丛郁ꎬ 韩蕾ꎬ 王莉ꎬ 苏彦华. 葡萄基因组中
ＫＵＰ蛋白的生物信息学分析[Ｊ] . 基因组学与应用
生物学ꎬ ２０１１ꎬ ６(３０): ７２８－７３７.
[１２] 鲁黎明. 主要农作物钾吸收转运基因及其进化关系
分析 [ Ｊ] . 中国农业科学ꎬ ２００９ꎬ ４２ (７): ２２７１ －
２２７９.
[１３] Ｏｓａｋａｂｅ Ｙꎬ Ａｒｉｎａｇａ Ｎꎬ Ｕｍｅｚａｗａ Ｔꎬ Ｋａｔｓｕｒａ Ｓꎬ
Ｎａｇａｍａｃｈｉ Ｋꎬ Ｔａｎａｋａ Ｈꎬ Ｏｈｉｒａｋｉ Ｈꎬ Ｙａｍａｄａ Ｋꎬ
Ｓｅｏ ＳＵꎬ Ａｂｏ Ｍꎬ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｅꎬ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ￣Ｓｈｉ￣
ｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ. Ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ
ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓ￣
ｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２０１３ꎬ ２５
(２): ６０９－６２４.
[１４] 陶大勇. 盐穗木研究进展[Ｊ] . 安徽农业学报ꎬ ２００７ꎬ
３５(２０): ６０８３－６０８４.
[１５] 郗金标ꎬ 张福锁ꎬ 毛达如ꎬ 田长彦ꎬ 董振成ꎬ 王开芳.
新疆盐生植物群落物种多样性及其分布规律的初步
研究[Ｊ] . 林业科学ꎬ ２００６ꎬ ４２(１０): ６－１２.
[１６] Ｌｉｕ Ｌꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ Ｚｅｎｇ ＹＬꎬ Ｈａｘｉｍ Ｙꎬ Ｚｈａｎｇ ＦＣ.
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈａｌｏｐｈｙｔｅ Ｈａｌｏｓｔａｃｈｙｓ
ｃａｓｐｉｃａ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ Ｏｒｇꎬ
２０１２ꎬ １１０(１): １－１２.
[１７] 鲁黎明ꎬ 杨铁钊. 烟草钾转运体基因 ＮｔＨＡＫ１ 的克
隆及表达模式分析[Ｊ] . 核农学报ꎬ ２０１１ꎬ ２５(３):
４６９－４７６.
[１８] Ｐｙｏ ＹＪꎬ Ｇｉｅｒｔｈ Ｍꎬ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＩꎬ Ｃｈｏ ＭＨ. Ｈｉｇｈ￣
ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｋ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ: ＡｔＨＡＫ５ ａｎｄ
ＡＫＴ１ ａｒｅ ｖｉｔａｌ ｆｏｒ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｏｓｔ￣
ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｕｎｄｅｒ ｌｏｗ￣ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｏｎｄｉ￣
ｔｉｏｎｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０１０ꎬ ２(１５３): ８６３－８７５.
[１９] 吴延寿ꎬ 陈春莲ꎬ 熊云华ꎬ 黄永萍ꎬ 周文红ꎬ 徐兰
香ꎬ 尹建华. 植物体内 Ｎａ / Ｋ 转运体研究进展[Ｊ] .
江西农业学报ꎬ ２０１０ꎬ ２２(６): ３７－４１.
[２０] Ａｈｎ ＳＪꎬ Ｓｈｉｎ Ｒꎬ Ｓｃｈａｃｈｔｍａｎ ＤＰ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
ＫＴ / ＫＵＰ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｏｏｔ
ｈａｉｒｓ ｉｎ Ｋ＋ ｕｐｔａｋｅ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２００４ꎬ １３４
(３): １１３５－１１４５.
[２１] Ｇｕｐｔａ Ｍꎬ Ｑｉｕ ＸＨꎬ Ｗａｎｇ Ｌꎬ Ｘｉｅ ＷＢꎬ Ｚｈａｎｇ ＣＪꎬ
Ｘｉｏｎｇ ＬＺ ꎬ Ｌｉａｎ ＸＭꎬ Ｚｈａｎｇ ＱＦ. ＫＴ / ＨＡＫ / ＫＵＰ ｐｏ￣
ｔａｓｓｉｕｍ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｗｈｏｌｅ－
ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｉｎ ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)
[Ｊ] . Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００８ꎬ ５(２８０): ４３７－
４５２
[２２] 朱晓玲ꎬ 陈海峰ꎬ 王程ꎬ 郝青南ꎬ 陈李淼ꎬ 郭丹丹ꎬ
伍宝朵ꎬ 陈水莲ꎬ 沙爱华ꎬ 周蓉ꎬ 周新安. 大豆钾转
运体基因 ＧｍＫＴ１２ 的克隆和信息学分析[Ｊ] . 作物
学报ꎬ ２０１３ꎬ ３９(９): １７０１－１７０９.
[２３] Ａｌａｋｈｖｅｒｄｉｅｖ ＳＩꎬ Ｓａｋａｍｏｔｏ Ａꎬ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ Ｙꎬ ｌｎａｂａ
Ｍꎬ Ｍｕｒａｔａ Ｎ. Ｉｏｎｉｃ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＮａＣｌ￣ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍｓ Ⅰ ａｎｄ Ⅱ ｉｎ
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０００ꎬ １２３
(３): １０４７－１０５６.
[２４] 杨中敏ꎬ 王艳. 钾离子转运载体 ＫＵＰ / ＨＡＫ / ＫＴ 家族
功能的研究进展 [ Ｊ] . 生物技术ꎬ ２０１４ꎬ ２４ (３):
１００－１０３.
[２５] Ｎｉｅｖｅｓ￣Ｃｏｒｄｏｎｅｓ Ｍꎬ Ａｌｅｍáｎ Ｆꎬ Ｍａｒｔíｎｅｚ Ｖꎬ Ｒｕ￣
ｂｉｏ Ｆ. Ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＨＡＫ５ Ｋ＋ ｔｒａｎｓｐｏｒ￣
ｔｅｒ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｋ＋ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ
ｆｒｏｍ ｌｏｗ Ｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｕｎｄｅｒ ｓａｌｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ [ Ｊ] .
Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔꎬ ２０１０ꎬ ２(３): ３２６－３３３.
(责任编辑: 刘艳玲)
６０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷