全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(3)：310—314
Journal of Wuhan Botanical Research
念珠藻葛仙米生理生化特性对不同低温胁迫的响应
苏彦平 ，李敦海h，
(1．中国科学院水生生物研究所 ，武汉 430072；
王坎 ，刘永定
2．中国科学院研究生院，北京 100039)
摘 要：研究了不同培养温度下对念珠藻葛仙米的生长和相关生理生化特性的变化。结果表明，低温抑制葛仙米
的生长 ，在 2~C～5~C低温下其生长甚至完全停止 ；在 IO~C低温胁迫下，其生长延滞期变长，其后仍能保持正常生
长。低温胁迫下，葛仙米光合系统 I(PSII)的光合效率( ／ z)的变化趋势与生长曲线相似；细胞电解质渗透率在
低温胁迫初期尚能保持比较低的水平，但随着时问延长而升高；可溶性糖和还原性糖含量的变化则随胁迫加剧有
不同程度升高。可溶性蛋白含量则在低温下保持比较低的水平。这些结果表明，低温对葛仙米的生长和光合作用
具有抑制作用，但葛仙米也表现出了一定的抵抗低温胁迫的能力，并通过调节细胞膜的渗透性、重新合成低温适应
调节物质(如总糖和可溶性糖等)来减少低温伤害 ，从而适应低温胁迫。
关键词：葛仙米；低温胁迫；电解质渗透率；可溶性糖 ；还原性糖；可溶性蛋白
中图分类号：Q945．78 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2008)03—0310—05
Response of Nostoc sphaeroides(Cyanobacterium)
to Low Culture Temperatures
SU Yan—Ping ，LI Dun—Hai ，WANG Kan ，LIU Yong—Ding
(1．Institute of Hydrobiology，The Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China；2．Graduate School of
e Chinese Academy ofSciences，Beijing 100039，China)
Abstract：The efects of low temperatures on some physiological and biochemical characteristics of Nostoc
sphaeroides ktitz．were studied．Results showed that the growth of N．sphaeroides was inhibited by low tem—
peratures，most severely，it was nearly ceased at 2℃ and 5℃ ，while，at IO~C，and normal growth was at—
tained after a prolonged lag phase．Change of photosynthetic activity(represented by Fv／Fm)inⅣ．spha—
eroides under low temperatures was similar to that of the growth．The perm eability of cell membrane could
maintain a low level at initial stage，and then increased with prolonged low temperature treatment．With
lower temperature stress，the contents of total sugar and reducing sugar increased to variant extents．Con—
tent of soluble protein in N．sphaeroides kept at a low level when it was subjected to chiling stress．Al the
results indicate that the growth and photosynthetic activity of N．sphaeroides could be inhibited by low tem—
perature，however，the algal cels can also show abilities of chill—resisting，adapting to low temperatures by
membrane permeability regulating and chiling—adjusting substances(such as total sugars and soluble
sugars)synthesizing．
Key words：Nostoc sphaeroides ktitz．；Chilling stress；Membrane perm eability；Total sugar；Soluble
protein
蓝藻是一类可光合放氧的原核生物。蓝藻的生
境遍布全世界，从南极的池塘到温泉均有分布。有
些喜低温种可以在 0~C温度下生长，而一些嗜热种
的生长温度则可以高于 60℃ 。低温对植物的影
响表现在对植物体蛋白质含量、酶活性、光合作用、
呼吸作用、离子浓度和细胞结构等方方面面 J。在
蓝藻的抗冷机理研究上，发现在低温下蓝藻通过合
成化合物来降低细胞液的凝固点，如合成氨基乙酸
甜菜碱 ，其他生物则合成多羟基醇 ]，这些化合
物的过冷效应(supercooling)可以使生物细胞内的
凝固点降至一20~C。近年来越来越多的研究发现，
在低温下蓝藻可通过提高细胞膜中多不饱和脂肪酸
的含量，从而提高膜的流动性，减少低温损伤 ]。
葛仙米学名拟球状念珠藻(Nostoc sphaeroids
收稿 日期：2007—09—29，修回日期 ：2007—11—14。
基金项 目：中国科学院前沿性创新课题(KSCX2一SW-332)、国家 973项目(2002CB412300)联合资助。
作者简介 ：苏彦平(1981一)，女，硕士研究生(E—mail：suyping@163．COB)。
$ 通讯作者(Author for correspondence．E-marl：lidh@ihb．ac．cn)。
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第 3期 苏彦平等：念珠藻葛仙米生理生化特性对不同低温胁迫的响应 311
ktitz．)属于蓝藻门蓝藻纲段殖藻 目念珠藻科植物，
在我国主要分布在湖北省鹤峰县的走马坪，具有悠
久的人类食用历史。在实验室条件下，葛仙米的培
养温度可高达 30℃以上，然而在鹤峰走马坪，该蓝
藻的球形或耳状大群体(maeroeolony)每年出现于
冬末春初的稻田中，环境温度较低。低温对葛仙米
群体的生理生化过程会产生什么影响?它是通过什
么方式应答并适应低温的?本研究正是基于寻找这
些问题的答案而展开的。
1 材料与方法
1．1 藻种、培养基与培养条件
葛仙 米 (拟 球 状 念 珠 藻，Nostoc sphaeroides
Ktitz．)藻株由本实验室于湖北省鹤峰县走马镇农田
采集并分离、纯化和保存。采用 BG一11 E6]培养基，
置 500 mL玻璃锥 形瓶 中通气培 养，通气 量为
300 mL／mm；白荧光灯光照强度为 100 ·m～·
s 一
。 培养温度 22℃左右。
1．2 梯度温度培养
收集对数生长期的球形群体 (直径约 1 him)，
用灭菌培养基洗涤数次，转移到 500 mL的锥形瓶
中。分别置于 2、5、10、15、20~C培养箱中继续通气
培养，各梯度温度均设 3个重复。分别于第 0、1 d
和其后每隔两天取藻体进行生理生化指标测定。
1．3 生长测定
取样时充分摇匀培养物，迅速用移液器取一定
体积的样品。待样品中葛仙米的球形群体全部沉积
到容器的底部后，弃去液体培养基，加 95％乙醇提
取叶绿素，4~C冰箱中过夜。测定 665 nm与 649 nm
处的光吸收 J。以公式 C=13．7×A 一5．76×
A斛9，计算叶绿素 a_含量( g·chl·a／mL)，以此表示
葛仙米的生长 J。
1．4 叶绿素荧光测定
叶绿素荧光用 Phyto—PAM (Heinz Walz GmbH，
Germany)室温下测定。用可变荧光(Fv)与最大荧
光(Fm)的比值 n ／Fm表示光合效能活性的大小。
1．5 电解质渗透率测定
采用电导仪测定法 。使用的电导率仪为 Orion
1 50A+型(Thenno Electron Corporation，USA)。取样
后将葛仙米球形群体用无离子水冲洗 3遍 ，然后加
一 定体积的去离子水，于室温下避光过夜，测定其溶
液初电导率(R )，再经沸水浴加热 15 min，冷却至
室温后，测其煮沸后最终电导率(R )。按公式计算
其电解质渗透率：电解质渗透率(％)=R ／Ri×
100％ 。
1．6 总糖和还原性糖的测定
取样后，部分藻体于 80℃烘箱中烘干称干重，
部分藻体用来测定总糖和还原性糖含量。采用蒽酮
比色法 ，配制 0．2％的蒽酮溶液，以5 g／mL葡萄糖
溶液制作标准瞌线，具体测定方法参见文献[9]。
葛仙米群体中可溶性糖和还原性糖的含量单位为
g干重。
1．7 可溶性蛋白的测定
取不同温度处理的样品，采用考马斯亮蓝 G一
250染色法测定可溶性蛋白含量。用牛血清蛋白配
成 100 mL的标准蛋白溶液，配制0～100 mL
的牛血清蛋白液，利用加入考马斯亮蓝 G-250变色，
在595 nm下比色。以蛋白质为横坐标，以吸光值为
纵坐标绘制标准瞌线，具体方法参见文献 [10]，单
位为 g干重。
1．8 数据分析
数据的差异性采用 one—way ANOVA法统计分
析(分析软件为 Origin 7．0)。所有数据均为 3个重
复的平均值 -4标准误差(s)。
2 实验结果
2．1 低温胁迫对葛仙米生长的影响
温度越低，对葛仙米生长的抑制作用就越大。
从图 1可以看出，15~C低温对葛仙米生长产生一定
抑制作用；在10℃下，葛仙米经过一个长达7 d的延
滞期，尚能恢复生长进入对数生长期；而在 2℃和
5℃的低温胁迫下，葛仙米无明显生长。
3 5
2．5
0 1 5
Tji{；
蛹
苫 0．5
O
图 1 低温胁迫对葛仙米叶绿素含量的影响
Fig．1 The efect of chiling stress oft the
growth of Nostoc sphaeroids
2．2 低温胁迫对葛仙米光合作用效能(叶绿素荧
光参数 ／ )的影响
在不同的培养温度下，2qC和 5qC的低温对葛仙
米藻体的光合效能参数 和 Fm的比值负面影响
比较大。lO~C低温培养的葛仙米，其光合效能(n
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312 武 汉 植 物 学 研 究 第 27卷
Fm)在维持一段时间的较低值后逐渐上升至正常
值。15~C处理的藻体的荧光比值变化趋势与20~C
的相似，总体来说变化幅度不大(见图 2)。以上结
果说明，葛仙米在 IO~C低温下经过适应调整可基本
恢复光合活性 ，更低的温度则会给葛仙米光合活性
造成不可逆伤害。
图 2 低温胁迫对葛仙米光合作用效能
(叶绿素荧光参数 Fv／Fm)的影响
Fig．2 The effect of chiling stress on the
photosynthetic activity( ／Fm、d IV,sphaeroids
2．3 低温胁迫对葛仙米细胞膜透性的影响
在从正常培养温度转入新鲜培养基的初期，所
有培养温度下，葛仙米藻体的电解质渗透率均有一
个上升的过程(2c【=下培养物的电解质渗透率先降
后升)，第3 d后均开始下降(见图3)。总体来说，
IO~C、15℃和20c【=下培养物的电解质渗透率比较接
近且变化趋势一致。2c【=和 5 c【=低温处理组细胞膜
透性在初期要低于 l0c【=、15 c【=和 20c【=培养组，并在
第 11～13 d达到最低 ，而后升高，而5 c【=培养组的电
解质渗透率远高于2c【=培养组。
耋
錾
高于 15~C和 20~C下培养物，且低温下温度越低，多
糖含量越高(见图4)。不同温度下培养物的还原性
糖含量变化均有一个升、降的波动过程，最终 15~C
和 20~C培养物的含量明显低于 2c【=、5 c【=和 IO~C培
养组(图5)(P<0．05)。
图 4 低温胁迫对葛仙米总糖的影响
Fig．4 The efect of chiling stress o1 total
sugarin N．sphaeroiclz
O 5 1O 15 2O
时间 Time(d)
图 5 低温胁迫对葛仙米还原性糖的影响
Fig．5 The efect of chilling stress on reducing
sugar in N．sphaeroids
2．5 低温胁迫对葛仙米藻体可溶性蛋白的影响
2c【=和5 c【=低温培养下的葛仙米，其可溶性蛋白
质的含量在培养初期明显低于 20~C培养组 (P<
0．05)。在培养初期，总体来说，20~C培养组的蛋白
质含量要高于 15 c【=培养组，而后者的要高于 10c【=培
养组。培养9 d后 15 c【=培养组的蛋白质含量则高于
其他培养组的。在培养末期 ，各温度下培养物的可
溶性蛋白含量趋于一致(图6)。
℃
c¨
0 C
5℃
0。C
0 5 10 15 2O
时 间 Time(d)
图 6 低温胁迫对葛仙米可溶性蛋白质含量的影响
Fig．6 Th e effect of chiling stress on soluble
protein in N．sphaeroids
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第 3期 苏彦平等：念珠藻葛仙米生理生化特性对不同低温胁迫的响应 313
3 讨论
在实验室培养条件下，较低的培养温度(2~C～
5~C)显著抑制葛仙米的生长，这显然与葛仙米的自
然生长状况不同。但是可以看出，葛仙米在 IO~C培
养条件下 ，仍能进入对数生长期保持正常生长 (图
1)，这与程超等提出葛仙米的最低适合培养条件为
IO~C相符 ，而这一温度对于多数高等植物而言，
却能导致冷害发生_2 J。这说明，葛仙米具有较强的
适应低温的能力，从而可在较低温度的野外 自然环
境下生长。即使是经过实验室室温培养驯化后的葛
仙米仍未丧失这种适应低温生长的能力。
葛仙米的这种生长表现，也可以通过叶绿素荧
光参数 Fv／Fm得以反映(图2)。Fv／Fm反映了植
物体内在的PSI光和效能 ¨。葛仙米在2~C和5~C
培养条件下，具有较低的 ／ 值 ，而在 15~C和
20~C培养条件下，Fv／Fm值则一直保持较高水平；
在 IO~C下，Fv／Fm值先降后逐渐上升，表现出葛仙
米对该培养温度的逐渐适应过程。低温对植物细胞
光合性能的伤害，主要表现在低温下 PSI1光损伤的
修复速率受到抑制上。例如在蓝藻 Synechocystis sp．
PCC 6803中，其 PSI的光损伤的速率在光强 0～
2000 IxE·m～·s。范围内，随光强上升而加剧，这
种损伤速率不受环境因子例如盐胁迫、H 0 引起的
氧化胁迫和低温胁迫的影响。但 PSI损伤的修复
速率则显著受上述环境因子的影响。研究发现这些
环境因子抑制蛋白质的重新合成_1 。在低温低光
强下，则可以减少光损伤的程度，从而保持细胞的光
合效能。
低温对葛仙米的伤害，也表现在对其细胞膜透
性的影响上。低温限制了微生物的酶活性和膜的完
整性 ’ 。当植物受低温胁迫时，细胞膜结构和功
能首先受到伤害，主要表现为半透性的破坏，电解质
和非电解质溶质外渗，并由此引起一系列代谢功能
失调 ” 。在本研究中，在转入新鲜培养基初期，
几乎所有培养温度下的葛仙米细胞膜透性均增大，
说明新环境(如新培养基、温度、光照、容器等)对葛
仙米细胞膜产生一定程度的胁迫，但较高温度下
(10℃ ～20~C)葛仙米均能在 7 d后适应并恢复到正
常水平。然而，低温下葛仙米的细胞膜透性 (电解
质渗透率)在 5 d后即能恢复到正常水平，然后保持
较低正常渗透率一段时间。这说明葛仙米细胞膜能
够更灵敏地响应低温胁迫，通过降低细胞膜渗透率
从而降低与外界的物质交换 ，最终达到保护细胞的
目的。然而在后期(约 13 d后)，细胞膜透l生再度升
高，并显著高于较高温度培养下的葛仙米。这表明
藻体遭遇低温胁迫时，细胞膜能积极响应通过调节
细胞膜透性在一定程度上降低低温对细胞膜结构和
功能的伤害，但随处理时间延长，膜结构受到破坏不
可逆，从而导致细胞膜防御系统的防御能力降低，细
胞膜透性升高。
葛仙米对低温的响应和适应 ，也表现在藻体总
体和还原性糖含量上升上(图4、图 5)。在经过一
段时间的低温锻炼后，越低温度下培养的葛仙米，总
糖含量越高，低温下还原性糖含量也上升。这些化
合物的合成，一方面促进了藻体的抗低温能力 ，
另一方面，这些物质的合成需要高耗能且需要从其
他保护和合成过程重新分配资源 ，因此，低温下
总糖和还原性糖的合成，却未能使藻体得以生长
(图 1)。低温胁迫下(2~C、5~C和 IO~C)，葛仙米藻
体的可溶性蛋白含量保持在较低水平。这主要是由
于低温影响了一些蛋白合成酶的表达，进而影响可
溶性蛋白质的含量。但是在低温下，可溶性蛋白质
含量低并不表示蛋白的重新合成(de novo)停止了，
例如 RNA结合蛋白基因 r6p的低温调控在蓝藻中
是比较普遍的 ¨ 。一些酶如 SOD酶也合成并提
高了活性，从而可快速清除低温产生的氧化胁
迫 。
综上所述，低温对念珠藻葛仙米的生长和光合
作用具有抑制作用，但葛仙米也表现出了具有一定
的抵抗低温胁迫的能力，并通过调节细胞膜的渗透
性、重新合成低温适应调节物质(如总糖和可溶性
糖等)来减少低温伤害，适应低温胁迫。
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