全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (5) : 444～ 448
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
猕猴桃品种 SSR 分析的初步研究
郑轶琦, 李作洲, 黄宏文Ξ
(中国科学院武汉植物研究所ö武汉植物园, 武汉　430074)
摘　要: 通过对 16 对高多态性的猕猴桃 SSR 引物筛选, 选用了 9 对稳定、适用性好的引物对我国栽培的 48 个猕
猴桃品种 (品系) 进行了初步研究, 在 9 个多态性位点上共获得 213 个等位基因片段, 其 SSR 指纹图谱可将供试品
种完全区分开。遗传多样性分析和分辨力检测表明, 我国猕猴桃栽培品种具有较高的遗传多样性, SSR 标记在猕猴
桃品种中有较高鉴定效率。中华ö美味品种群拥有高比例的共同等位基因, 反应出两者极近的亲缘关系。本研究为
进一步建立我国猕猴桃栽培品种的分子指纹鉴定体系奠定了基础, 为制定猕猴桃品种资源的有效保育和利用策略
提供了科学依据, 并对深入研究中华猕猴桃和美味猕猴桃间的系统关系提供了实验数据。
关键词: 猕猴桃品种; SSR; 遗传多样性; 品种鉴定
　　中图分类号: S663. 4; Q 75　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0520444205
Prel im inary Study on SSR Analys is in K iw ifru it Cultivars
ZH EN G Y i2Q i, L I Zuo2Zhou, HUAN G Hong2W enΞ
(W uhan B otan ica l Gard en öW uhan Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, W uhan　430074, Ch ina)
Abstract: Fo rty2eigh t k iw ifru it cu lt ivars and select ion s mo st ly developed in Ch ina w ere invest i2
gated u sing n ine pairs of SSR p rim ers selected from 16 h igh ly po lymo rph ic SSR loci. Tw o hun2
dred and th irteen alleles w ere detected from n ine po lymo rph ism loci, and all cu lt ivars w ere
un iquely discrim inated by SSR fingerp rin t ings. H igh genet ic d iversity w as ob served in these k i2
w ifru it cu lt ivars and SSR m arkers show s a good ab ility fo r k iw ifru it cu lt ivars iden t if ica t ion m ea2
su red by discrim inat ion pow er test. In th is study, a great num ber of common alleles w ere found
bo th A ctin id ia ch inensis and A . d eliciosa, suggest ing a clo se rela t ion sh ip of these tw o taxa. T h is
study p rovided a benchm ark reference fo r estab lishm en t of mo lecu lar iden t if ica t ion system and fo r
fu rther u ses in b reeding p rogram con servat ion stra tegy of k iw ifru it cu lt ivars, and also supp le2
m en ted u sefu l info rm at ion s fo r understanding the rela t ion sh ip betw een A . ch inensis and A . d eli2
ciosa.
Key words: K iw ifru it cu lt ivars; SSR; Genet ic d iversity; Cu lt ivar iden t if ica t ion
　　猕猴桃属 (A ctin id ia L indl. ) 隶属于猕猴桃科
(A ct in id iaceae) , 该属现有 66 个种、约 118 个种下
分类单位 (变种、变型) [1 ] , 其绝大多数物种仅分布于
中国。猕猴桃是 20 世纪果树栽培史上驯化栽培最成
功的果树之一, 其中中华猕猴桃和美味猕猴桃驯化
栽培最广泛。自 1904 年新西兰人从中国引种驯化栽
培猕猴桃以来, 已发展为世界各地广泛商业化栽培
的新兴水果。我国有着丰富的野生猕猴桃资源, 自Ξ 收稿日期: 2003204211, 修回日期: 2003206209。基金项目: 国家自然科学基金项目 (30070082) ; 中国科学院知识创新工程重要方向项目 (KSCX22SW 2104) ; 中国科学院武汉植物研究所所长基金项目 (35015102 和 35015101) ; 创新工程所长基金项目 (05035117)。作者简介: 郑轶琦 (1977- ) , 女, 硕士研究生, 从事分子生物学与植物保育遗传研究, 现为河南科技大学园林系教师。E2m ail: bo tanyzyq@yahoo. com. cn通讯作者 (A utho r fo r co rrespondence. E2m ail: hongw en@public. w h. hb. cn)。
20 世纪 70 年代以来, 我国已从野生猕猴桃资源中
选育出 55 个品种和 200 多个优良株系[2 ]。随着猕猴
桃产业的发展, 异地间品种交换频繁, 若不及时对猕
猴桃品种进行有效地登记管理, 会造成品种资源的
混乱, 如意大利在 70 年代猕猴桃产业发展之初, 因
没有可靠的品种鉴定技术, 从而导致品种的混杂[3 ]。
运用可靠的分子标记技术建立猕猴桃主栽品种和优
良株系的品种指纹体系, 并应用于种苗早期鉴定或
优质新特品种培育的辅助选择育种, 对我国猕猴桃
产业的有序发展及种质资源的有效保育有着重要意
义。
微卫星DNA (M icro satellite DNA ) , 即简单重
复序列 (SSR , simp le sequence repeats) 以其共显
性、良好的重现性和检测多态性丰富等优点, 已成为
构建品种指纹的重要标记, 并广泛应用于农作物和
果树的品种鉴定和种质资源分析[4 ]。虽然RA PD 和
同工酶标记已应用于猕猴桃品种的研究, 然而因各
自缺陷而在实际运用中受到了限制[3, 5 ]。猕猴桃微
卫星位点的大量分离对构建猕猴桃品种指纹体系提
供了基础[6 8 ]。笔者对已分离得到的高多态性猕猴
桃微卫星位点进行初步筛选, 选用适合我国猕猴桃
品种的高效 SSR 遗传标记, 并对我国的猕猴桃主要
栽培品种和部分优良株系进行研究, 拟建立我国的
猕猴桃品种DNA 指纹体系以指导我国的猕猴桃品
种鉴定。
1　材料与方法
研究选用的 48 个猕猴桃品种或株系均选自中
国科学院武汉植物研究所猕猴桃种质资源圃收集保
存的猕猴桃品种 (品系)。其中, 中华猕猴桃 (A . ch i2
nensis) 品种 26 个, 美味猕猴桃 (A . d eliciosa ) 品种
19 个, 软枣猕猴桃 (A . a rg u ta) 品种 1 个, 人工杂种
2 个。
2001 年 9 月, 采用改进的CTAB 法从 012 g 植
物幼叶提取植物总 DNA , 并用紫外分光光度计
(B ioPho tom eter 6131, Eppendo rf) 和 1% 琼脂糖凝
胶电泳检测模板DNA 的浓度和质量, 最后将模板
浓度调至 100 ngöΛL。按H uang 等[7 ]报道的微卫星
位点, 选取其中多态性较好的 16 对引物 (由上海博
亚生物技术公司合成)进行筛选实验, 选择稳定性好
的 9 对引物用于正式研究, PCR 扩增按H uang 等[7 ]
报道的反应条件和程序进行。
扩增产物采用 8% 的变性聚丙烯酰胺凝胶 (8%
acrylam ide öb isacrylam ide 19÷ 1, 7 mo löL u rea in
015×TBE, pH 813) 电泳分离和银染检测, 在扩增产
物 (25 ΛL )中加入等体积 L oading buffer (98% 甲酰
氨, 10 mmo löL ED TA , 0125% 溴酚蓝, 0125% 二甲
苯腈) , 在 95℃变性 3 m in。在 Sequ i2Gen GT System
(B IORAD ) 电泳仪上进行电泳, 下槽缓冲液为1×
TBE, 015×TBE 的上槽缓冲液预电泳 30 m in, 更
换 011×TBE 的上槽缓冲液上样电泳。电泳功率恒
定为 65W , 温度控制在 50℃, 电泳约 115 h。参照标
准银染程序染色, 室温下自然干燥后拍照或扫描, 参
照标准L adder (pBR 322 DNA öM sp I) 判读等位基
因片段大小。按位点引物号2等位基因大小 (如
UD K972414: 286ö276ö272ö256) 依次构建指纹标
记, 并采用多态信息指数 (P IC = 1- ≤ P ij 2, P ij 为 i
位点第 j 个等位基因的观察频率) 估测品种遗传多
样性和分辨力 (D iscrim inat ion pow er: D P = 1 -≤ P i2, P i 为某位点第 i 个基因型频率) 估测微卫星
位点的品种鉴定能力。
2　结果与讨论
通过 16 对 SSR 引物的筛选, 获得了 9 对扩增
带型清晰, 多态性好的引物 (表 1) , 对 48 个猕猴桃
品种进行扩增, 参照 H uang 等[7 ]确定的位点及方
法, 在所检测的 9 个多态位点上共获得 213 个等位
基因和部分哑等位基因, 品种特有等位基因数为
34。平均每位点 2317 个等位基因, 等位基因数最多
的位点为UD K962026 (38 个) , 最少为UD K972409
(9 个)。9 个 SSR 位点标记的指纹成功地区分了供
试的 48 个品种, 每个品种都获得了其特有的 SSR
指纹带型 (表 1)。其中UD K962026、UD K972414 的
遗传多态性信息指数最高 (0. 96) , 但后者的鉴别力
(D P = 0. 978)高于前者 (01976)。考虑哑等位基因,
UD K972414 能够将所有供试的猕猴桃品种区分开。
表明 SSR 标记是进行猕猴桃品种鉴定的有效工具,
与其他标记相比, SSR 标记在鉴定猕猴桃品种的研
究中显示出更高的效率[3, 6 ]。
从目前的研究结果来看, 我国猕猴桃栽培品种
具有丰富的遗传多样性, 中华品种群和美味品种群
的遗传多态性信息指数分别达 0189 和 0191, 美味
略高于中华, 但未有显著性差异; 中华品种群和美味
品种群各自特有等位基因数为 36 和 42, 共有等位
基因数达 133, 与两分类群有着极近的亲缘关系相
吻合[9 12 ]。本研究表明美味猕猴桃可能仅起源于中
华猕猴桃, 若进一步对两者野生居群的 SSR 标记检
测, 可能为进一步明确在美味猕猴桃起源问题上的
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同源多倍化与异源多倍化之争[13 15 ]提供科学依据,
两者的关系有待于进一步研究。
从比较位点平均等位基因数、遗传多态性信息
指数及观察杂合度看, 猕猴桃为高遗传多样性果树
之一, 遗传多样性水平显然高于其它果树[5 ]。猕猴桃
品种的 SSR 等位基因标记高度多态性与其倍性多
倍化及其形态性状、营养成分、DNA 水平其它标记
的丰富遗传多样性相吻合[1 ]。猕猴桃属的广泛自然
种间、种内杂交, 必然使其后代具有丰富的变异类
型, 从野生猕猴桃资源中选出的猕猴桃品种也就具
有相应高遗传多样性。
本研究还表明共显性的 SSR 标记可以作为快
速鉴定植物倍性的辅助方法之一。研究中 22 个中华
猕猴桃品种发现有一至多个位点的等位基因数的最
大值为 4, 符合四倍体的 4 个等位基因完全杂合的
基本特征, 与W eising 等[6 ]的研究表明 SSR 位点等
位基因数的最大值与实验材料的倍性有关的结论吻
合。另外 4 个中华猕猴桃品种 (12111、红阳、桂海 4
号、川猕 3 号) 每个位点的等位基因数均不超过 2
个, 则表明有可能为二倍体, 但进一步确证需要参考
细胞学数据。江山娇和满天星均为四倍体中华猕猴
桃与二倍体毛花猕猴桃的杂交后代, 理论上和细胞
生物学证据[16 ]均表明它们应为三倍体, 在本研究中
它们每个位点的等位基因数不多于 3 个, 与它们三
倍体倍性相符合。
本研究初步表明 SSR 标记在分析猕猴桃品种
的遗传多样性和构建品质指纹图谱与品种鉴定方面
有着极高的效率, 迅速构建我国猕猴桃品种的 SSR
遗传指纹图谱, 将为今后推广优良品种、调整猕猴桃
产业的品种种植结构、制定品种资源的保育策略以
及新品种的登记注册和产权保护奠定基础和提供科
学依据。在本研究中, 有多个位点出现哑等位基因,
在今后的分析中, 有必要进一步完善扩增条件或对
引物设计进行适当的调整, 以便检测更完整的 SSR
等位基因遗传多样性或提高鉴别能力。
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