全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(1)：84～88
Journal D，Wuhan Botanical Research
葡萄果实生长发育过程中白藜芦醇及其糖苷的 HPLC测定
余 兴 -一，高丽萍h，夏涛。，胡颍蕙。，檀花蓉
(1．安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036；2．安徽省地质实验研究所，合肥 230001；
3．安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室，合肥 230036)
摘 要：利用高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱方法，结合 c。固相萃取技术，检测了葡萄果实生长发育过程中顺反
式白藜芦醇及其糖苷的动态变化。结果显示，适于酿造红葡萄酒的蛇龙珠和酿造白葡萄酒的白羽品种的白藜芦醇
及其糖苷含量的变化规律大不相同。葡萄果实生长发育期间，蛇龙珠果实内的白藜芦醇及其糖苷含量较高 ，而白
羽果实中自藜芦醇含量很低，其糖苷含量则持续下降。
关键词 ：葡萄果实；白藜芦醇及其糖苷；高效液相色谱
中图分类号：$663．1；Q945．3 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)O1-oo84-o5
HPLC Analysis of Resveratrol and Piceid during the
Development of Grape Berries
YU Xing ，GAO Li-Pingh ，Ⅺ A T ，HU Ying-Hui ， rAN Hua-Rong
(1．Colege ofLife Science，Anhui Agricultural University，Hefei 230036。China；2．Inst／tute ofAnhu／Geolog／cal
Research，Hefei 230001，China；3．Key Lab．ofTea Biochemistry and Biotechnology，Ministry of
Agriculture。Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
Abstract：Resveratrol(Res)and piceid(PD)in grape beries were determined by using high performance
liquid chromatography(HPLC)，combining with the Cl8 solid extraction．1he result showed that the contents
of Res in Carbemet Gemischet an d Rkatsiteli existed obvious diference during the development of grapes
beries．1he contents of Res and PD were high in Carbe met Gemischet grapes beries．while the content
of Res was low an d the content PD kept decreasing during the development of Rkatsiteli grapes berries．
Key words：Grape berries；Resveratrol and piceid；HPLC
白藜芦醇 (Resveratrol，简写 Res)是植物体内
一 种天然的二苯乙烯类多酚物质，在自然界中多以
游离态醇及其糖苷(PD)形式存在，一般有 4种异构
形式，即顺(cis-)、反(trans．)式白藜芦醇及其糖苷。
白藜芦醇具有抗氧化、抗菌和抗衰老、清除自由基等
作用，特别是 1997年 Science首次报道了Res的抑
癌功效u ，使之迅速成为国内外科技人员的研究
热点。葡萄酒是人类摄人白藜芦醇的主要途径。
目前，白藜芦醇的定量测定方法有高效液相色
谱法(HPLC) ．4 J、气质联用(GC-MS) 】、毛细管
电泳法(CE) 等。其中，高效液相色谱法灵敏度
高，是目前应用较为广泛的白藜芦醇定量测定技术。
对于葡萄及葡萄酒来说，由于酚性杂质较多，加之顺
式白藜芦醇及其糖苷的不稳定性，同时检测 4种 白
藜芦醇异构体有一定难度，有研究已对此进行了有
益的探索 。。。另外，人们对葡萄生长果实发育期
间白藜芦醇及其衍生物的变化规律研究较少，结果
也不尽相同，既有研究表明 Res含量从果实绿果期
到成熟期稳定下降⋯J，也有在成熟期最高 的结
果 引¨，且较少涉及到其他衍 生物。本 实验利用
HPLC方法，结合 c，。固相萃取技术，对葡萄果实生
长发育期间4种白藜芦醇异构体的变化进行研究，
旨在探明不同品种葡萄果实生长发育期间白藜芦醇
及其糖苷的积累规律。
1 材料和方法
1．1 试验材料
以安徽省萧县园艺场酿酒红葡萄品种蛇龙珠
(Vitis vinifera L．CV．Carbernet Gernischet)和酿酒 白
葡萄品种白羽( vinifera L．CV．Rkatsiteli)果实为
试材，自果实挂果后，每隔 10 d采集直至果实成熟，
样品采后于 一8O℃的冰箱中保存备用。
收稿日期：2006-02-28，修回日期：2006-12-11。
基金项目：安徽省教育厅重点项目(2005KJ392ZD)；安徽省优秀青年基金(O2O41O05)资助。
作者简介：余兴(1979一)，女，硕士，从事果树生理方面的研究。
· 通讯作者(Author for~onespondance．E-mail：gaolp62@126．com)
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第 1期 余 兴等：葡萄果实生长发育过程中自藜芦醇及其糖苷的 HPLC测定 85
1．2 实验方法
1．2．1 Res和 PD的提取
取冻样 8 g于研钵中，加入 60％ 甲醇提取液
3 mL。研磨成匀浆，置于 4~C下浸提 6 h后，于 4~C、
5000 g离心 10 rain。取上清液，过活化后的 Cl8小柱
固相萃取，5～10 rain内流干，用 10 mL的乙酸乙脂
淋洗 c。小柱。收集淋洗液于具塞试管中，用 N：吹
干淋洗液。干燥物用 1 mL的50％乙腈溶解，HPLC
待测。所有操作均在避光条件下进行，以免白藜芦
醇发生异构化。
1．2．2 Cl8固相萃取小柱 (Solid-Phase extraction，
SPE)的活化及再生
分别用 5 mL乙酸乙脂和5 mL乙醇预处理 c。
小柱2次，5 mL的重蒸水清洗，最后 5 mL 5％乙醇
水溶液清洗 2次。将小柱用 6o％的乙醇冲洗5次，
每次约为3 mL，再将小柱浸泡在浓度为95％的乙醇
中，放在4~C的冰箱中保存。
1．2．3 高效液相色谱(I-IPLC)测定条件
色谱仪为Waters 600；色谱柱为Waters Symme时
cl8柱(3．9 X 150 lnln，5 )；检测器为 uV Waters
2487；灵敏度为0．01；检测波长为 307 Bil、285 Bil；
流速为 1．0 mL／min；进样量为5 ；试样进样之前，
以流动相平衡 15 rain。
等度洗脱条件 流动相浓度[乙腈／水( )：
30／70、35／65、40／60]。
梯度洗脱条件 流动相是 A相(超纯水)、B相
1_，J、仟 Lanuaru am Plc
l 2
30％乙膪 30％Aeetonitrile
品 8
一
35*／*乙膪 35％Aeetonitrile
1 2
I
2 4 6 8 l0 l2 l4 l6 l8 20
2 l
40％乙膪 40*／*Aeetonitrile
(乙腈)；梯度洗脱条件为：O～10 rain内 B相从 5％
线 形 增 至 25％，lO～2o min线 形 增 至40％，20～
35 min线形增至 100％，35～36 rain降到5％。
1．2．4 Res和 PD标准曲线的制定
trans．Res和 PD 标准 曲线的制 定 分别 以
1 mg／mL的laflJ1S—Res和 PD标准品为准备液，用乙
腈分别稀释为 1、5、10、15、20~g／mL的混合标
样，在梯度洗脱条件下重复多次进样，利用回归方程
计算标准曲线。
ds-Res和 PD标准曲线的制定 配置 1~g／mL
trans—Res和PD的混合标样，在紫外灯下分别照射
0、10、20、30、50、70、90 rain，HPLC梯度洗脱条件
下测定峰面积，分别以单位时间内减少的 laans—Res
和 PD的峰面积(307 rim)对应的浓度为横坐标，单
位时间内增加的 cis—Res和 PD的峰面积(285 Bil1)
为纵坐标，建立标准曲线。
2 结果和分析
2．1 I-IPLC色谱测定条件的选择
2．1．1 等度洗脱条件
分别以 30％、35％、40％乙腈为流动相进行等
度洗脱(图1)，结果表明，随着乙腈在流动相中所 占
体积比增大，laans—Res和 PD的保留时间逐渐减少，
lamas—Res的保留时间可从4．8 rain缩短为 2．3 rain。
等度洗脱方法可以快速地检测样品中的 Res含量，
但 PD的检测受到干扰。
30％乙膪 30％Aeetonitrile
‘u
2 4 6 8 l0 l2 l4 16 l8 20
35％乙膪 35％Aeetonitrile
2 4 6 8 l0 l2 l4 16 18 20 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Time(min) Time(rain)
1．trarm—PD：2．11"1118一Res
图 1 等度洗脱条件下 Res和PD的 RPLC图谱(左：标样 ；右：样品)
Fig．1 HPLC ehromatograms of Res and PD under isocrafie elution condition(Left：standards，Pd【ght：sample)
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
2．1．2 梯度洗脱条件
梯度洗脱可以使得标准品和葡萄样品中4种白
藜芦醇异构体在20 min内得到较好的分离，葡萄样
品中的cis．Res由于含量低而未检测出(图2)。在
样品里加人 0．1~g／mL trans—Res和 PD标准品，同
样品一起进行前处理，以不加标准品的样品为本底，
最终回收率(R)=(测定量 一本底量)／加入的标准
品含 量，结果 显 示 平 均 回收 率 为 95．o6％ 和
104．74％。trails—Res和 PD 最低 检 出量 分别 为
0．03~g／mL和0．02 I．~／mL，精密度 RSD分别为
9．47％(n=11)和7．54％(n=11)。
2．2 Res和 PD标准曲线的制作方法建立
梯度洗脱条件下，在1～20 I~g／mL浓度范围内，
trans—Res的回归方程为 Y=47223x一11324，r=
0．998“(P≤0．01，下同)，trans—PD的回归方程为
，=27935x一4638．2，r=0．998”，峰面积和 trsxIS—
Res和 PD含量均存在良好的线性关系，适宜测定葡
萄中trans—Res和 PD含量。
由于白藜芦醇的顺式异构体活性太强、易被氧
化，不能以单体的形式存在，所以对 cis—Res和 PD
其糖苷的研究大多停留在定性方面，较少进行定量
测定。本实验利用 Trela B．C．方法 驯对顺式异构
体进行了定量分析。紫外照射后的结果表明，tr／tns—
Res和PD在紫外照射 10 min内迅速下降，70 min
时分别减少了56．81％、52．58％，之后均小幅上扬。
cis—Res和 PD的变化正好相反(图3)。相关分析表
明，紫外照射后的顺反式白藜芦醇及其糖苷的变
化均 呈 极 显 著 负 相 关，相 关 系 数 r分 别 为
一 0．914” 、一0．954” 。
分别以单位时间内减少的tl8~S—Res和PD的峰
面积对应的浓度为横坐标，以单位时间内增加的 cis．
Res和PD的峰面积为纵坐标，建立 cis—Res和 PD的
标准曲线，线性回归方程分别为 Y=37071x一1829．6
(r=o．9907“)和Y=63481x一87518(r=0．9646“)。
15 20 25 30 35
五me(mil1)
图2 梯度洗脱条件下 R．s和 PD的 ItPLC图谱
Fig．2 HPLC ~hromatognnns of Res and PD under gradient elution condition
0 10 20 30 50 70 90
Time(min)
160o0
120o0
8000
4000
0
0 10 20 30 50 70 90
nme(min)
图 3 紫外照射下顺反式白藜芦醇及其糖苷的变化
Fig．3 The changes of Res and PD after UV irradiation
0 0 0 0 0 0 ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 0 如 卯
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第1期 余 兴等：葡萄果实生长发育过程中自藜芦醇及其糖苷的HPLC测定 87
2．3 葡萄生长发育期间 Res和PD的变化规律
图4显示了蛇龙珠和白羽果实生长发育阶段
Res和 PD的变化规律。发现蛇龙珠果实的 Res和
PD含量在生长发育阶段呈波动状变化，坐果 35 d
后蛇龙珠正进入了糖分快速积累阶段(资料略)，同
时伴随着果实转色，此时，trans—PD和 cis—PD含量达
到最高值，分别为2．774 ／g、0．2028 g／g，比坐果
15 d时增加了62．59％、15．28％，之后迅速下降；而
trarm—Res含量高峰分别 出现在坐果 35、55 d，为
9．28 g／g和l0．02 g／g，比坐 果 15 d增 加 了
21．54％和31．20％。果 实生长发育期 间未检 出
15 25 35 45 55 65
Days afterfruiting (d)
Days afterfruiting (d)
A．蛇龙珠 ；B．白羽
A．CarP et C~misehet；B．Rkatsitdi
图 4 葡萄果实生长发育过程中Res、PD含量的变化
Fig．4 Changes of Res and PD contents during the
development of grape berries
与蛇龙珠品种不同，白羽果实中 t~ans—PD的含
量随果实的生长发育而大幅度下降，从坐果 15 d的
1．9281 g下降到65 d的 0．1796 g，下降了
90．69％；trans—Res的含量则非常低，坐果 15 d仅为
0．441 g／g，且在果实的生长发育期增加缓慢。最
高点出现在55 d时，只增加了13．38％。另外，在白
羽果实中未检出 eis—PD和 eis—lies。
3 讨论
根据流动相条件的不同，HPLC法可分为等度
洗脱和梯度洗脱。但等度洗脱条件不能同时分析
trans—Res和 PD。等度洗脱方法适合对葡萄酒质量
进行快速鉴定，国内外有多篇文献采用该方法对红
酒和葡萄 样 品 中 trans—Res和 PD 进行 定 量 分
析 。， 引。
葡萄酒中的Res和PD衍生物可以利用梯度洗
脱方法得到有效地分离 引，Pezet R．[1 甚至利用
HPLC—MS一次性分析鉴定了葡萄叶中顺反 白藜芦
醇及其糖苷、白藜芦醇二聚体等l0种衍生物。可见
HPLC法是 目前应用最广泛的分离分析手段，它具
有应用范围广、定量准确、重复性好、操作简单等优
点，可以快速方便地定性分析样品中的 Res和 PD
衍生物的含量。
白藜芦醇4种异构体的定量难点在于糖苷和顺
式白藜芦醇衍生物含量的测定。早期糖苷测定采用
了 B一葡萄糖苷酶水 解的方法，增 加 了检测 的难
度H J。顺式白藜芦醇及其糖苷由于对光敏感，极不
稳定，目前还没有标样出售，只能应用反式异构体紫
外照射下向顺式异构体转化的性质来获得。Trela
B．C．【】 利用这种方法，对顺式白藜芦醇及其糖苷
进行定量分析。他用 366 nm紫外照射 trans—Res，发
现 120 rain后其转化率为 85．9％；戴蕴青【9 利用
254 nm紫外照射 10 min后就发现 trans—Res和 PD
峰面积可减少 84％；李景明 利用254 nm紫外照
射，发现60 rain时 trans—Res和 PD峰面积减少量不
足 15％；本实验发现 254 nm紫外照射 70 min时。
trans—Res和 PD减少 50％左右，但延长紫外照射时
间并不能增加转化率，这种现象说明反顺式异构体
之间可能存在相互转化。不同研究者实验结果的差
异可能与紫外照射时辐射条件不同有关。
作为葡萄属植物体内一种植物抗毒素，白藜芦
醇的生物合成不仅受真菌侵染、紫外线照射以及重
金属离子等胁迫因素的影响，也与品种的基因型差
异有关。有资料表明，在田间自然条件下，不同品种
的葡萄其合成白藜芦醇的能力差异较大 ¨ 】。本
实验发现酿造白葡萄酒的白羽品种其白藜芦醇含量
不仅低于适于酿造红葡萄酒的蛇龙珠，而且两品种
白藜芦醇及其糖苷含量在果实生长发育阶段的变化
规律也大不相同。
参考文献：
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[J]．胁 JEndocriaol，1998，138：619—620．
∞^ n]lu g：
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(上接第74页)
4 插图要求
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英文小写正体 r”中的“s”、“r”应分别为小写斜体“sj”、“r”，特此更正。
《武汉植物学研究》编辑部
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