全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(5)：392—396
Journal of Wuhan Botanical Research
利用 RAPD和 ISSR标记分析烤烟品种间遗传关系
肖炳光
(中国烟草育种研究(南方)中心，云南省烟草科学研究所，云南玉溪 653100)
摘 要：利用 RAPD和 ISSR标记对 22份烤烟(Nicotiana tabacum L．)品种进行了遗传关系研究。在 RAPD分析中
筛选到13个引物，共扩增出167条带，其中多态性带50条，多态性比率为29．9％；在ISSR分析中筛选出7个引物，
共扩增出96条带，其中多态性带44条，多态性比率为45．8％。两种标记相结合估算出的品种间遗传相似系数在
0．881—0．979之间，平均为 0．933。单独基于 RAPD标记和 ISSR标记的聚类结果有一定差异；两种标记结合起来
的聚类分析结果与系谱信息吻合程度更高。定向选择可能对烤烟品种问遗传关系有较大影响；国外引进品种与国
内育成品种并未完全分开，表明分子水平的遗传关系和地理来源问缺乏必然联系。
关键词 ：烤烟(Nicotiana tabacum L．)；RAPD；ISSR；聚类分析 ；遗传关系
中图分类号 ：Q346 ．5；$572 文献标识码：A 文章编号 ：1000．470x(2006)05．0392．05
Assessment of Genetic Relationships between the Flue-cured Tobacco
Varieties by RAPD and ISSR M arkers
XIAO Bing—Guang
(China Tobacco BreedingResearch(Southern)Center，Yunnan Institute ofTobacco Science，Yuxi，Yunnan 653100，China)
Abstract：The genetic relationships between 22 flue．cured tobacco varieties were assessed by RAPD and
ISSR markers．For RAPD analysis．13 random primers were identified with polymorphism among the en．
tries．In total 167 bands were produced，of which 50 bands were polymorphie．Percentage of polymorphie
bands was 29．9％ ．For ISSR analysis．7 primers were identified with polymorphism among the entries．In
total 96 bands were produced，of which 44 bands were polymorphie．Percentage of polymorphie bands was
45．8％ ．Pairwise similarity coemcients combining both RAPD and ISSR markers ranged between 0．88 1
and 0．979。with an average of 0．933．Clustering of genotypes had some diferenees when RAPD．and IS—
SR—derived dendrograms were compared．The dendrogram comb ining both two markers was more eompa—
rable to the information on pedigree．111e selection pressure had great efects on the genetic relationships
between varieties．The fact that the introduced varieties from abroad were not separated from the developed
varieties in China implied that the genetic relationships based on the molecular marker data did not cor．
respond well with the geographic sources．
Key words：Flue—cured tobacco(Nicotiana tabacum L．)；RAPD；ISSR；Cluster analvsis；Genetic rela．
tionship
烟草(Nicotiana tabacum L．)是我国重要的经济
作物之一。我国栽培的烟草一般分为烤烟、晒烟、晾
烟、白肋烟、香料烟、黄花烟6种类型，其中烤烟是我
国、也是世界上栽培面积最大的烟草类型 J。自20
世纪初开展烤烟育种以来，由于国内外一般都集中
使用少数骨干亲本，加之定向选择 ，根据表型难以对
烤烟品种间的遗传关系做出准确评价。
分子标记直接在 DNA水平上阐明遗传差异，与
基因表达无关，从而为遗传差异评价提供了有效手
段。RAPD(random amplifed polymorphie DNA)技术
是由Wilams等 创立的一种建立在 PCR基础之上
的分子标记技术，它使用一系列具有 1O个左右碱基
的单链随机引物，对基因组 DNA进行 PCR扩增，以
检测多态性；由 Zierkiewicz等 发展起来的 ISSR
(inter—simple sequence repeats)技术则是根据基因组
内广泛存在的微卫星序列设计单一引物，对两侧具
有反向排列 SSR的一段 DNA序列进行扩增。这两
种标记均不需事先了解基因组序列信息，具有操作
简便、快速、仅需微量 DNA等特点，因而在许多作物
亲缘关系分析、遗传多样性研究、遗传图谱构建和性
收稿日期：2006—02—14，修回日期：2006—08．07。
基金项 目：中国烟草总公司云南省公司科技计划项目(02A01，05．03)。
作者简介：肖炳光(1971一)，男，助理研究员，博士，从事烟草遗传育种研究(E-mail：xiaobg@263．net)。
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第 5期 肖炳光 ：利用 RAPD和 ISSR标记分析烤烟品种问遗传关系 393
状基因定位等方面得到了广泛应用 。
近年来，关于烟草品种的 RAPD -9 3、ISSR 10,1
和 SRAP¨ 分析已有报道，但对我国现有推广品种
和骨干亲本的遗传关系研究较少。本研究的主要 目
的是利用 RAPD和 ISSR技术对我国烤烟主要推广
品种和优质抗病亲本进行遗传关系分析，为合理选
配亲本提供依据。
1 材料与方法
1．1 材料
供试烤烟(Nicotiana tabacum L．)品种22个(见
表 1)，由中国烟草育种研究(南方)中心提供。其中
包括 当前 主 栽 品种 如 “K326”、“云 烟 85”和
“NC89”，优质亲本如“红花大金元”、“G-28”和“株
41”，抗性材料如“Coker176”(抗 TMV)、“净叶黄”
(抗赤星病)和“Ti245”(抗 TMV和 CMV)等。
表 1 供试烤烟品种及其系谱
Tabl 1 The flUC—cured tobacco varieties and
! ! !旦! ! 竺 ! !! 璺
编号 品种 系谱 来源
No． Variety Pedigree Source
1．2 DNA提取
每份材料播种在铺有湿润滤纸的培养皿中，取
萌发20 d左右的芽 0．2 g，利用 DNeasy Plant Mini
Kit(QIAGEN)提取基因组 DNA，调节 DNA浓度为
20 ng／p,L。
1．3 RAPD分析
PCR反应体积为25 L／管，反应体系中含 1×
Buffer(10 mmol／L Tris—HCI、pH 8．3，50 mmol／L
KCI，0．1％ Triton X一100)，2．5 mmol／L MgCI2，4种
dNTP各 0．2 mmol／L，1U Taq酶(以上 PCR试剂均
购自Promega)，0．5~mol／L引物(由大连宝生物有
限公司合成)，2O ng模板 DNA。PCR扩增在 Gene—
Amp PCR System 9600(Perkin Elmer)上进行，先在
94℃下预变性4 min；再进行45个循环的变性(94℃
3O s)、退火(36℃ 30 S)、延伸(72℃ 66 S)步骤；最
后在 72℃下继续延伸 5 min。
扩增产物J~nl／6体积的上样缓冲液(40％蔗糖，
0．025％溴酚蓝)，取1O 在1．4％的琼脂糖凝胶中
电泳(5 V／cm)，0．5~g／mL溴化乙锭中染色30 min
左右，在VDS(Pharmacia)上观测结果并照相。
1．4 ISSR分析
PCR反应体系中 MgCI2浓度为 1．5 mmol／L，
4种 dNTP浓 度 各 为 0．1 mmol／L，引 物 浓 度 为
0．4~mol／L，退火温度为 45℃，其它与 RAPD分析
相同。
1．5 数据处理
扩增产物仅定性地以同样长度的片段在各品种
中出现(计为 1)或缺失(计为0)进行统计，建立 1，0
型数据。每两个 品种 间 的遗传相 似系数用 Nei
等 ¨的公式计算：GS f=2N ／(ⅣI+ )，式中 J7v 指
两品种共有的带数 ， + 指两品种所有带数之
和。利用 NTSYSpc Version 2．0软件 ¨按照 UPG—
MA法进行聚类分析，构建聚类图。
2 结果与分析
2．1 烤烟分子标记的多态性
RAPD分析中，首先用 6个品种 (“NC2326”、
“G-28”、“净叶黄”、“K326”、“Coker176”和“红花大
金元”)对 200个 1O碱基随机引物(operon technolo—
gies)进行筛选 ，13个引物能扩增出清晰、重复性好、
品种间有差异的带型，其它引物没有检测到扩增产
物、或扩增产物在品种间没有多态性、或扩增结果不
稳定。由这 13个引物在 22个品种中共扩增出 167
条带(图 1为引物 OPAl 1的扩增结果)，其中多态性
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武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
图 1 RAPD 引物 OPAl1的扩增结果
Fig I Profde,．=plifed hy tL~．PD primer OPAl 1
[M：250 bp DNA hulder{Gibco BRL)：
带50条f表2)，多态r主比率为29．9％．每个引物可
扩增出1～7条多态性带，平均产生 3 8条。
在 ISSR分析中，用上述6个品种对90个 ISSR
引物(University of British Columbia)进行筛选时，7
个引物扩增出清晰、重复性好、品种间有差异的带
表 2 产生多态性带的RAPD和ISSR引物
Table 2 The RAPD and ISSR primers which
produced po[ymorphic bast&
型。由这 7个引物在 22个品种中共扩增出96条带
(图2为引物 UBC873的扩增结果)．其中多态性带
44条(表2)，多态性比率为45．8％．每个引物可扩
增出3—13条多态性带，平均产生 6．3条
2．2 聚类分析
根据 RAPD和 ISSR分析建立的 I，0型数据，计
图 2 ISSR引物 UBC873的扩增结 果
Fig．2 Pmfi~ amptifed 1SSR printer UBC873
fM：100 bp DNA lad~r(Gibco BRL)]
算出成 对品种 问遗传 相似系数分别在 0．909—
0．988和0．809—0．985之间 由这两刊 标记得到
的遗传相似系数问呈扳显著相关 ．但相关系数较小，
仅为0．232。于是合并这两种标记的分析结果，计
算出成对品种间遗传相似系数在 0．88l(“CV87 和
“中烟90”)与 0．979(“CI5l”和”T；．245”)之间，平
均为0．933，表明烤烟品种间遗传相似程度较高．但
不同品种问的遗传相似系数仍有一定变化幅度，可
按需要选择遗传差异不同的品种作为杂交亲本。
以品种问遗传相似系数为基础，按 UPGMA法
进行聚类分析并作聚类图。利用 RAt’D标记进行聚
类分析时(图3：_^)．在相似系数0．95处可将参试品
种初步分为4类 “NC89”和“NC2326”具有共同亲
本 Hicks．“Ti245”是“C15 的亲本．它们被聚在类
群 l：“G-80”及其亲本“G-28”、“云烟 85”及其亲率
“K326 被聚在类群Ⅲ；但电出现与系谱信息不符的
情况 ．如“云烟2号”及其亲本“红花大金元”分别放
聚在类群 I和Ⅲ，“中烟 9O”及其亲本“净Itr黄 分
别被聚在类群Ⅲ和lv。利用 ISSR标记进行聚类分
析时(图3：B)．在相似系数0．90处可将参泼品种初
步分为4类，其中类群 I又可在相似系数0，935处
分为3个亚类。与 RAPD分析类 似．“NC2326”和
“NC89”、“C151”及其亲本 “Ti245 均被聚在亚类
I a；而“云烟2号”及其亲本“红花大金元”则分别
被聚在类群Ⅲ和 I a，“中烟90”及其亲本“净叶黄”
分别被聚在类群 I a和Ⅳ 比较 RAPD和 ISSR标
记的聚类分析结果(图3：A，B)，尽管有相似之处．
但也存在一定差异．如“CF965”和“云烟 85”在基于
RAPD标记的聚类图中分别被聚在类群 I和Ⅲ．而
在基 于 ISSR标记的聚类图 中则被 同聚 在类 群 Ⅱ
将 RAPD和 ISSR标记结合起束进行聚类分析
(图3：C)．在相似系数0．93处可将参试品种初步分
为4类，其中类群 I又可在相似系数 0．945处分为
3个亚类。亚类 I a包括 9个品种(“NC2326”、“大
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RAPD(A)
II
III
RAPD+ISSR(C)
l9
l3
20
0．92 0．94 0 96 0．98 1．00 0．84 0 88 0．92 0．96 1．00 0．90 0．92 0 94 0．96 0 98 1．00
相似 系数 相似 系数 相似系数
Similarity coefficient Similarity coefficient Simi1arity coefficient
图 3 基于 RAPD(A)、ISSR(B)及两种标记相结合(C)的烤烟品种聚类图
Fig．3 Dendrograms generated by UPGMA method using RAPD(A)，ISSR(B)，and combing
both RAPD and ISSR data(C)for the flue—cured tobacco varieties
白筋 599”、“NC89”、“C151”、“Ti245”、“Coker176”、
“K358”、“NC82”和“云烟 317”)，其中“Ti245”是
“C151”的亲本之一，“NC2326”和“NC89”的亲本中
均有 Hicks，“Coker176”和“NC82”的亲本 中均有
“Coker319”。亚类 I b由7个品种组成(“红花大金
元”，“77089—12”，“株4l”，“SC71”，“中烟 9O”，“云
烟85”和“G一80”)，其中“中烟 9O”和“G．80”具有共
同亲本“G．28”，“株 41”和“云烟 85”具有共同亲本
“K326”。“云烟 2号”和“CF965”分别独 自聚为亚
类 I C和类群 Ⅱ。类群 Ⅲ有 2个品种(“G．28”和
“K326”)，两者具有共同亲本“NC95”。类群Ⅳ有 2
个品种(“净叶黄”和“CV87”)，其中“CV87”的亲本
中有“CV58”，而“净叶黄”是“CV58”的亲本之一。
可见，RAPD和 ISSR标记结合起来的聚类分析
结果与系谱信息吻合程度更高。但无论是单独利用
RAPD或 ISSR标记、还是结合两种标记进行分析，
都可发现一些聚类结果与系谱信息不符的情况，如
“株41”和“云烟317”的亲本组合完全相同，“净叶
黄”是“中烟9O”的亲本，但均聚在不同类群，表明定
向选择压力可能对烤烟品种间遗传关系有较大影
响。从3个聚类图中还可看出，国外引进品种与国
内育成品种并未完全聚在各自类群。
3 讨 论
III
Ⅳ
3．1 烤烟 RAPD和 ISSR标记多态性
许明辉等 关于烤烟和晒晾烟、何川生等 关
于烤烟的报道中，平均每条有效 RAPD引物(品种
间可检测到多态性带的引物)分别能扩增出2．9条
和4．2条多态性带，多态性 比率分别为 35．9％和
51．6％。而杨本超等 ¨关于烤烟品种的 ISSR分析
中，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，平均每
条有效引物检测到的多态性带达 14．1条，多态性比
率为67．8％；祁建民等 u以4个烟草种 3O份种质
为材料，从7O个 ISSR引物中筛选出 16个多态性引
物，共扩增 出 309条谱带，平均每条引物扩增 出
19．3条带，多态性 比率达 93．2％，可能与所用材料
遗传差异较大有关。本研究进行 RAPD分析时，平
均每条有效引物扩增出3．8条多态性带，多态性比
率为29．9％；进行 ISSR分析时，平均每条有效引物
检测到 6．3条多态性带，多态性 比率为 45．8％，高
于 RAPD分析结果。可见，虽然 RAPD和 ISSR标记
在烤烟品种间均可揭示出较丰富的多态性 ，但由于
ISSR分析 中引物更长、退火温度更高 ¨，从而较
RAPD分析具有更高的严谨性、分析结果更稳定，加
a b c Ⅱ Ⅱ V
● 8 ¨ H 6 m 加 7 9 2 B 3 4 ¨
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之 ISSR标记的多态性 比率更高⋯ ，因此更适合构
建烤烟品种指纹图谱，进行品种鉴定。
3．2 烤烟品种问遗传关系
品种间遗传关系研究和遗传多样性评价对于作
物育种具有十分重要的意义 ¨。许明辉等 利用
烟草品种 RAPD数据计算出23个品种间遗传距离
在 0．089～0．425(相似系数0．575～0．911)之间，王
志德等 的研 究 中任两 个样 品 间遗传距 离在
0．242—0．822(相似系数 0．178～0．758)之间；祁建
民等[】 利用 ISSR标记计算出的烟草种间遗传相似
系数在 0．29～0．52之间，而栽培种内遗传相似系数
在 0．54～0．96之间。本研究结合 RAPD和 ISSR标
记计算出的烤烟品种间遗传相似系数在 0．881～
0．979之间，高于上述报道 。 ’“ ，其主要原因可能
是研究材料不同所致。如许明辉等 。 所用材料为
烤烟和晒晾烟，王志德等 的研究中除普通烟草外
还包括野生种，祁建民等⋯ 所用栽培种包括烤烟、
晒烟、白肋烟、香料烟等不同烟草类型；而本研究所
用材料全部为烤烟品种，且多是推广品种和骨干亲
本，因此遗传相似程度更高。本研究还表明，单独基
于 RAPD标记和 ISSR标记计算出的遗传相似系数
间呈极显著相关，但相关系数较小；得到的聚类结果
尽管有相似之处，但也有一定差异。产生差异的主
要原因可能是这两种标记所检测的基 因座位不
同 及所用的标记数量有限 引¨。RAPD和 ISSR标
记结合起来可能较单独使用某一种标记能更好地覆
盖基因组的不同区域，因而得到的聚类分析结果与
系谱信息吻合程度更高。
本研究通过聚类分析发现，聚类结果与系谱信
息多数情况下相符，但也有例外，表明定向选择压力
可能对烤烟品种间遗传关系有较大影响，因此仅从
系谱上有时难以客观评价烤烟品种间遗传关系。研
究还表明，国外引进品种与国内选育品种并未完全
聚在各自类群，意味着分子水平的遗传关系和地理
来源间缺乏必然联系，与已有研究类似 ]。分析
其原因，一是国内育成品种的亲本中多数有国外引
进品种，其次是国内外育种 目标和选择方向相近。
提示我们在今后育种中进行亲本选择时，不要局限
于地理远缘，应参考分子标记分析结果 ’m J。
参考文献：
[1] 陈瑞泰主编．中国烟草栽培学[M]．上海：上海科学技术出版
社 ，1987．4．
Wiliams J G K，Kubelik A R，Livak K J，Rafalski J A，Tingey S
V．DNA polymorphisms am plifed by arbitrary primers are used as
genetic markers[J]．N~／,e／c Acid Res，1990，18(22)：6522—
6531．
Zietkiewiez E，Rafalski A，Labuda D．Genome fingerprinting by
simple t~squence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reac-
tion amplifcation[J]．Genom／cs，1994，20：176—183．
张鹏 ，解玉红 ，周东坡．随机扩增 多态 DNA技术在遗传育种
中的应用[J]．生物技术通讯，2003，14(4)：346—348．
王建波．ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]．
遗传 ，2002，24(5)：613—616．
许明辉，郑民慧，刘广田．烟草品种 RAPD分子标记遗传差异
研究[J]．农业生物技术学报，1998，6(3)：282—284．
肖炳光，卢江平，卢秀萍，白永富，王绍坤 ，李天飞．烤烟品种
的 RAPD分析[J]．中国烟草学报，2000，6(2)：10—15．
何川生，何兴金，葛颂，李天飞，许凌云 ，许美玲，许介眉．烤烟
品种资源的 RAPD分析[J]．植物学报 ，2001，43(6)：610—
614．
王志德，牟建民，戴培刚，王伟峰，蒋予恩．部分烟草核心种质
RAPD分析[J]．中国烟草学报，2003，9(4)：20—25．
杨本超，肖炳光，陈学军，石春海．基于 ISSR标记的烤烟种质
遗传多样性研究[J]．遗传，2005，27(5)：753—758．
祁建民，王涛，陈顺辉 。梁景霞．部分烟草核心种质资源遗传
多样性与亲缘关系的 ISSR标记分析[J]．作物学报，2006，32
(3)：373—378．
粱景霞，祁建民，陈顺辉．烟草基因组 DNA提取及 SRAP分子
标记技术体系建立[J]．中国烟草学报，2005，11(4)：33—38．
Nei M 。Li W ．Mathematical model for studying genetic variation in
terms of restriction endonuelea~es[J]．Proc Natl Acad＆ USA，
1979，76(10)：5269—5273．
Rohlf F J．NTSYSpc：numerical taxonomy and multivariate analy—
sis system，Version2．0[CP／DK]．Exeter Software，Setauket，New
York，USA，1998．
Reddy M P，Sarla N，Siddiq E A．Inter simple sequence repeat
(ISSR)polymorphism and its application in plant breeding[J]．
Euphytica，2002。128(1)：9—17．
Schut J w。Qi X。Stam P．Association between relationship meas-
UreS based on AFLP markers，pedigree data and morphological
traits in barley[J]．TheorAppl Genet，1997，95：1161—1168．
周延清，景建洲，李振勇，张宝华，贾敬芬．利用 RAPD和 ISSR
分子标记分析地黄种质遗传多样性[J]．遗传，2004，26(6)：
922—928．
Souframanien J，Gopalakrishna T．A comparative analysis of ge-
netie diversity in blaekgram genotypes using RAPD and ISSR
markers[J]．TheorAppl Genet，2004，109：1687—1693．
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