全 文 ：武汉植物学研究 2008，26(2)：179—182
Journa／of Wuhan Botanical Research
不同念珠藻的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用
汜-t4-羽仪 ，胡征宇 ，梅 洪 。
(1．中国科学院水生生物研究所，武汉 430072；2．中国科学院研究生院，北京 100039；3．中国科学院武汉植物园，武汉 430074)
摘 要：研究了 Nostoc sp．FACHB87、Nostoc paludosum FACHB89等 l0株念珠藻的甲醇提取物对酪氨酸酶的抑制
作用。结果表明，随着提取物浓度的升高，对酪氨酸酶的抑制作用也增强。其中 Nostoc sp．FACHB892的甲醇提取
物对酪氨酸酶抑制作用最强，在 33．3 mL的最高测试浓度下，抑制率可达到 60．54％；Nostoc sp．FACHB95、
Nostoc sp．FACHB106、Ⅳ_punctifoFine FACHB252、 calcicola FACHB389和 Ⅳ．parmiloides FACHB392的甲醇提取物．
在33．3 mL的最 高测试 浓度下，抑制率分别 为41．55％、37．58％ 、46．94％、52．12％ 和47．95％。Nostoc sp．
FACHB892的甲醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用表现为可逆抑制，抑制类型为非竞争型抑制。
关键词：念珠藻；次级代谢产物；酪氨酸酶
中图分类号：Q949．22 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2008)02—0179．04
Tyrosinase Inhibitory Activities of M ethanolic Extracts
from Diferent Nostoc Species
FAN Yu-Yi ，HU Zheng．Yuh
，
Mei Hong ’
(1．Institute ofHydrobiology，The Chinese Academy ofSciences，Wuhan 430072，China；￡．Graduate School ofChinese Academy of
Sciences，Beijing 100039，China；3．Wuhan Botanical Garden，The Chinese Academy ofSciences，Wuhan 430074，China)
Abstract：The inhibitory effects on tyrosinase of the methanolic extracts from 10 Nostoc strains were
investigated．Th e results show that the inhibitory action for the above 6 strains of Nostoc enhanced with the
increase of concentration of the methanolic extracts．The methanolic extracts of Nostoc sp．FACHB892 has
great inhibitory capacity on tyrosinase．of which the inhibitory rate iS 6O．54％ at concentration of
33．3 g／mL，while the methanolic extracts of other 5 strains(Nostoc sp．FACHB95，Nostoc sp．
FACHB106．Ⅳ_ptrtctiforrfte FACHB252，Ⅳ_calcicola FACHB389 andⅣ_parmiloides FACHB392)exhibit．
ted weaker inhibitory effects．The inhibitory rates are 41．55％ ，37．58％ ，46．94％ ，52．12％ and 47．95％
respectively at the same concentration．The inhibitory mechanism of the methanolic extracts of Nostoc sp．
FACHB892 on tyrosinase iS reversible and noncompetitive indicated by the enzymatic kinetic analysis．
KeY words：Nostoc：Secondary metabolites；Tyrosinase
酪氨酸酶(EC．1．14．18．1)是一种含铜的多酚
氧化酶，普遍存在于人和动物体内，是黑色素生物合
成过程中必不可少的关键酶。它先将酪氨酸羟化，
产生邻位二羟基苯丙氨酸(L-多巴)，然后再将多巴
氧化成多巴醌，进而生成一系列引起褐化的色素
物⋯。对该酶抑制剂 的研究主要集 中在高等植
物 -s]，Kubo等从植物(茴芹、腰果等)中提取的一
系列化合物，对该酶具有显著的抑制作用 。Ma-
suda研究小组从一系列植物细胞提取物中筛选出
了良好的酪氨酸酶抑制剂 J。藻类来源的酪氨酸
酶抑制剂包括：从绿色微囊藻中提取的一种三环脂
肽 Microviridin_9 J，从匍匐昆布中提取的 Phlorofueo-
furoeekl A，Eckstolonol等 。¨。和从阿氏颤藻中提取的
Oscilapeptin G，当 Oscilapeptin G的浓度为 1．0×
10～mol／L，酪氨酸酶的活性被抑制 55％⋯ 。
近年来，在念珠藻(Nostoc)细胞提取物中发现
了一系列具有生物活性的物质，如从水华水体中分
离的念珠藻Nostoc sp．TAU strain IL-235的提取物对
蛋白酶活性有抑制作用 12]，Nostoc sp．Strain GSV
224的提取物和从 Nostoc sp．ATCC53789中提取的化
合物n0st0cycl叩eptides对人鼻咽癌细胞和直肠癌细
胞的的生长有抑制作用 ¨H J，地木耳(Ⅳ．corltrltuIte)
收稿日期：2007—08—03，修回日期：2007—1 1—28。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30671611)。
作者简介：范羽仪(1983一)，女，湖北武汉人，硕士研究生，研究方向为藻类生物技术。
$通讯作者(E—mail：huzy@ihb．ac．cn)。
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180 武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
的细胞提取物具有抑制真菌的作用 。念珠藻能
产生多种活性物质的能力使其极有可能成为农用和
药用活性物质的生物来源之一 ]。我们研究念珠
藻的甲醇提取物对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用及其作
用机理，旨在对念珠藻的开发和利用提供实验数据。
1 材料与方法
1．1材料
1O株念珠藻：Nostoc sp．FACHB87、Ⅳ．paludosum
FACHB89、Nostoc sp．FACHB95、 linckia FACHB
103、Nostoc sp．FACHB106、Nostoc sp．FACHB 139、
M punctifo FACHB252、M calcicola FACHB3 89、
Ⅳ．parmiloides FACHB392、Nostoc sp．FACHB 892由
中国科学院水生生物研究所藻种库提供，在(25±
5)℃、3600 lx、BG一11培养基通空气条件下，培养至
指数生长后期。
1．2 试剂
蘑菇酪氨酸酶 (mushroom tyrosinase)为 Sigma
化学公司产品，比活力为 3900 U／mg；L一酪氨酸(L—
Tyrosine)为 Duchefa公司产品；其它试剂均为国产
分析纯。
1．3 甲醇提取物的制备
收获藻样并风干粉碎后，用甲醇浸泡过夜，旋转
蒸发仪蒸干浸出液，得到固体提取物。收集固体提取
物，用 DMSO配置成 1 mg／mL溶液于4℃保存备用。
1．4 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制
1．4．1 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活力的影响
提取物对酪氨酸酶的抑制参照Masuda和Kubo的方
法 ’ ，并略作修改。待测样品用 DMSO进行浓度
梯度稀释，浓度分别为 1、0．5、0．25、0．125 ms／
mL；换算成反应体 系 中的终浓度分别 为 33．3、
16．65、8．325、4．3 g／mL。反应在 96孔细胞板上
进行，每组 8孔，分别是：A．不含样品，但含酪氨酸
酶的阴性对照，3孑L重复；B．不含样品及酪氨酸酶的
空白对照，1孔；C．包含样品及酪氨酸酶，3孔重复，
D．含样品但不含酪氨酸酶的空白对照，1孔。A孔
中加入 190 L pH 6．8、0．1 moL／L磷酸缓冲液，
1O IxL 1380 U／mL酪氨酸酶；B孔中加入 200 L相
同的磷酸缓冲液；C孔中加入 180 L磷酸缓冲液，
1O L 1380 U／mL酪氨酸酶，1O L样品；D孔中加
入 190 L磷酸缓冲液，1O L样品。然后将细胞板
在 3O℃条件下放置 5 min，再在每孔中加入100 L
2．5 mmol／L L一酪氨 酸 (见 表 1)。在 3O℃ 反应
10 min后，立即置于 Tecan Sunrise酶标仪中测量在
475 nm下的吸光值。提取物对酪氨酸酶活性的抑
制按公式计算：
抑制率 ： ×100％ I)
表 1 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶的抑制活性检测方法
Table 1 Method of inhibitory activity test Oil tyrosinase
from the methanolic extracts of Nostoc
按照材料与方法1．4．1操作。
{Operate as material and method 1．4．1
1．4．2 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶抑制的作用
机制 选择一种抑制效果较好的念珠藻提取物，参
照1．4．1的方法，所加试剂顺序和体积均不变，以
2．5 mmol／L L一酪氨酸为底物，分别测定不同浓度的
甲醇提取物(1 mg／mL和 0．5 mg／mL)和不同浓度
的酪氨酸酶(1380、690、345、172．5 U／mL)对 L一酪氨
酸氧化活力的影响，A盯 =C—D 。通过作图法判
断抑制剂的作用机理。
1．4．3 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性作用的
动力学研究 选择抑制效果较好的其中一株念珠
藻，参照1．4．1的方法，所加试剂顺序和体积均不
变，以1O L酪氨酸酶(1380 U／mL)，测定 1 ms／mL
的念珠藻提取液和不 同浓度 的 L一酪氨酸(1．25、
0．625、0．3125 mmol／L)下酪氨酸酶对 L一酪氨酸氧
化活力的影响，A475=C—D 。采用 Lineweaver—
Burk双倒数法作图判断抑制效应。
2 实验结果
2．1 念珠藻提取物对酪氨酸酶活力的影响
在 1O株念珠藻的甲醇提取物 中，Nostoc sp．
FACHB892的甲醇提取物对酪氨酸酶抑制作用最
强，在33．3 I~g／mL的最高测试浓度下，抑制率可达
到6O．54％；其余5株：Nostoc sp．FACHB95、Nostoc
sp．FACHB 106、Ⅳ．punctifo·丌 FACHB 252、Ⅳ．
1)公式中的 A、B、c、D分别代表 A、B、c、D每孔在 475 nm处的吸光值。
2)c、D分别代表 c孔和 D孔在475 nm处的吸光值。由于是在相同的时间内测定的，故可以将 A475=C—D当作酪氨酸酶催化反应速度
的定量表示。
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第2期 范羽仪等：不同念珠藻的提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用 181
calcicola FACHB389和 Ⅳ_parmiloides FACHB392的
甲醇提取物，在33．3 g／mL的最高测试浓度下，抑
制率分别为41．55％、37．58％、46．94％、52．12％和
47．95％，抑制效果均是随着测试浓度的升高，对酪
氨酸酶的抑制作用增强 (表 2)。其中，Ⅳ_calcicola
FACHB389和 Nostoc sp．FACHB892的甲醇提取物
导致酶活力下降一半的浓度(Ic )分别为 29．67、
23．92 g／mL。未检测到其余 4株念珠藻甲醇提取
物对酪氨酸酶具有抑制作用。
2．2 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶抑制的作用机制
在6株念珠藻 中，33．3 p~g／mL的 Nostoc sp．
FACHB892的甲醇提取物对酪氨酸酶的抑制效果最
强，选取该株念珠藻提取液研究其对不同浓度酪氨
酸酶的影响。结果表明在甲醇提取液浓度一定的情
况下，随着酪氨酸酶浓度的增加，其吸光值呈线性增
加；而在酪氨酸酶浓度一定的情况下，随着提取液浓
度的增加，其吸光值呈下降趋势。由图 1可以看出，
随着 Nostoc sp．FACHB892甲醇提取液浓度的增加，
3条直线的斜率呈下降趋势，且 3条直线均过原点，
说明 Nostoc sp．FACHB892甲醇提取液对该酶的抑
制作用属于可逆过程，增加效应物含量导致酶活力
下降是由于酶活力受到抑制，催化效率降低，而不是
通过导致有效酶量减少而引起酶活力的下降。因为
不可逆的抑制剂将会导致有效酶量下降而产生一组
平行线，横轴的截距将随着不可逆抑制剂含量的增
大而增大。
2．3 念珠藻甲醇提取物对酪氨酸酶活性作用的动
力学研究
为了进一步研究念珠藻的甲醇提取液对酪氨酸
酶的抑制作用类型，在测活体系中，通过固定酪氨酸
酶的浓度，改变底物 L一酪氨酸的浓度，测定了33．3 ／
mL Nostoc sp．FACHB892提取液对酪氨酸酶活力的
影响(图 2)。通过 Lineweaver—Burk双倒数作图显
示，在底物浓度一定的条件下，随着抑制剂浓度的升
高(空白对照表示抑制剂浓度为 0)，在475 am处吸
光值减小，且两条直线相交于 x轴上的一点，判断其
抑制类型属于非竞争型抑制，即提取物与酪氨酸酶分
子上的独立部位结合，不与底物竞争酶涪陛中心。
表 2 6株念珠藻不同浓度甲醇提取物对酪氨酸酶活性的抑制效果
Table 2 The inhibitory efects of six Nostoc strains methanolic extracts on tyrosinase
注：“一”表示无抑制效果；除无抑制效果的值外，每个值均用(平均值 ±SD)表示；上标中不同的字母代表同一浓度下抑制率的显著性差异
(P<0．05，one—way ANOVA)。
Note：“一”means there were no inhibitory capacity；Each value represents mean ±SD，except those which have no inhibitory capacity；Those with
diferent super~rlpt leters are signifcantly diferent in each concentration(P<0．05，one—way ANOVA)．
1
O 8
n
o 6
O4
O 2
0
● 33．3 ug／mL甲酵提取物
0 5O0 1O00 1 500
酪氨酸酶浓度 0d／mL)
Concentration of tyrosinase
图 1 Nostoc sp．FACHB892甲醇提取液
对酪氨酸酶的抑制作用分析
Fig．1 Reversible inhibition analysis of the methanolic
extract of Nostoc sp．FACHB892 on tyrosinase
● 33．3ug／mL甲醇提取物
l4
12
10
8
— 6
4
2
z
一
t l 2 3 4
J
。
I，酪氨酸浓度倒数 (1／mmo1．1
1，⋯ ⋯ ：一 ．．、I、 T ● ～ ；
图 2 Nostoc sp．FACHB892甲醇提取液抑制
酪氨酸酶动力学曲线分析
Fig．2 Kinetic an alysis of Tyrosinase inhibited by
the methanolic extract of Nostoc sp．FACHB892
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武 汉 植 物 学 研 究 第 26卷
3 讨论
酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶。近年来的研
究表明，黑色素在防紫外线辐射、清除自由基、作为
无定形半导体、化妆品，以及生物杀虫剂的光保护剂
等方面都有广阔的应用前景 ¨。酪氨酸酶的抑制
剂可被作为化妆品中的增白剂如熊果苷和曲酸，因
此可以以酪氨酸酶作为研究对象开发更好的美 白
剂 。而念珠藻具有产生多种活性物质能力的这
一 特性，使得对其以及其所产生的活性物质的研究
和开发利用成为可能 ¨。
本实验结果表 明：Nostoc calcicola FACHB389、
Nostoc sp．FACHB892、Nostoc sp．FACHB95、Nostoc
sp．FACHB106、Ⅳ．punctifolqne FACHB252 和 Ⅳ．
parmiloides FACHB392的甲醇提取物都具有抑制酪
氨酸酶活性的作用，不同念珠藻的提取物对酪氨酸
酶活性的影响不同，且提取物浓度与其对酪氨酸酶
活性抑制效果之间存在正相关关系。Ⅳ．calcicola
FACHB389、Nostoc sp．FACHB892这 2株念珠藻的
甲醇提取物对酪氨酸酶的抑制作用大于另外4株。
导致不同念珠藻提取物对酪氨酸酶抑制活性强弱不
同的最主要原因，可能是不同念珠藻产生代谢产物
的种类和含量不同。
由动力学曲线可以看出，Nostoc sp．FACHB892
的抑制机理并非提取物与底物竞争酪氨酸酶活性中
心，而是提取物通过与酪氨酸酶的独立部位结合来
产生抑制作用。但甲醇提取液成分复杂，不能排除
有其他抑制类型存在的可能。
在实验室培养的 10株念珠 藻中，Nostoc sp．
FACHB892由于在培养过程 中受到通气条件的影
响，在培养40 d后才达到指数生长后期，而其余 9
株念珠藻均是经过 18 d左右的培养就达到指数生
长后期。由于次级代谢产物的产生和培养条件有密
切的关系，Nostoc sp．FACHB892的抑制效果较强也
可能是由于培养时间较长，细胞分裂缓慢，次级代谢
产物积累较其他株更多所导致。
已鉴定出的具有生物活性的念珠藻次级代谢产
物多为肽类、生物碱、大环内脂物等物质 ¨，从蓝藻
中提取的具有酪氨酸酶活性的 Oscilapeptin G属于
脂肽类物质 ¨，Microviridin也是一种三环脂肽 9 J。
若要确定本研究中具有酪氨酸酶抑制活性的物质是
否属 于 肽 类，以 及 培 养 条 件 对 于 Nostoc sp．
FACHB892产生酪氨酸酶抑制剂的影响，则需要更
进一步的实验来确定。
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