全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(1)：44~48
Journal of Wuban Botanical Research
山茶属金花茶组金花茶系的AFLP分析
唐绍清h ，杜林方 ，王 燕
(1．广西师范大学生物系，桂林 541004}2．四川大学生命科学学院，成都 610064)
摘 要：应用扩增片段长度多态性(AFLP)分子标记方法，对分布于我国的金花茶组金花茶系的 35个样品进行了
分析，样品包括了《中国植物志》收录的该类群的 l5种 2变种、2个未收录的种和 4个已归并但在分类处理上存在
分歧的种 。4对引物组合：E—ACG／M—CAG，E—ACG／M—CTG，E—AGG／M—CTG，E—AGG／M—CAT用于选择性扩增，
其中 EcoR I引物的 5，端用荧光染料进行标记。这 4个引物组合共得到 298条扩增带 ，其中278条带是多态性的。
计算了样品间的 Nei和 Li(1979)相似性系数，基于这一相似性系数应用 UPGMA法进行聚类分析，得到了树状分
枝图。分析结果表明：(1)贵州金花茶是一个好种；(2)支持将毛籽金花茶、陇瑞金花茶、弄岗金花茶和大样弄岗金花
茶归并到淡黄金花茶的观点；(3)薄叶金花茶、小花金花茶、夏石金花茶和小瓣金花茶之间的亲缘关系较近。
关键词 ：山茶属；金花茶系；AFLP；种间关系
中图分类号 ：Q941；Q949．758．4 文献标识码：A 文章编号：1000—470X(2004)Ol一0044—05
AFLP Analysis of Ser．Chrysant Chang(Camellia，Sect．Chrysantha)
TANG Shao—Qing ，DU Lin—Fang。，WANG Yan
(1．Biology Department，Guangxi Normal University，Guilin 541005，China；
2．Colege of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China)
Abstract：Amplified fragment length polymorphism (AFLP)was assessed in 35 accessions of
Ser．Chrysantha Chang(Camellia，Sect．Chrysantha)collected from China，including 1 4 species
and 1 variety following Flora of Ch ina and other 7 species being controversial in taxonomy．Four
primer combinations E—ACG／M—CAG，E—ACG／M—CTG，E—AGG／M—CTG and E—AGG／M—CAT
were used for selective amplification．from which EcoR I primers were fluorescent dye—labeled．
A total of 298 fragments were detected，in which 278 are polymorphic．W e analyzed the AFLP
data using Nei&Li similarity coefficient and UPGMA Cluster method．The result suggested that
(1)C．huana was a distinctive species；(2)C．1onggangensis，C．1ongruiensis，C．ptilosperTaa，
and C．grandis should be merged into C．flavida．；(3)C．chrysanthoides，C．micrantha，C．xi-
ashiensis and C．parvipetala are closely related and probably conspecific．
Key words：Camellia；Ser．Chrysantha；AFLP ；Species relationship
金花茶组(Sect．Chrysantha Chang)属山茶科
(Theaceae)山茶属(Camellia)，1979年由张宏达教
授建立[1]。金花茶组又下分五室茶系(Ser．Flavae)
和金花茶系(Ser．Chrysantha Chang)。五室茶系 2
种，其中 1种我国有分布；金花茶系 16种，国产 15
种[引。金花茶组主要分布于中国广西南部及越南北
部，个别种分布于贵州和云南；因为具有黄色的花，
它们在园艺上具有重要的价值。山茶属金花茶组植
物在分类处理上存在分歧[3 ]。
扩增片段长度多态性(AFLP)作为一种分子标
记方法[9]，既具有 RFLP的准确性，又具有 PCR的
高效性的优点，已被应用于亲缘关系很近的植物种
收稿日期：2003—05—10，修回日期：2003—07—15。
基金项目：国家自然科学基金资助项 目(39860011)}教育部西部地区高校高访学者基金资助。
作者简介：唐绍清(1965一)，男，博士，从事植物学教学和研究工作。
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第 1期 唐绍清等：山茶属金花茶组金花茶系的 AFLP分析 45
间系统关系分析Do-az3。我们应用 AFLP分子标记分
析了金花茶组金花茶系《中国植物志》收录的所有的
15种 2变种、2个未收录的种和4个已归并但在分类
处理上存在分歧的种，目的在于研究分析金花茶系植
物之间的遗传关系及探讨金花茶系的分类学问题。
I 材料和方法
I．1 植物材料
采集贵州金花茶、离蕊金花茶和云南金花茶 3
种植物的叶子，将其剪成小片，放在有变色硅胶的封
口袋中干燥后，带到实验室用于 DNA提取；其他种
则采集其枝条插于水中带回实验室，取叶用于 DNA
提取。本研究所用植物材料来源、凭证标本等详见
表 1。云南金花茶的凭证标本藏于昆明植物研究所
植物标本室，贵州金花茶和离蕊金花茶的凭证标本
藏于贵州省林业科学研究院植物标本室，其他种类
的凭证标本藏于广西师范大学植物标本室。
表 l 用于研究的植物材料来源、凭证标本及各研究者的分类处理观点
Table 1 Origin，vouchers of accessions used for this study and the researchers’view treating this taxon
*外类群；1．√，承认该种；2．一，未作处理。
* Outgroup；1．√ ，the species is recognized by the author；2．一 ，the species hasn’t been treated by the author．
1．2 DNA提取
采用 CTAB法 ¨ 提取基因组总 DNA，用玻璃
珠法纯化总 DNA。
1．3 AFLP分析
AFLP分析参照 Vos等Es]的方法略有修改。基
因组总DNA用两限制性内切酶(EfDR I和Mse I)
在 37℃保温 2 h，接着在 65℃保温 2 h进行双酶切；
限制性酶切消化后，用 T4DNA连接酶在 20~C保温
16 h将酶切片段连接到双链 EcoR I和 Mse I接
头Es]上；连接产物用预扩增引物进行预扩增；预扩增
产物稀释 10倍后，进行选择性扩增。从 24对引物组
合中筛选出 4对引物组合：E—ACG／M—CAG，E一
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武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
ACG／M—CTG，E—AGG／M—CTG，E—AGG／M—CAT
用于进行正式选择性扩增，其中EcoR I引物的 5-
端用荧光染料进行标记，扩增时 EcoR I引物和Mse
I引物的最终浓度分别为0．1~mol／L和0．5~mol／L；
选择性扩增 PCR扩增程序为：94℃ 0．5 min，65℃
0．5 min，72℃ 1 min，以后每个循环的退火温度降
低0．7~C，共 13个循环；然后 94℃ 0．5 min，56℃
0．5 min，72℃ 1 rain，再进行 23个循环。选择性扩增
产物在 6 的变性聚丙烯酰胺凝胶上，在自动测序仪
(ABI 377)分离检测，得到AFLP的DNA指纹图谱。
1．4 数据分析
AFLP是显性标记，同一对引物组合扩增产物中
电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，按照相同
迁移位上有扩增带记为 1、无带为 0的方法记录电泳
谱带，仅仅清晰的扩增带才被记录。得到的AFLP表
型数据矩阵用于进一步分析。用NTSYS—pc version
2．02(Applied Biostatistics，Setauket，New York，
USA)软件进行计算分析；相似性系数计算依照Nei
和 Li的方法[ ‘。，即S ，一2a／(2a+b+C)，式中 ，是
个体 和个体_『之间的相似性系数，a是在 和 都存
在的扩增带数，b为在 i存在而在_『不存在的扩增带
数，C为在_『存在而在i不存在的扩增带数；用UPG—
MA法对得到的相似性系数矩阵进行聚类分析。
2 结果
从 24组引物组合中选择了 4组引物组合用于
分析金花茶组的 35个样品，这 4个引物组合：E—
ACG／M—CAG，E—ACG／M—CTG，E—AGG／M—CTG，
E—AGG／M—CAT分别得到了 5O、82、67、99 AFLP
条扩增带，总的 298条扩增带中的 278条带是多态
性的，多态性带占 93．2 。实际产生的带型要比记
录的多，读取的数据仅是大小在 100 bp至 350 bp
之间的而且清晰的带型。基于这 298条带进行样品
间的Nei和 Li相似性系数计算，样品间的相似性系
数 列于表 2。基 于 Nei和 Li相 似性 系数应 用
UPGMA法进行聚类分析，得到的树状分枝图见图1。
结果表明，金花茶(C．nitidissima)、小果金花茶
(C．nitidissima var．microcarpa)、显脉金花茶(C．
euphlebia)、东兴金花茶(C．tunghinensis)、平果金花
茶(C．pingguoensis)、顶生金花茶(C．pingguoensis
var．terminalis)、毛瓣金花茶(C．pubipetala)、柠檬
黄金花茶(C．1iomonia)、凹脉金花茶(C．impressi一
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图 1 基于 Nei和 Li相似性系数得到的 UPGMA聚类分枝图
Fig．1 UPGM A phenogram based on Nei and Li’S similarity coefficient
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第 1期 唐绍清等：山茶属金花茶组金花茶系的 AFLP分析 47
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武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
ne?vls)、云南金花茶(C．fascicularis)和中东金花茶
(C．achrysantha)等在形态上易于区别的种，在聚类
分析图上明显地与其他类群区分开来。小果金花茶
是金花茶的变种，顶生金花茶是平果金花茶的变种，
在聚类分析图上可以反映出来。在形态上易混淆的淡
黄 金 花 茶 (C．flavida)、毛 籽 金 花 茶 (C．
ptilosperma)、陇瑞金花茶(C．1ongruiensis)、弄岗金
花茶(C．1onggangensis)和大样金花茶(C．grandis)
聚合在一起，薄叶金花茶(c．chrysanthoides)、小花
金花茶(C．micrantha)、夏石金花茶(C．xiashien—
sis)和小瓣金花茶(c．parvipetala)聚合在一起，说明
它们之间的亲缘关系较近。《中国植物志》未收录的贵
州金花茶(C．huana)和离蕊金花茶(C．1iberofila—
menta)聚合在一起，并与其他类群的关系相对较远，
说明至少先发表的贵州金花茶是一个好种。分析结
果还表明，所有金花茶组金花茶系的种类聚在一起，
说明金花茶组金花茶系是一个自然类群。
3 讨论
3．1 淡黄金花茶 、毛籽金花茶、陇瑞金花茶、弄岗
金花茶和大样金花茶之间的关系
这 5个种的叶片形状和大小变化较大，果特征
十分一致，叶柄短，花和果小，花瓣淡黄色，膜质，果
皮薄，通常 2室发育，种子密被棕色柔毛，因此闵天
禄将它们归并成 1种，即淡黄金花茶[8]，叶创兴等[3]
将陇瑞金花茶之外的其他 4种归并成 1种，即淡黄
金花茶，《中国植物志》[2]把它们归并成 2种，即淡黄
金花茶和大样金花茶。本研究的分析结果表明，它们
之间确实存在相对较近的亲缘关系，支持将它们归
并成 1种即淡黄金花茶的分类处理观点。
3．2 薄叶金花茶、小花金花茶、夏石金花茶和小瓣
金花茶的关系
各学者对这 4个种的分类处理见表 1。薄叶金
花茶和小花金花茶被各研究者承认[2 。对另 2个
种的处理各学者存在分歧，《中国植物志》[2 承认小
瓣金花茶，并把夏石金花茶归并到小瓣金花茶；叶创
兴等 。 认为夏石金花茶和小瓣金花茶都归并到柠檬
黄金花茶；闵天禄 认为夏石金花茶归并到薄叶金
花茶，而小瓣金花茶归并到柠檬黄金花茶。这 4个种
分布于广西龙州及凭祥的土山常绿阔叶林中，花小，
子房有毛，有可能是因叶形及叶片大小变化较大而
引起外观形态差异，不同研究者依各 自所见作不同
分类处理。AFLP分析结果表明，它们之间有较近的
亲缘关系，它们可能是同一种植物。
龙州金花茶 (C．1ongzhouensis)被《中国植物
志》承认[2]，也有研究者认为应把它归并到薄叶金花
茶[3 ]，AFLP分析结果表明，龙州金花茶与其他种
的关系相对较远，但在实验过程中，龙州金花茶的总
DNA很难提取，尝试不同提取方法经多次提取，都
未得到高质量的DNA，可能会影响龙州金花茶的分
析结果，从而使龙州金花茶与其它分类群的关系未
得到正确反映。
致谢：复旦大学南蓬博士、中国科学院昆明植物研究所
的刀志灵、贵州省林业科学研究院的杨成华、南宁金花茶公
园的黄连冬和广西植物研究所的赵瑞锋在数据计算分析和
研究材料采集上给予了很大帮助，在此表示感谢 !
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