全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(6)：572～574
Journal of Wuhan Botanical Research
菠菜叶中存在两种谷氨酰胺合成酶同工酶
周忠新，王云华，张楚富 ，袁永泽，马敬坤
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室，武汉大学生命科学学院，武汉 430072)
摘 要：运用非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳结合活性染色的方法 ，在菠菜(Spinacia oleracea L．)生长发育过程中，观
察到叶片中至少存在 2种谷氨酰胺合成酶(Gs)，其中一种GS的活性随发育进程而逐渐升高，而另一种GS的活性
逐渐降低。在不同来源的成熟的菠菜叶片中同样观察到 2种 GS的存在。
关键词：谷氨酰胺合成酶；同工酶 ；菠菜；发育
中图分类号 ：Q946．5；$636．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—470X(2004)06—0572—03
Two lsozymes of Glutamine Synthetase Observed in Spinach Leaves
ZHOU Zhong-Xin，WANG Yun—Hua，ZHANG Chu-Fu’，YUAN Yong—Ze，M A Jing—Kun
(Key Lab．of MOE for Plant Developmental Biology，Colege of，Jife Sciences，Wuhan University，Wuhan 430072，China)
Abstract：Two isoforms of glutamine synthetase(GS)were observed using native polyacrylamide
gel electrophoresis(Native—PAGE)and activity staining in spinach(Spinacia oleracea L．)leaves
of the different development stages．The activity of one isoform increased gradually and the other
one declined gradually．These GS isoforms also were detected in spinach leaves from the different
SOUrCeS．
Key words；Glutamine synthetase；Isoenzyme；Spinach(-S户 ，2口c 口oleracea L．)；Development
在 ATP存在的条件下，谷氨酰胺合成酶(Glu—
tamine Synthethase，GS，EC6．3．1．2)催化无机氮
(以NH4+的形式)参入到谷氨酸中，生成谷氨酰胺。
在高等植物中，GS和谷氨酸合酶(Glutamate syn
thase，GOGAT)构成的Gs—GOGAT循环是氨同化
的主要途径[1]。由于氮素是影响植物生长发育的主
要元素，因此，该酶的表达调节受到广泛的关注。以
前的研究表明，在高等植物中存在GS1和GS2两种
类型的同工酶[2 ]。GS1主要存在于非光合组织中，
而 GS2在叶片中占优势。Hirel等首次利用离子交
换层析法从绿色的菠菜(Spinacia oleracea L．)叶中
分离到一种GS，并用间接免疫荧光法将其定位于叶
绿体中L5]，该酶属于GS2型。后来，McNaly等利用
离子交换法，对许多不同种类的植物叶中 GS同工
酶进行了分析，他们根据GS1和 GS2在叶片中存在
的情况，将所分析的植物分成 4种类型L6]：类型 A
只存在 GS1；类型 B只有 GS2存在；类型 C存在
GS1和 GS2，但 GS2占优势；类型 D也存在 GS1和
GS2，只是 GS1占GS总活性的较大部分。菠菜叶
中只有 GS2存在，故属于B类。1985年，Ericson对
纯化的菠菜叶GS2进行了动力学研究[7]，同时证实
该酶是由8个亚基组成，每个亚基的相对分子量为
44 000 此后关于菠菜GS的研究少见报道。
Li等发现在玉米中至少存在 6种不同的GS基
因[2]，Morey等也在大豆中观察到由一个小的基因
族编码的多种GS1型同工酶基因L3]。这些研究都观
察到比最初检测到的更多的GS同工酶基因。在水
稻根部，Hirel和 Gadal报道用离子交换法只分离到
一 种 GSr ，后来 Zhang等用 Native—PAGE结合活
性染色以及 Immunoblotting方法首次观察到水稻
收稿日期：2004—02—11，修回日期：2004—06—02。
基金项 目：国家自然科学基金资助项 目(30270130)
作者简介：周忠新(1978一)，男，硕士生．从事植物生化和分子生物学研究。
通讯作者(E—mail：cfzhang@whu．edu．cn)。
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第 6期 周忠新等：菠菜叶中存在两种谷氨酰胺合成酶同工酶
根中存在 2种GS同工酶嘲。这里，我们报道采用同
样的方法在菠菜叶中也观察到2种GS同工酶。
1 材料和方法
材料的培养 将菠菜(Spinacia oleracea L．华
菠一号)种子剥去坚硬的外壳，置入含营养液的湿润
的沙土层中。营养液的组成为 NH NO。(4 mmo1)、
NaH2PO4 (4 mmo[)、 K2SO4 (4 mmo[)、CaCI2
(4 mmo[)、MgSO (4 mmo[)、FeCI 3·6H2O(54 tLmo[)、
H3BO3(45 tLmo[)、CuSO4(0．3／~mo[)、ZnSO4·7H2O
(0．7 ／~mo[)、(NH4)6M o7O24·4H2O (0．015 ／~mo[)、
MnCI2·4H2O (9 tLmo1)。在自然光照条件下培养，
温度大致保持在 10~22。C范围内。选取生长一致的
第 5和第 6叶，分别于叶片出叶后的第 10、17、24、
31 d取材，实验重复 3次，选取各片叶变化最为相近
的一组数据作为实验结果。为了初步分析 GS的类
型，当种子最初置入沙土层时，一部分在 自然光照下
生长，另一部分移至暗处培养，幼叶 4 d后分别取
材。材料置于一70℃冰箱中保存。
菠菜叶绿体的制备 参照 Hirel等的方法进
行 。
酶液制备 菠菜及 叶绿体粗酶液的抽提按
Zhang等的方法进行[8]。
GS活性测定和同工酶的检测 按文献[8]介绍
的方法测定GS的合成酶活性。一个GS活性单位定
义为每分钟于 37℃下催化产生 1 mol 一谷氨酰异
羟肟酸所需的酶量。GS总活性以每小时每克新鲜
材料催化产生的 一谷氨酰异羟肟酸微摩尔数表示。
粗酶液中的蛋 白质的分离按 Davis的方法进行[9]，
活性染色按 Zhang等的方法进行[引。
2 结果和讨论
活性测定表明，在自然条件下，菠菜叶中的 GS
活性随发育的不同天数而变化(图 1)。在叶片发育
的初期阶段，GS活性随发育而升高，于第 24 d活性
达到最高。其后 GS活性降低。
从图 2可以清晰地观察到 2种 GS的变化与叶
片的发育有着密切的关系。当菠菜光照生长 4 d
后，可以看到 2条 GS活性带(图 2：A1)，上面一条
带与暗处培养同样天数的活性带相比(图 2：A2)，其
颜色明显加深。业已证明，植物叶片中的 GS2是光
诱导产生的l3 ．10]，虽然菠菜叶在光照下可以观察
到 2种 GS活性带，但是由于下面出现了一条颜色
很 浅的GS活性带 ，因此，不能肯定上面的活性带就
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三
图 1 菠菜叶片发育过程中GS活性变化
Fig．1 Activity change of glutamine synthetase
in different development stages of spinach leaves
是 GS2。但是叶绿体提取液的 GS在电泳迁移中的
位置与上面的带相同，因此，可以认为该酶是 GS2
型酶(图2：A3)。当菠菜在光照下继续培养时，可以
明显地看到菠菜第 5叶中 2种 GS活性带的变化
(图 2：B)。这 2种 GS活性的比例呈交互变化的趋
势，上面的GS活性带随着发育进程，其颜色逐步加
深，而下面的 GS活性带则逐渐变浅。第 6叶的 GS
活性带也基本表现出类似的变化(结果未示出)。GS
活性测定的结果(图 1)与 GS同工酶变化的总趋势
是一致的，这种变化现象反映出这 2种 GS同工酶
随发育进程而呈现出不同的变化。为了进一步证实
菠菜叶中的确存在 2种 GS同工酶，我们从两块不
同菜地取回成熟的菠菜叶，2种GS活性带同样清晰
可见(图 2：C)。
利用 KODAK 1D 3．5软件分析图2：B中 2种
GS同工酶在发育中的活性比例变化。图 3所示出的
GS2活性占总活性的比例与 GS同工酶活性谱带的
变化(图 2：B)是一致的。
为什么 Hirel等[4]在菠菜叶中只检测到 1种GS
呢?这也许与他们取材的时间和分离 GS同工酶的
方法有关。Hirel培养的菠菜叶生长了28 d，然而，我
们的试验结果表明 由于 2种 GS同工酶的活性随
发育的进程而变化，在第 24 d和第 31 d，第 5叶的2
种GS同工酶表现出下面的GS同工酶活性带较低，
且 2种同工酶的电荷差异不是太大 ，很可能在用离
子交换层析进行分离时，活性较低的GS同工酶被忽
略了。这也许是他们只能检测到 1个活性峰的原因。
在水稻的根中，较早的研究表明只存在 1种 GS，
后来Zhang等用 Native—PAGE与活性 染色 以及
Immunoblotting方法发现水稻根部存在 2种 GS同
工酶L8J。同工酶的发现是随着电泳方法的进步而发
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574 武 沮 值 蜥 学 研 究 第 22卷
2 3 4
A
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B (’
一 (1S
A：l为光 下生长4 d帕叶，2为暗处土}乇{d 叶．3为丹离 菠菜叶绿悼GS：B：1、2、3和 分别为生 }毛l0、l 7、24
3】d的第 5叶；C；1和 2分 取白两块 1；同_I』问的菠菜叶。每个沛道∞上样量均为 80 I．
A：1．Spinach 1caⅢ grown l『1 iltun1lnation[or d．2．spinach lcave grown in darkness for日d．0．GS[rom the sepat-aI ed
chloroplas }B：1 2．3．and 4，the 5th leaves KrowinP fjr 10．1 7．24．altd 3l d．respectire【 j【： ．2，spinach [eaves
from tWO diferen【iields，cespective]v．Each sampte ol 80 I．wa5．oaded【(】stot of c【
图 2 菠菜发育过程中 2种Gs同工酶活性的变化
F g．。 The isozv!”P han ⋯ r( rr th diI[ercat dcvdopme⋯at proce ss of sp[nach k s
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[3]
图 3 GS2在不同发育阶段占总活性的比倒
Fig．3 The activity ratio of GS2 tO t<*ta L GS acti~ity
in dilfere rn development stages [5]
现的．而且比离子交换法具有更高的分辨率 所 +
我们认为菠菜叶在生长发育过程_{l有存在 2种 GS
同工酶的可能．但是我们不知道这种现象是否具有
品剥 特异}生。当然，我们不能排除这佯一种可能．即
在菠菜叶中也计：存在不同大小的寡聚体。有报道表
明，在甜菜中观察到GS的八聚俸祁四聚体 进一
步的研究将会证实菠菜叶中这2种GS分别届于哪
·刊 形式
参考文献 ：
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