全 文 ：植物科学学报　 ２０１４ꎬ ３２(６): ６６１~６７０
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１４􀆰 ６０６６１
植物钙结合蛋白与钙离子结合鉴定技术的研究进展
邹娟子ꎬ 胡诗琦ꎬ 王碧莹ꎬ 景 沛ꎬ 杨 俊ꎬ 谢国生∗
(华中农业大学植物科学技术学院ꎬ 武汉 ４３００７０)
摘　 要: Ｃａ２＋在植物生长发育和环境适应过程中发挥着中心调控作用ꎬ 钙信号是植物生长发育和逆境响应的主
要调控因子ꎬ 钙结合蛋白是植物钙信号传导途径的最重要组分之一ꎬ 然而植物钙结合蛋白在体内和体外与 Ｃａ２＋
结合的技术体系还有待完善和发展ꎮ 为了系统总结植物钙结合蛋白的鉴定方法与技术ꎬ 本文从定性结合、 定量
结合和结合方式等角度ꎬ 综述了植物钙结合蛋白在体内和体外条件下与 Ｃａ２＋结合的原理、 方法、 特点和应用前
景ꎬ 详细阐述了近年来的主要检测方法ꎬ 并对其今后的发展趋势作了展望ꎮ 本文将为植物钙结合蛋白的分离、
功能鉴定和作用机制的研究提供技术支撑ꎮ
关键词: 钙信号ꎻ 钙结合蛋白ꎻ 鉴定方法ꎻ 原理ꎻ 应用
中图分类号: Ｑ９４５　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１４)０６￣０６６１￣１０
　 　 　 收稿日期: ２０１４￣０６￣２４ꎬ 退修日期: ２０１４￣０８￣１２ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金项目(３１３７１５５０)ꎻ 国家级大学生创新训练项目(２０１３１０５０４０１１)ꎻ 华中农业大学大学生科技创新基金
(ＳＲＦ２０１２２６７)ꎮ
　 作者简介: 邹娟子(１９８８－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事植物逆境信号传导和分子育种研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｕａｎｚｉ８８０８０６＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｘｉｅｇｓｈ＠ｍａｉｌ􀆰 ｈｚａｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｌａｎｔ
Ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｉｏｎｓ
ＺＯＵ Ｊｕａｎ￣Ｚｉꎬ ＨＵ Ｓｈｉ￣Ｑｉꎬ ＷＡＮＧ Ｂｉ￣Ｙｉｎｇꎬ ＪＩＮＧ Ｐｅｉꎬ ＹＡＮＧ Ｊｕｎꎬ ＸＩＥ Ｇｕｏ￣Ｓｈｅｎｇ∗
(Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ ｐｌａｙ ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈꎬ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ
ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓｅｓ. Ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌｓ ａｒｅ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｇｒｏｗｔｈꎬ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅꎬ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｈａｖｅ ａｌｓｏ ｂｅｅｎ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ
ｐｌａｎｔｓ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ
ｈａｖｅ ｎｏｔ ｙｅｔ ｂｅｅｎ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ. Ｈｅｒｅꎬ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｉｅｗｐｏｉｎｔｓ ｏｆ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ
ｂｉｎｄｉｎｇꎬ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓꎬ ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓꎬ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙｓ
ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ ａｒｅ ａｌｓｏ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ. Ｍｅａｎｗｈｉｌｅꎬ ｔｈｉｓ ｒｅｖｉｅｗ ｐｒｏｖｉｄｅｓ
ａ ｎｅｗ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃａｌｃｉｕｍ ｓｉｇｎａｌꎻ Ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓꎻ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅꎻ Ａｐｐｌｉｃａ￣
ｔｉｏｎ
　 　 钙作为植物中必需的大量元素ꎬ 在植物生长发
育和环境适应过程中发挥着中心调控作用ꎬ 钙信号
是植物生长发育和逆境响应的主要调控因子[１－３]ꎮ
植物的成花诱导、 花芽分化及开花调控等过程都与
Ｃａ２＋密切相关ꎬ Ｃａ２＋还有助于增强植物茎杆的硬
度和植株挺立ꎬ 提高植物生物膜对离子的选择性吸
收能力、 防止早衰、 参与信息传递以及增强植物对
环境胁迫的抗性ꎮ 在植物组织中ꎬ Ｃａ２＋主要以果胶
酸钙、 钙调蛋白和肌醇六磷酸钙镁(植酸盐)等形
态存在[４]ꎬ 其含量大约为 ０􀆰 １％ ~ ５％ꎮ 在植物细
胞中ꎬ 液泡含有大量的草酸钙、 柠檬酸钙和苹果酸
钙等有机酸钙[５]ꎻ 细胞壁中 Ｃａ２＋含量也很高ꎬ 为
１０ μｍｏｌ / Ｌ ~ １０ ｍｍｏｌ / Ｌꎮ 一般认为ꎬ 植物对外界
刺激的反应主要是通过细胞质中 Ｃａ２＋浓度的瞬间
变化来传递的ꎮ 在静息条件下ꎬ 细胞质中游离
Ｃａ２＋浓度较低(１０ ~ ２００ ｎｍｏｌ / Ｌ)ꎬ 但这一极低浓
度的细胞质游离 Ｃａ２＋在植物生长发育过程中起重
要的调控作用ꎮ 在细胞质中ꎬ Ｃａ２＋主要通过与钙离
子靶蛋白质等大分子结合来避免 Ｃａ２＋与细胞质中
的无机磷酸盐形成沉淀而影响细胞正常的生理活
动ꎮ 当细胞受到外界刺激时ꎬ 细胞质中 Ｃａ２＋浓度
可升高到 １ μｍｏｌ / Ｌ 左右ꎮ 而且ꎬ 不同种类的逆境
胁迫会引发细胞质中 Ｃａ２＋浓度在变化幅度、 时间
及空间分布等变化特征上有所不同ꎬ Ｃａ２＋浓度的这
种瞬间升高被称为 Ｃａ２＋瞬态 (Ｃａ２＋ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ)或
Ｃａ２＋波(Ｃａ２＋ ｗａｖｅ)或 Ｃａ２＋振荡(Ｃａ２＋ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ)
或 Ｃａ２＋峰值(Ｃａ２＋ ｓｐｉｋｉｎｇ)或 Ｃａ２＋指纹(Ｃａ２＋ ｓｉｇ￣
ｎａｔｕｒｅ) [２ꎬ ５]ꎬ 正是由于细胞内外 Ｃａ２＋浓度的巨大
差异才适合于钙信号传递功能的发生[６]ꎮ 细胞质
中 Ｃａ２＋浓度升高的瞬态出现后ꎬ 钙感受器蛋白
(ｃａｌｃｉｕｍ ｓｅｎｓｏｒ)或钙信号解码器蛋白( ｃａｌｃｉｕｍ
ｓｉｇｎａｌ ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ)或钙结合蛋白(ｃａｌｃｉｕｍ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ)与 Ｃａ２＋结合ꎬ 导致这些钙感受器
蛋白疏水区外露并与生物膜或疏水性生物大分子结
合ꎬ 从而调节生物膜或这些靶蛋白的功能和酶促活
性ꎬ 即钙结合蛋白被激发而感受和传递钙信号ꎮ 目
前ꎬ 植物钙结合蛋白研究较多ꎬ 包括多种类型ꎬ 如
ＣａＭ (钙调素ꎬ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ)、 ＣＭＬ (类钙调素ꎬ
ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ￣ｌｉｋｅ)、 ＣＤＰＫ(钙离子依赖的蛋白激酶ꎬ
ｃａｌｃｉｕｍ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ)、 ＣＢＬ (类钙
调磷酸酶 Ｂ 蛋白ꎬ ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ Ｂ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ)和
含有 １ ~ ２个 ＥＦ手结构域(ＥＦ￣ｈａｎｄ ｍｏｔｉｆ)的钙结
合蛋白等ꎬ 而钙信号传导途径和过程取决于这些钙
结合蛋白与 Ｃａ２＋之间的亲和力、 结合速率、 结合程
度以及结合方式等因素的变化ꎬ 细胞内钙结合蛋白
与 Ｃａ２＋只有特异性、 亲和性结合后才能完成钙信号
的传递和信号放大过程ꎮ 因此ꎬ 探讨植物钙结合蛋
白在植物体内和体外条件下与 Ｃａ２＋结合的原理、 方
法、 特点和应用等ꎬ 对钙结合蛋白的分离、 功能鉴
定和作用机制研究具有重要的理论和应用意义ꎮ
２００２年ꎬ Ｖｏｇｅｌ主编出版了 ２ 本«钙结合蛋白
实验手册»ꎬ 总结了钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合的原理
和实验技术[７ꎬ８]ꎮ 随后ꎬ 许多学者创建和完善了在
植物体内和体外条件下高通量鉴定钙结合蛋白的技
术体系ꎬ 尤其是近 １０ 多年来该领域的研究进展很
快ꎮ 为此ꎬ 本文主要综述了植物钙结合蛋白与
Ｃａ２＋在结合原理、 结合强度、 结合速率和结合方式
等方面的研究进展ꎬ 提出了分离、 鉴定植物钙结合
蛋白的思路和方法ꎬ 本文将为加快植物钙结合蛋
白的分离和功能鉴定、 揭示钙信号调控途径在植
物生长发育和逆境适应性中的作用机制研究提供
技术支持ꎮ
１　 检测方法的分类
在植物体外条件下ꎬ 钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结
合是一个涉及到生物化学和生物物理的动态过程ꎬ
它受到溶液的种类、 离子组成和离子强度的影响ꎮ
钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合后其构象、 生物物理或生
化活性发生改变ꎬ 从而促进或抑制下游靶蛋白的结
合和活性ꎮ 鉴定钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结合方式的
方法有两种ꎬ 一是生物化学方法ꎬ 包括电泳和酶促
动力学方法ꎻ 二是生物物理学方法ꎬ 如分光光度法
(紫外光谱法、 圆二色性法和荧光法)、 核磁共振
法、 热动力学(热量、 焓变测定)等ꎮ 依据这些检
测方法就可以鉴定植物钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结合
特性ꎮ
在植物体内ꎬ 对于某些难以诱导合成或纯化的
钙结合蛋白ꎬ 可以从组织中抽提后利用其结合 Ｃａ２＋
前后的蛋白质构象或生理活性发生改变的特性ꎬ 鉴
定这些钙结合蛋白的表达水平和性质的变化ꎮ
２　 在植物体外检测钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合
的方法
２􀆰 １　 定性测定钙结合蛋白与 Ｃａ２＋是否结合的方法
(１)电泳迁移率改变分析(ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｉ￣
ｇｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙꎬ ＥＭＳＡ)
２６６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
利用钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合前后构象发生改
变进而影响蛋白质迁移率的特性ꎬ 可以直接利用
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ(ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ￣ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ￣
ｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ)或Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 电泳分离
后对凝胶进行考马斯亮蓝 Ｒ－２５０ 染色ꎬ 观察 Ｃａ２＋
结合或脱去后蛋白质电泳迁移率 Ｒｆ的改变ꎬ 判断
其与 Ｃａ２＋结合和结合强度的大小ꎮ ＥＭＳＡ 的主要
操作要点是在体外将纯化的钙结合蛋白与 Ｃａ２＋或
ＥＧＴＡ(ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｂｉｓ (２￣ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ) ￣
ＮꎬＮꎬＮ􀆳ꎬＮ􀆳￣ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ)温浴反应后进行电泳
观察ꎮ 利用该方法已检测了不同植物的钙结合蛋
白ꎬ 如 ＯｓＣａＭ１￣３ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)、 ＯｓＣＭＬ１ / ３ /
４ / ５ / ８ / ９ / １１ / １３ꎬ 以及 ＭｔＣａＭＰ１(Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎ￣
ｃａｔｕｌａ)在体外与 Ｃａ２＋结合后电泳率的改变[９ꎬ１０]ꎮ
目前ꎬ ＥＭＳＡ 已成为一种利用 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 或Ｎａ￣
ｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ鉴定含有 ２ 个或 ２ 个以上 ＥＦ 手结构域
钙结合蛋白的经典方法ꎻ 此外ꎬ 由于含有 １ 个 ＥＦ
手结构域的钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合前后的电泳迁
移率 Ｒｆ变化较小ꎬ Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ 较 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 更
容易鉴定这类钙结合蛋白ꎮ
(２) ４５Ｃａ２＋覆盖法( ４５Ｃａ２＋ ｏｖｅｒｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ)
１９８４年 Ｍａｒｕｙａｍａ等[１１]最早提出了快速定性
检测钙结合蛋白或多肽是否与钙离子结合的钙离子
覆盖法ꎬ 它的主要操作步骤是先将钙结合蛋白转移
到 ＰＶＤＦ膜(ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ)或
ＮＣ膜(ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ)上ꎬ 再与 ４５Ｃａ２＋
温浴后利用放射自显影检测钙离子是否与钙结合蛋
白结合ꎮ １９９６年 Ｆｒａｎｄｓｅｎｔ 等[１２]在水稻中分离了
一个钙结合蛋白 ＥＦＡ２７(ＥＦ￣ｈａｎｄꎬ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ
ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｏｆ
２７􀆰 ４ ｋＤ )ꎬ 并 将 ＭＢＰ￣ＥＦＡ２７ ( ｍａｌｔｏｓｅ￣ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ)融合蛋白进行印迹后ꎬ 利用 ４５Ｃａ２＋覆盖法
证实了该蛋白在体外可以与 Ｃａ２＋结合ꎮ 随后ꎬ 该
方法在拟南芥钙结合蛋白的鉴定中应用最为广
泛[１３ꎬ１４]ꎮ 为了克服 ４５Ｃａ２＋覆盖法使用放射性同位素
的缺点ꎬ １９９７ 年 Ｔａｔｓｕｉｍｉ 等[１２]在 ＰＶＤＦ 转膜和
ｑｕｉｎ￣２探针检测基础上ꎬ 建立了一种新的方法:
将钙结合蛋白直接点在 ＰＶＤＦ膜上ꎬ 并和钙离子荧
光探针 ｑｕｉｎ￣２ 杂交ꎬ 通过检测荧光强度快速检测
钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结合情况ꎬ 获得了较好的实
验效果ꎮ 该方法的优点是可以在 ＰＶＤＦ膜上利用荧
光强度的大小快速测定钙结合蛋白与钙离子结合强
度的大小ꎬ 特别适用于微量或难分离纯化的钙结合
蛋白质的检测ꎮ
(３) 荧光染色方法 ( ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ)
２０００年ꎬ Ｔａｋｅｚａｗａ 等[１６]最早利用苯基琼脂
糖 ４Ｂ(ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ)树脂分离纯化了小麦
的钙结合蛋白 ＴａＣＣＤ１ ( Ｔｒｉｔｉｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｃａ２＋￣
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ)ꎮ 发现该钙结合蛋白与树脂的疏
水性结合依赖于溶液中 Ｃａ２＋的存在与否ꎮ 钙结合
蛋白与钙离子结合后ꎬ 利用钙离子荧光探针就可以
检测钙结合蛋白光学特性的变化ꎬ 这是目前鉴定钙
结合蛋白最简便的方法之一ꎮ 为此ꎬ 华中农业大学
植物科学技术学院植物逆境分子生理实验室利用
Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ树脂与钙结合蛋白的结合特
性ꎬ 在含有相同浓度 Ｃａ２＋的 Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
树脂溶液中ꎬ 分别加入不同浓度的钙结合蛋白ꎻ 经
过一段时间后ꎬ 利用 Ｃａ２＋荧光指示剂 Ｆｕｒａ￣２测定
溶液中荧光强度的变化ꎬ 就可以检测溶液中游离
Ｃａ２＋浓度变化以及钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结合强度ꎬ
因此该方法可以在溶液中快速定性检测钙结合蛋白
与 Ｃａ２＋的结合情况ꎮ 目前ꎬ Ｃａ２＋的荧光染料已经
商品化生产ꎬ 非常容易买到ꎬ 价格也比较便宜ꎬ 表
１中列出了常用钙荧光探针的基本特征及应用实
例ꎮ 荧光染色方法在植物体外和活体内 Ｃａ２＋浓度
的测定和植物钙结合蛋白鉴定中的应用已非常广
泛[７ꎬ８ꎬ１７]ꎮ
２􀆰 ２　 定量分析钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合强度的方法
(１)Ｃａ２＋选择电极法(ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅ￣
ｌｅｃｔｒｏｄｅ ｍｅｔｈｏｄ)
Ｃａ２＋选择电极对 Ｃａ２＋具有高度的选择性ꎬ 其
电极电位与 Ｃａ２＋活度的对数呈线性关系ꎬ 并遵循
能斯特方程ꎮ Ｃａ２＋选择电极法可以定量检测溶液中
Ｃａ２＋与钙结合蛋白结合前后 Ｃａ２＋的电位改变ꎬ 从
而直接测定溶液中游离 Ｃａ２＋的浓度ꎬ 进而判断与
钙结合蛋白结合的 Ｃａ２＋浓度及 Ｃａ２＋与钙结合蛋白
的结合平衡ꎬ 该方法还可以测定钙结合蛋白的浓
度ꎮ 肖凤娟等[２７]测定了达到滴定终点时拟南芥叶
片中 Ｃａ２＋浓度为 ８２􀆰 ５ μｍｏｌ / Ｌꎬ 拟南芥钙调素蛋白
３６６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邹娟子等: 植物钙结合蛋白与钙离子结合鉴定技术的研究进展
表 １　 钙离子荧光探针的特征和应用
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅｓ
荧光探针
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｐｒｏｂｅｓ
与钙离子的结合常数
Ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ
ｗｉｔｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ
(ｎＭ)
激发光波长
Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ
ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
(ｎｍ)
发射光波长
Ｅｍｉｓｓｉｏｎ
ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
(ｎｍ)
应用实例
Ｅｘａｍｐｌｅｓ
Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ １８５ ５６８ ５８９ 荧光共振能量转移成像[１８]
Ｃａｌｃｉｕｍ ｇｒｅｅｎ￣１ １９０ ４８０ ５２０ 测定桉树根毛细胞质中钙离子浓度[１９]
Ｆｌｕｏ￣３ ３９０ ４８０ ５２０ 测定花粉管中钙离子浓度变化[２０]
Ｆｌｕｏ￣４ ３４５ ４８０ ５２０ 测定拟南芥根毛细胞质和外质体中钙离子浓度[２１]
Ｆｕｒａ￣２ １４５ ３４０ ５００ 测定保卫细胞细胞质中的钙离子浓度[２２]
Ｉｎｄｏ￣１ ２３０ ３４０ ４０５ 测定烟草 ＢＹ￣２悬浮细胞中的钙离子浓度[２３]
Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ １７０ ４８８ ５２０ 测定细胞分裂期中的钙离子浓度[２４]
Ｑｕｉｎ￣２ １１５ ３４０ ４９０ 测定拟南芥镉胁迫诱导 ＰＣＤ时钙离子浓度[２５]
Ｙｅｌｌｏｗ Ｃａｍｅｌｅｏｎ ２.１ꎬ
Ｙｅｌｌｏｗ Ｃａｍｅｌｅｏｎ ３.３ꎬ
Ｙｅｌｌｏｗ Ｃａｍｅｌｅｏｎ ３.６
２５０ ４４０ ４８０ / ５３０
利用 ＹＦＰ和 ＣＦＰ荧光强度的比值测定细胞内钙信
号变化[２６]
　 　 Ｎｏｔｅｓ: ＰＣＤꎬ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈꎻ ＹＦＰꎬ Ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ＣＦＰꎬ Ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ.
ＡｔＣａＭ的浓度为 ２０􀆰 ６ μｍｏｌ / Ｌꎮ 目前ꎬ 由于该方
法需要使用 Ｃａ２＋选择性电极而在鉴定植物钙结合
蛋白与 Ｃａ２＋的结合中应用还较少ꎮ
(２)平衡透析法(ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉａｌｙｓｉｓ)
该方法的原理是将钙结合蛋白加入到半透性纤
维素袋中ꎬ 然后将袋子放入含有 Ｃａ２＋的透析溶液
中最终达到化学和扩散平衡ꎻ 通过计算透析袋内侧
和外侧中 Ｃａ２＋的浓度ꎬ 就可以测定出 Ｃａ２＋与钙结
合蛋白的结合常数和解离常数ꎮ Ｙｕａｓａ ＆ Ｍａｅ￣
ｓｈｉｍａ[２８]利用平衡透析法测定了萝卜液泡中的钙结
合蛋白 ＲＶＣａＢ在体外对钙离子的结合特性ꎬ 结果
表明该蛋白可以与 １９个 Ｃａ２＋结合ꎬ 其与 Ｃａ２＋的解
离常数为 ３􀆰 ４ ｍＭꎬ Ｍｇ２＋和 Ｋ＋两种离子对 Ｃａ２＋与
钙结合蛋白的结合影响较小ꎮ 总的来说ꎬ 平衡透析
法的优点是利用透析袋就可以很容易测定钙结合蛋
白与 Ｃａ２＋的结合特性ꎮ
(３)流动透析法( ｆｌｏｗ ｄｉａｌｙｓｉｓ)
该方法的原理是将钙结合蛋白加入到一个小
室中ꎬ 同时将含有４５Ｃａ２＋标记的溶液加入到另外
一个小室中ꎬ 两个小室被一层半透性纤维素膜隔
开ꎻ 当纤维素膜两侧达到扩散平衡时ꎬ 测定蛋白
质溶液中 Ｃａ２＋和透析溶液中 Ｃａ２＋的浓度的差异ꎬ
就可以检测出 Ｃａ２＋与钙结合蛋白的结合强度ꎮ
Ｙｏｓｈｉｄａ等[２９]在 １００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ和 ２５℃条件下ꎬ
利用流动透析法测定了小麦钙调素蛋白 ＴａＣａＭ
与 ４个 Ｃａ２＋ 的结合常数 ( ０􀆰 ２０、 ０􀆰 ２５、 ０􀆰 ０２５、
０􀆰 ００２４ μｍｏｌ / Ｌ)ꎮ 由于流动透析法需要特殊的透
析仪而限制了它在植物钙结合蛋白鉴定中的应用ꎮ
(４)圆二色光谱法(ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃ￣
ｔｒｏｓｃｏｐｙꎬ ＣＤＳ)
蛋白质是一种含有肽键的多聚物ꎬ 肽键中的亚
胺生色团分别在 １９０ ｎｍ和 ２２０ ｎｍ处含有 π→π∗
和 ｎ→π∗过渡态ꎬ 因此肽键的远紫外光圆二色光
谱反映了该蛋白质的二级构象ꎮ 但是ꎬ 在蛋白质中
只有 ４个生色团ꎬ 如色氨酸(Ｔｒｐ)、 酪氨酸(Ｔｙｒ)、
苯丙氨酸(Ｐｈｅ)、 半胱氨酸(Ｃｙｓ)的侧链基团ꎬ 可
以强烈吸收 ２５５ ~ ３４０ ｎｍ 范围内的近紫外光ꎬ 这
些生色团的近 ＵＶ(ｕｌｔｒａ ｖｉｏｌｅｔ)圆二色光谱反映了
该蛋白质的三级和四级构象ꎻ Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、 组
氨酸(Ｈｉｓ)和蛋氨酸(Ｍｅｔ)的侧链基团还可以有效
吸收波长小于 ２５０ ｎｎ 的远紫外光ꎮ 这些生色团对
总吸光度的贡献决定于溶液的种类、 离子强度和温
度等条件ꎬ 吸光度 Ａ 与摩尔吸光系数 εＭ、 光径 Ｌ
和蛋白浓度 Ｃ 有关ꎬ 且符合 Ｌａｍｂｅｒｔ￣Ｂｅｅｒ 定律ꎬ
Ａ ＝ εＭ􀅰Ｃ􀅰Ｌ( εＭ: 摩尔吸光系数ꎬ Ｃ: 摩尔浓
度ꎬ Ｌ: 比色皿的光路长度)ꎬ 实验测定的参数是
左圆偏振光和右圆偏振光吸光度的差值ꎬ ΔＡ ＝
ＡＬ－ ＡＲ ＝ ΔεＭ􀅰Ｃ􀅰Ｌ(ΔεＭ: 摩尔吸光系数的差
值)ꎮ 虽然 ＣＤＳ 只提供了低分辨率的蛋白质结构
信息ꎬ 但它具有二个显著的优点: 一是对蛋白质
４６６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
的构象变化很敏感ꎻ 二是可以适用于多种不同的
低浓度蛋白质溶液ꎬ 因此它被广泛应用于蛋白质
结构的分析与研究中ꎮ 例如ꎬ 可以判断蛋白质中
二级结构的比例ꎻ 检测 ｐＨ、 盐和溶剂种类造成
的蛋白质构象变化ꎻ 检测加热和变性剂(脲、 盐
酸胍)等引起的蛋白质变性情况ꎻ 检测蛋白质与
蛋白质或多肽ꎬ 蛋白质与配体之间的互作以及蛋
白质亚基之间的缔合程度ꎻ 研究蛋白质变性和复
性的动力学过程等ꎮ
目前ꎬ ＣＤＳ在钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合的定性
和定量鉴定中应用最为广泛ꎬ 已成为鉴定植物钙结
合蛋白的最普遍和通用的方法之一ꎮ Ｄｏｂｎｅｙ
等[３０]测定了拟南芥类钙调素蛋白 ＡｔＣＭＬ４２在含有
５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＧＴＡ或 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２溶液中在波长
１７９􀆰 ５ ~ ２６０ ｎｍ 范围内的近紫外光谱(图 １)ꎬ 发
现 ＡｔＣＭＬ２蛋白与 Ｃａ２＋结合之前ꎬ 在 １９０ ｎｍ处存
在 １个最大正峰、 ２０８ ｎｍ 和 ２２２ ｎｍ 处存在 ２ 个
最小峰ꎬ 表明该蛋白明显存在 α￣螺旋结构ꎻ ＡｔＣ￣
ＭＬ２蛋白与 Ｃａ２＋结合后在 １９０ ｎｍ 处的摩尔椭圆
度下降ꎬ ２０５ ~ ２３０ ｎｍ 范围内的吸收峰增加ꎬ 表
明与 Ｃａ２＋结合后该蛋白的 α￣螺旋比例减少ꎮ Ｃｈｉｎ￣
ｐｏｎｇｐａｎｉｃｈ等[９]利用 ＣＤＳ发现ꎬ ３个水稻钙调素
蛋白 ＯｓＣａＭ１、 ２、 ３和 ８个钙调素类似蛋白 ＯｓＣ￣
ＭＬ１、 ３、 ４、 ５、 ８、 ９、 １１、 １３ 溶 液 在 加 入
１ ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２或 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＧＴＡ 后ꎬ 它们在
２ ０８ｎｍ和２２２ｎｍ处的摩尔椭圆度均存在２个最
30
20
10
0
-10
-20
180 200 220 240 260
!
"
#
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%
Wavelength nm( )
［
］θ
(
)
de
g1
0
cm
dm
ol
-3
2
-1
&
粗实线表示加入 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２后的 ＣＤ 光谱ꎬ 细短线表示
加入 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＧＴＡ的 ＣＤ光谱ꎮ
Ｔｈｉｃｋ ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ
５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２ꎬ ａｎｄ ｔｈｉｎ ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅ ｄｅｎｏｔｅｓ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｕｍ
ａｆｔｅｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＥＧＴＡ.
图 １　 钙离子诱导 ＡｔＣＭＬ４２蛋白二级结构的改变[３０]
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
ＡｔＣＭＬ４２ ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ[３０]
小峰ꎬ 表明这些蛋白质均含有大量的 α￣螺旋结构ꎻ
加入 １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２后ꎬ 除了 ＯｓＣＭＬ１、 ３、 ９
外ꎬ 其它 ８个类钙调素蛋白在 ２０８ ｎｍ 和 ２２２ ｎｍ
处的摩尔椭圆度变化明显ꎬ 说明这 ８个类钙调素蛋
白与 Ｃａ２＋结合后其二级结构变化较大ꎬ 有利于钙
信号的向下传导ꎮ
(５) 差示扫描量热法 ( ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ
ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙꎬ ＤＳＣ)
该方法的原理是蛋白质的折叠和去折叠反应伴
随着热效应ꎬ 在恒定压力条件下测定蛋白质去折叠
时的放热量就可以表示该过程的热焓变化[３１]ꎬ 一
般可通过 ＤＳＣ仪直接测定蛋白质去折叠过程中的
放热变化ꎮ 溶液中蛋白质的热效应(焓变)是温度
的函数ꎬ 即可通过测定溶液中蛋白质最大热容量时
的温度变化范围来比较溶液中复性和变性蛋白质热
容量时的温度差异ꎬ 从而测定蛋白质的构象变化ꎮ
另外ꎬ 还可以测定 ２种不同对照溶液和蛋白质溶液
热容量的差异来评价蛋白质的热稳定性ꎮ 通过测定
热焓变化温度范围窄的原纤蛋白 Ｆｉｂｉｌｌｉｎ 时ꎬ 加热
速率宜为 １０ ~ ２０℃ / ｈꎬ 而对于其它蛋白质的加热
速率为 ３０ ~ ６０℃ / ｈꎮ
差示扫描量热法也用于钙调素与 Ｃａ２＋结合的
检测与鉴定ꎮ Ｙａｍｎｉｕｋ等[３２]利用 ＤＳＣ测定钙调素
蛋白的热稳定性时发现ꎬ 钙调素蛋白的 Ｎ 端和 Ｃ
端结构域发生转变时的中点温度 Ｔｍ值分别为 ６０℃
和 ４８℃ꎬ 表明其 Ｎ 端结构域较 Ｃ 端结构域更稳
定ꎻ 而且不同的点突变对结构域的 Ｔｍ值和变性热
焓变化 ΔＨｄ的影响存在明显差异ꎮ 在测定钙结合
蛋白与 Ｃａ２＋结合时ꎬ 利用 ＤＳＣ仪测定温度升高过
程中钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合后蛋白质构象的热稳
定性ꎬ 可间接反映出钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结合强
度、 结合方式和结合位点ꎮ
(６) 等温滴定量热法( ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｃａ￣
ｌｏｒｉｍｅｔｒｙꎬ ＩＴＣ)
该方法的原理依赖于生物分子与配体之间互作
时伴随的热效应(即吸热或放热效应)ꎬ ＩＴＣ的强度
取决于发生互作的生物分子结合常数和热焓的变
化ꎬ 因此结合曲线的形状和结合强度 Ｃ 等于分子
间结合时的平衡常数 Ｋａ、 溶液中蛋白质的浓度
[Ｐ ｔ]和结合计量 ｎ的乘积ꎬ 即 Ｃ ＝ Ｋａ􀅰[Ｐ ｔ]􀅰ｎꎮ
５６６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邹娟子等: 植物钙结合蛋白与钙离子结合鉴定技术的研究进展
通过高灵敏度、 高自动化的微量量热仪连续准确地
监测和记录一个化学变化过程的量热曲线ꎬ 从而能
原位、 在线和无损地同时提供热力学和动力学信
息ꎮ
等温注定量热法是测定生物大分子(蛋白质、
多肽、 ＤＮＡ、 ＲＮＡ)与配体(蛋白质、 核酸和 Ｃａ２＋
等)之间互作的最直接和最优化方法ꎬ 利用 ＩＴＣ 法
可以直接、 准确地测定溶液中钙结合蛋白与 Ｃａ２＋
结合的热动力学关系ꎮ Ｊａｍｓｈｉｄｉｈａ 等[３３]测定了水
稻类钙调素蛋白 ＯｓＣａＭ６１ 在 ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＨＥＰＥＳ
(ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ)溶
液中分别与 ４ 个 Ｃａ２＋结合的结合常数 Ｋａ(３􀆰 １×
１０４、 ３􀆰 ７×１０４、 １􀆰 １×１０３、 １３９ Ｍ－１)ꎮ 近年来ꎬ 等
温滴定量热法已发展成为一种研究生物大分子与配
体之间互作热力学和动力学的常用方法ꎮ
２􀆰 ３　 测定钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合方式的方法
(１) 稳态荧光光谱法 ( ｓｔｅａｄｙ￣ｓｔａｔｅ ｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ)
该方法的基本原理是钙结合蛋白 Ｔｒｐ 和 Ｔｙｒ 残
基中的芳香族基团具有荧光活性ꎬ 与 Ｃａ２＋结合后
钙结合蛋白中的这些芳香族基团周围的微环境发生
了改变ꎬ 从而引起其荧光光谱波长和荧光强度的改
变ꎬ 因此通过测定荧光光谱性质的变化就可以鉴定
与 Ｃａ２＋结合对其结合蛋白结构的影响ꎬ 以及钙结
合蛋白突变后对 Ｃａ２＋结合特性的影响ꎮ 蛋白质中
Ｔｒｐ残基的吲哚基团受某种波长的光子激发后产生
π∗高能激发态ꎬ 而电子回到低能量的基态时产生
荧光ꎬ 荧光的强度决定于蛋白质中荧光基团的多
少、 疏水性、 粘性和流动性ꎬ ＣａＭ 与 Ｃａ２＋结合前
后 ＣａＭ中 Ｔｙｒ 残基表现出明显的荧光强度差异ꎮ
稳态荧光光谱法是测定钙离子与 ＣａＭ 结合强度的
主要方法之一ꎬ 它的主要优点是: 只需要低浓度的
蛋白质溶液ꎬ 蛋白质中存在 Ｔｒｐ 和 Ｔｙｒ 荧光基团ꎬ
检测仪器简单ꎬ 荧光光谱范围较宽ꎮ 该方法还可以
用于研究溶液中蛋白质的构象变化、 蛋白质－蛋白
质互作、 蛋白质－ Ｃａ２＋结合、 蛋白质的膜定位以及
动力学参数测定等ꎮ 目前ꎬ 荧光光谱法是最普遍应
用的测定蛋白质构象的生物物理方法ꎬ 也是最便
捷、 快速检测钙结合蛋白与钙离子结合方式的方法
之一ꎬ 即在蛋白质溶液中加入荧光探针 ＡＮＳ(８￣
Ａｎｉｌｉｎｏ￣１￣ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ) 后ꎬ 再分别加入
ＣａＣｌ２或 ＥＧＴＡꎻ 随后利用荧光分光光度仪在
３７０ ｎｍ激发光下进行 ４００ ~ ６５０ ｎｍ 的发射光谱
扫描ꎬ 就可以检测加入钙离子后钙结合蛋白疏水结
构域的暴露情况[９ꎬ３３]ꎮ
(２)核磁共振光谱法(ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ)
该方法的原理是利用４３Ｃａ２＋具有四级( Ｉ ＝ ７ /
２)的原子核特性ꎬ 它与蛋白质结合后可以产生较
宽的峰值ꎬ 但仅仅利用４３ Ｃａ２＋不能测定单个 ＥＦ￣
ｈａｎｄ 结构域的作用ꎬ 需用更适合 ＮＭＲ 的离子
(如１１３Ｃｄ或２０７Ｐｂ)同形置换钙离子后来测定钙结
合蛋白与 Ｃａ２＋的结合特性ꎮ 钙结合蛋白中的 ＥＦ手
结构域含有氧配体ꎬ 它们的 ＮＭＲ 信号位于强磁场
谱区并能产生较大的化学位移ꎬ 利用 １Ｄ￣ＮＭＲ、
２Ｄ￣ＮＭＲ或 ｓｏｌｉｄ￣ｓｔａｔｅ ＮＭＲ 均可检测蛋白质中不
同 ＥＦ手结构域与 Ｃａ２＋的结合情况ꎮ 应用核磁共振
光谱法需要较高浓度的钙离子和钙结合蛋白ꎬ 而且
还需要昂贵的检测仪器和专业技术操作人员ꎬ 才能
测定钙结合蛋白 ＥＦ￣ｈａｎｄ 结构域与 Ｃａ２＋结合前后
的立体构象的精细变化ꎮ Ｄｏｂｎｅｙ 等[３０]利用１５ Ｎ￣
ＮＭＲ测定拟南芥类钙调素蛋白 ＡｔＣＭＬ４２ 与 Ｃａ２＋
结合时ꎬ 发现钙离子诱导该蛋白的共振发生化学位
移ꎻ 当 Ｃａ２＋达到饱和浓度时出现第 ３ 个共振峰ꎬ
揭示类钙调素蛋白 ＡｔＣＭＬ４２ 至少存在 ３ 个 ＥＦ￣
ｈａｎｄ 结构域ꎮ Ｇｉｆｆｏｒｄ 等[３４] 利用 ＮＭＲ 测定了
Ｍｇ２＋对大豆 ＳＣａＭ４ 蛋白与 Ｃａ２＋结合时亲和力和
蛋白质构象的影响ꎮ
(３)表面等离子共振技术 ( ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ
ｒｅｓｏｎａｎｃｅꎬ ＳＰＲ)
该方法的基本原理是: 当光线通过 ２个具有不
同折射率透明介质的界面时ꎬ 部分光线被发射ꎬ 部
分光线被折射ꎮ 当入射角大于临界入射角时ꎬ 所有
光线全部被反射而不会发生折射ꎻ 同时ꎬ 电磁场产
生的短暂光波射入到较低折射率的介质中ꎮ 当两介
质的界面镀有一层很薄的金属膜时ꎬ 就会产生与光
线传播方向平行的单色偏振光ꎬ 且在一定的入射角
范围内时就会导致发射光的强度明显降低ꎬ 这种现
象被称为 ＳＰＲꎮ ＳＰＲ 角度的大小依赖于金属膜的
种类、 光学常数、 厚度和均一性、 入射光的波长、
金属膜两侧介质的折射率等ꎮ 将一个蛋白质固定在
６６６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ表面ꎬ 另一个蛋白质或配体存在于溶
液中ꎬ 则表面等离子共振反应的强度与蛋白质之间
互作后引起的 ｓｅｎｓｏｒ ｃｈｉｐ 表面的折光率变化相
关ꎬ 也与两个蛋白质分子之间互作引起的浓度变化
有关ꎬ 因此实时测定 ＳＰＲ 信号可以计算出蛋白质
分子之间的结合常数 Ｋｏｎ、 解离常数 Ｋｏｆｆ及蛋白质
之间的结合平衡常数 Ｋａ ＝ ｋｏｎ / ｋｏｆｆꎮ
表面等离子共振技术主要利用 ＳＰＲ 仪的 ｓｅｎ￣
ｓｏｒ ｃｈｉｐ进行测定分析ꎮ 它含有一个在一侧镀有金
属膜的载玻片ꎬ 其中金属膜上覆盖了一层可以将蛋
白质等生物大分子固定的羧甲基葡聚糖(ｃａｒｂｏｘｙ￣
ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ) 介质ꎬ 且这种介质可以随着
不同生物分子的性质而改变ꎮ ＳＰＲ 不能直接测定
Ｃａ２＋与蛋白质的结合强度ꎬ 但可以研究 Ｃａ２＋对生
物大分子之间互作的间接影响ꎮ Ｚｈａｎｇ 等[３５]利用
ＳＰＲ测定了水稻 Ｃａ２＋ / ＣａＭ 依赖蛋白激酶 ＯｓＣＢＫ
与 ＣａＭ的解离常数ꎬ 证实它们之间的特异性和高
效性结合ꎮ 但是ꎬ 表面等离子共振技术需要借助昂
贵的 ＳＰＲ 检测仪才能测定 Ｃａ２＋对钙结合蛋白结合
活性和构象的影响ꎮ
３　 在活体内检测植物钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结
合的方法
　 　 (１)电泳迁移率改变分析(ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｉ￣
ｇｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙꎬ ＥＭＳＡ)
ＥＭＳＡ可以体外检测溶液中纯化钙结合蛋白与
钙离子的结合情况ꎬ 但在某些植物钙结合蛋白难以
在大肠杆菌体系中诱导合成时ꎬ 我们可以直接从植
物组织中提取膜蛋白ꎬ 再经过 ＥＧＴＡ和 ＣａＣｌ２处理
后利用 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测ꎮ Ｚｉｅｎｋ￣
ｉｅｗｉｃｚ 等[３６]检测了橄榄花药油体中钙结合蛋白
ｃａｌｅｏｓｉｎ 对 Ｃａ２＋的结合效应ꎬ 发现 ｃａｌｅｏｓｉｎ 与
Ｃａ２＋结合后的电泳迁移率变大ꎬ 证实 ｃａｌｅｏｓｉｎ 是
一种植物钙结合蛋白(图 ２)ꎮ
利用 ＥＭＳＡ进行体内检测的优点是不需要在
大肠杆菌体系中诱导和纯化植物钙结合蛋白ꎬ 而是
直接从植物组织中提取钙结合蛋白后ꎬ 利用 Ｗｅｓｔ￣
ｅｒｎ ｂｌｏｔ检测 Ｃａ２＋对植物钙结合蛋白结合前后空间
构象的影响ꎬ 这也是测定植物钙结合蛋白最直接的
方法之一ꎮ
A
B
Ca2+
Ca2+
EGTA
EGTA
Ca +
EGTA
2+
Ca +
EGTA
2+
35 kD
35 kD
25 kD
25 kD
花药油体中钙结合蛋白 ｃａｌｅｏｓｉｎ(Ａ)和花药表皮中钙结合蛋白 ｃａ￣
ｌｅｏｓｉｎ(Ｂ)提取和 ＥＧＴＡ 预处理后ꎬ １０ μｇ 蛋白分别与 ＣａＣｌ２、
ＣａＣｌ２ / ＥＧＴＡ或 ＣａＣｌ２＋ ＥＧＴＡ 温育一定时间ꎮ 利用全长 Ｃｌｏ３ 抗
体和 Ａｌｅｘａ６３３ 交联的羊抗兔 ＩｇＧ二抗ꎬ 测定 ｃａｌｅｏｓｉｎ的电泳迁移
率变化ꎮ
Ｃａｌｅｏｓｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｌｌｅｎ ＯＢｓ (Ａ) ａｎｄ ｐｏｌｌｅｎ ｃｏａｔ (Ｂ) . Ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｌｌｅｎ ＯＢｓ ａｎｄ ｐｏｌｌｅｎ ｃｏａｔ ａｎｄ ｐｒｅ￣
ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＥＧＴＡ. Ｐｒｏｔｅｉｎｓ (１０ μｇ) ｗｅｒｅ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣａＣｌ２ꎬ
ＣａＣｌ２ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ＥＧＴＡꎬ ｏｒ ｂｏｔｈ ＣａＣｌ２ ａｎｄ ＥＧＴＡ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ￣
ｌｙ. Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｂｅｄ ｗｉｔｈ ａ ＦＬ ａｎｔｉ￣Ｃｌｏ３ Ａｂꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ
ａｎ ａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｌｅｘａ ６３３￣ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｌｅｏｓｉｎ.
图 ２　 Ｃａ２＋对橄榄花药油体中钙结合
蛋白 ｃａｌｅｏｓｉｎ电泳迁移率的影响[３６]
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｓ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ
ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃａｌｅｏｓｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｌｌｅｎ ｏｉｌ ｂｏｄｉｅｓ[３６]
　 　 (２) ４５Ｃａ覆盖法( ４５Ｃａ ｏｖｅｒｌａｙ ｍｅｔｈｏｄ)
该方法的原理是将植物钙结合蛋白与放射性标
记４５Ｃａ２＋反应并进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳后ꎬ 利用放
射自显影直接检测凝胶上的标记强度ꎬ 就可以直接
检测出钙结合蛋白是否存在或与 Ｃａ２＋的结合强度ꎮ
１９８０ 年 Ｓｃｈｉｂｅｃｉ 等[３７] 最早利用 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 和
４５ＣａＣｌ２标记反应的方法在凝胶上检测植物组织中
的钙结合蛋白ꎮ １９８４ 年 Ａｎｔｈｏｎｙ ＆ Ｂａｂｉｔｃｈ[３８]发
现ꎬ 改进该方法后检测钙结合蛋白的灵敏度提高了
４０倍ꎬ 蛋白质的最少检测量为 ０􀆰５ μｇꎮ 随后ꎬ
Ｍａｒｕｙａｍａ等[１１]利用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 和４５ＣａＣｌ２标记
提出了检测植物钙结合蛋白与４５Ｃａ２＋在 ＰＶＤＦ 膜上
结合的方法ꎮ 目前ꎬ４５Ｃａ覆盖法已经在大规模分离
和鉴定植物钙结合蛋白中被广泛应用ꎮ
(３)全染色染料染色方法( ｓｔａｉｎｓ￣ａｌｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ)
该方法的原理是: 在非变性条件下ꎬ Ｓｔａｉｎｓ￣ａｌｌ
染料与蛋白质结合前对可见光的最大吸收峰约为
５２５ ｎｍ且呈显红色ꎻ 而与蛋白质结合形成复合体
后对可见光的最大吸收峰为 ６００ ｎｍ 且呈显蓝色ꎬ
因此可利用 ｓｔａｉｎｓ￣ａｌｌ 染料在与钙结合蛋白结合前
７６６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邹娟子等: 植物钙结合蛋白与钙离子结合鉴定技术的研究进展
后其可见吸收光谱的变化ꎬ 在体外非变性电泳条件
下利用全染色染料染色快速、 定性鉴定钙结合蛋
白ꎮ 该方法特别适用于鉴定与 Ｃａ２＋结合力较强的
含有 ２ ~ ６个 ＥＦ手结构域的钙结合蛋白ꎮ
１９８３年 Ｃａｍｐｂｅｌｌ 等[３９]最早利用全染色染料
建立了这种鉴定钙结合蛋白的简便方法ꎮ 利用 ２Ｄ￣
ＰＡＧＥ分离植物细胞膜、 细胞质或细胞器中的总蛋
白后ꎬ 在非变性条件下进行 Ｓｔａｉｎｓ￣ａｌｌ 染色就可以
快速检测植株细胞中 Ｃａ２＋结合能力强的含有多个
ＥＦ手结构域的钙结合蛋白ꎬ 因此该方法在植物钙
结合蛋白大规模鉴定中的应用潜力较大ꎬ 值得进一
步推广和应用ꎮ
(４)双向 －十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺电泳
法(２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ)
该方法的基本原理与 ＥＭＳＡ 类似ꎬ 主要是利
用钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合前后构象变化导致的电
泳迁移率 Ｒｆ发生变化特性ꎮ ２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 的实验
过程为: 先在第一向分离胶中加入 ＥＧＴＡ 进行电
泳ꎬ 然后切下小胶条带并利用平衡液处理ꎻ 再在第
二向分离胶中加入 ＣａＣｌ２进行电泳ꎬ 然后对凝胶采
用考马斯亮蓝(ＣＢＢ)染色或银染ꎬ 并观察不在对
角线上的蛋白质点谱带ꎬ 就可以获知植物组织中钙
结合蛋白情况ꎮ 因这些植物钙结合蛋白的构象在结
合 Ｃａ２＋前后发生了改变ꎬ 导致其在双向电泳中的
蛋白质点谱带不在电泳的对角线上ꎮ
１９９７年 Ｋａｍｅｓｈｉｔａ等[４０]最早提出了 ２Ｄ ＳＤＳ￣
ＰＡＧ鉴定植物钙结合蛋白的方法ꎬ 并测定了 ＣａＭ
在 ２Ｄ￣ＰＡＧＥ 中的迁移率变化ꎮ 从图 ３ 中可以看
出ꎬ 在 ＥＧＴＡ或 ＥＤＴＡ(ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａａｃｅ￣
ｔｉｃ ａｃｉｄ)处理下 ＣａＭ 的电泳迁移率没有改变ꎬ 但
经过 ＣａＣｌ２或 ＥＧＴＡ / ＥＤＴＡ先后处理后其电泳迁移
率发生了位移ꎮ ２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧ 的优点是先从植物
组织中分离总蛋白ꎬ 再利用其与 Ｃａ２＋的结合特性
鉴定植物钙结合蛋白ꎻ 此外ꎬ 该方法操作比较简
单、 易行ꎬ 且不需要特殊的仪器设备ꎮ 因此ꎬ ２Ｄ
ＳＤＳ￣ＰＡＧ是一种高通量快速分离和鉴定在不同生
长发育阶段和逆境处理条件下差异表达的植物钙结
合蛋白的好方法ꎬ 在植物逆境分子生物学领域将具
有很大的潜在应用价值ꎮ 目前ꎬ 作者所在课题组正
在从事这方面的相关研究ꎮ
４　 展望
Ｃａ２＋是植物中主要的第二信使之一ꎬ 钙信号
传导途径是植物生长发育和逆境信号传导的主要
途径之一ꎬ 对植物钙信号传导途径的解析主要依
赖于植物钙结合蛋白的分离和鉴定ꎮ 植物钙信号
蛋白基因家族较为复杂ꎬ 主要包括 ＣａＭ、 ＣＭＬ、
ＣＤＰＫ、 ＣＢＬ / ＣＩＰＫ等ꎬ 而且还可能包括含有 ＥＦ
手结构域的植物类受体蛋白激酶、 蛋白激酶、 磷
酸酶、 膜蛋白、 通道蛋白、 转录因子和酶蛋白ꎮ
因此ꎬ 利用生物化学和生物物理学方法鉴定植物
钙结合蛋白成为植物钙信号传导分子机制的主要
研究内容之一[１－３ꎬ７ꎬ８ꎬ１７ꎬ４０] ꎮ
本文综述了１０多种植物钙结合蛋白的测定技
A B CkD
66
45
36
29
20
14
２􀆰 ４ μｇ纯化 ＣａＭ在第一向和第二向介质均含有不同变性剂条件下进行 １２％ ２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 后考马斯亮蓝(ＣＢＢ)的
染色结果: (Ａ) 第一向和第二向介质均含有 ＥＧＴＡ / ＥＤＴＡꎻ (Ｂ)第一向介质含有 ＣａＣｌ２ꎬ 第二向介质含有 ＥＧＴＡ / ＥＤ￣
ＴＡꎻ (Ｃ)第一向介质含有 ＥＧＴＡ / ＥＤＴＡꎬ 第二向介质含有 ＣａＣｌ２ꎮ
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ２􀆰 ４ μｇ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥꎬ ｏｎ １２％ ｇｅｌｓ ｃｏｎｔａｉ￣
ｎｉｎｇ ＥＧＴＡ / ＥＤＴＡ ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ (Ａ)ꎬ ｏｎ ａ ｇｅｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣａＣｌ２ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ
ａ ｇｅｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＥＧＴＡ / ＥＤＴＡ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ (Ｂ)ꎬ ａｎｄ ｏｎ ａ ｇｅｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＥＧＴＡ / ＥＤＴＡ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｄｉ￣
ｍｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ａ ｇｅｌ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣａＣｌ２ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ (Ｃ) .
图 ３　 ２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ检测 ＣａＭ的电泳迁移率变化[４０]
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｂｙ ２Ｄ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ[４０]
８６６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷　
术和方法ꎬ 主要反映了钙结合蛋白与 Ｃａ２＋结合对
其蛋白质空间构象、 物理性质和化学性质的影响ꎮ
根据研究目的的不同ꎬ 可从定性结合、 定量检测和
结合方式等方面ꎬ 测定钙结合蛋白与 Ｃａ２＋的结合
情况ꎻ 还可将多种实验技术体系相结合检测植物钙
结合蛋白在体外和体内与 Ｃａ２＋结合后的生物物理
和生物化学的动态变化过程ꎮ
特别是在植物生长发育不同时期和不同组织中
先提取不同生物逆境或非生物逆境处理下植物组织
中的总蛋白ꎬ 再高通量测定植物钙结合候选蛋白
后ꎬ 进一步利用蛋白质组学和反向遗传学的方法鉴
定这些植物钙结合蛋白的生物学功能ꎬ 从而创建植
物钙信号传导的新途径和调控网络ꎮ 随着实验技术
体系的不断完善与成熟ꎬ 植物钙信号感应器蛋白结
构和功能的解析将会大大加速ꎬ 植物钙结合蛋白的
鉴定技术平台也将为植物钙信号传导的分子生物学
机制研究提供越来越多的技术支持ꎮ
参考文献:
[ １ ] 　 Ｈｅｐｌｅｒ ＰＫ. Ｃａｌｃｉｕｍ: ａ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００５ꎬ １７
(８): ２１４２－２１５５.
[ ２ ] 　 张和臣ꎬ 尹伟伦ꎬ 夏新莉. 非生物逆境胁迫下植物钙
信号转导的分子机制[Ｊ] . 植物学通报ꎬ ２００７ꎬ ２４
(１): １１４－１２２.
[ ３ ] 　 郑仲仲ꎬ 沈金秋ꎬ 潘伟槐ꎬ 潘建伟. 植物钙感受器及
其介导的逆境信号途径[Ｊ] . 遗传ꎬ ２０１３ꎬ ３５(７):
８７５－８８４.
[ ４ ] 　 周卫ꎬ 汪洪. 植物钙吸收、 转运及代谢的生理和分子
机制[Ｊ] . 植物学通报ꎬ ２００７ꎬ ２４(６): ７６２－７７８.
[ ５ ] 　 Ｈｉｒｓｃｈｉ ＫＤ. Ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｏｎｕｎｄｒｕｍ. Ｂｏｔｈ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ
ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｎａｌ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ
２００４ꎬ １３６(１): ２４３８－２４４２.
[ ６ ] 　 简令成ꎬ 王红. Ｃａ２＋在植物细胞对逆境反应和适应
中的调节作用 [ Ｊ] . 植物学通报ꎬ ２００８ꎬ ２５ (３):
２５５－２６７.
[ ７ ] 　 Ｖｏｇｅｌ ＨＪ. Ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ: Ｖｏｌ.
Ⅰ[Ｍ] . Ｔｏｔｏｗａꎬ Ｎ. Ｊ.: Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓꎬ ２００２ａ.
[ ８ ] 　 Ｖｏｇｅｌ ＨＪ. Ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ: Ｖｏｌ.
Ⅱ[Ｍ] . Ｔｏｔｏｗａꎬ Ｎ. Ｊ.: Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓꎬ ２００２ｂ.
[ ９ ] 　 Ｃｈｉｎｐｏｎｇｐａｎｉｃｈ ＡＩꎬ Ｗｕｔｉｐｒａｄｉｔｋｕｌ Ｎꎬ Ｔｈａｉｒａｔ Ｓꎬ
Ｂｕａｂｏｏｃｈａ Ｔ. Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ａｎｄ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅꎬ
Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈ Ｓｉｎꎬ ２０１１ꎬ
４３(１１): ８６７－８７６.
[１０] 　 Ｗａｎｇ ＴＺꎬ Ｚｈａｎｇ ＪＬꎬ Ｔｉａｎ ＱＹꎬ Ｚｈａｏ ＭＧꎬ Ｚｈａｎｇ
ＷＨ. Ａ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＥＦ￣ｈａｎｄ ｆａｍｉｌｙ ｇｅｎｅꎬ
ＭｔＣａＭＰ１ꎬ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｒｏｕｇｈｔ ａｎｄ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ] . ＰｌｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１３ꎬ ８(４): ｅ５８９５２.
[１１] 　 Ｍａｒｕｙａｍａ Ｋꎬ Ｍｉｋａｗａ Ｔꎬ Ｅｂａｓｈｉ Ｓ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ４５Ｃａ ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ
ｏｎ ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｆｔｅｒ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ
ｓｕｌｆａｔｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ[Ｊ] . Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ １９８４ꎬ
９５(２): ５１１－５１９.
[１２] 　 Ｆｒａｎｄｓｅｎ Ｇꎬ Ｍｕｌｌｅｒ￣Ｕｒｉ Ｆꎬ Ｎｉｅｌｓｅｎ Ｍꎬ Ｍｕｎｄｙ Ｊꎬ
Ｓｋｒｉｖｅｒ Ｋ. Ｎｏｖｅｌ ｐｌａｎｔ Ｃａ２＋￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｓｍｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓ[Ｊ] . Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍꎬ １９９６ꎬ ２７１(１): ３４３－３４８.
[１３] 　 Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓꎬ Ｋａｔａｇｉｒｉ Ｔꎬ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ￣Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋꎬ
Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｋ. Ａｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ
Ｃａ２＋￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄ
ｄｕｒｉｎｇ ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ ２０００ꎬ
４１(７): ８９８－９０３.
[１４] 　 Ｒｅｄｄｙ ＶＳꎬ Ｄａｙ ＩＳꎬ Ｔｈｏｍａｓ Ｔꎬ Ｒｅｄｄｙ ＡＳ. ＫＩＣꎬ ａ
ｎｏｖｅｌ Ｃａ２＋ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｏｎｅ ＥＦ￣ｈａｎｄ ｍｏｔｉｆꎬ
ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｍｏｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｒｅ￣
ｇｕｌａｔｅｓ ｔｒｉｃｈｏｍｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ
２００４ꎬ １６(１): １８５－２００.
[１５] 　 Ｔａｔｓｕｍｉ Ｒꎬ Ｓｈｉｍａｄａ Ｋꎬ Ｈａｔｔｏｒｉ Ａ. Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｑｕｉｎｏ￣
ｌｉｎｅ Ｃａ￣ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｑｕｉｎ２[Ｊ] . Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ １９９７ꎬ
２５４(１): １２６－１３１.
[１６] 　 Ｔａｋｅｚａｗａ Ｄ. Ａ ｒａｐｉｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｉｃｉｔｏｒｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｍＲＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＣＣＤ￣１ꎬ ａ １４ｋＤａ Ｃａ２＋￣ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｗｈｅａｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ
２０００ꎬ ４２(６): ８０７－８１７.
[１７] 　 Ｓｗａｎｓｏｎ ＳＪꎬ Ｃｈｏｉ ＷＧꎬ Ｃｈａｎｏｃａ Ａꎬ Ｇｉｌｒｏｙ Ｓ. Ｉｎ
ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｃａ２＋ꎬ ｐＨꎬ ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ [ Ｊ] .
Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌꎬ ２０１１ꎬ ６２(１): ２７３－２９７.
[１８] 　 Ｊａｒｅｓ￣Ｅｒｉｊｍａｎ ＥＡꎬ Ｊｏｖｉｎ ＴＭ. ＦＲＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ [ Ｊ] .
Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌꎬ ２００３ꎬ ２１(１１): １３８７－１３９５.
[１９] 　 Ｄａｕｐｈｉｎ Ａꎬ Ｇｅｒａｒｄ Ｊꎬ Ｌａｐｅｙｒｉｅ Ｆꎬ Ｌｅｇｕｅ Ｖ. Ｆｕｎ￣
ｇａｌ ｈｙｐａｐｈｏｒｉｎｅ ｒｅｄｕｃｅｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｙ￣
ｔｏｓｏｌｉｃ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｒｏｏｔ ｈａｉｒｓ ｏｆ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｇｌｏｂｕｌｕｓ[ Ｊ] . Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａꎬ ２００７ꎬ ２３１ ( １ － ２):
８３－８８.
[２０] 　 Ｍｉｃｈａｒｄ Ｅꎬ Ａｌｖｅｓ Ｆꎬ Ｆｅｉｊｏ ＪＡ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｏｎ ｆｌｕ￣
ｘｅｓ ｉｎ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ:
ｔｈｅ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅ ａｓ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｒａｄｉｇｍ[Ｊ] .
９６６　 第 ６期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邹娟子等: 植物钙结合蛋白与钙离子结合鉴定技术的研究进展
Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌꎬ ２００９ꎬ ５３(８－１０): １６０９－１６２２.
[２１] 　 Ｂｉｂｉｋｏｖａ ＴＮꎬ Ｊａｃｏｂ Ｔꎬ Ｄａｈｓｅ Ｉꎬ Ｇｉｌｒｏｙ Ｓ. Ｌｏｃａ￣
ｌｉｚｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａｐｏｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐＨ
ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｏｏｔ ｈａｉｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ａｒａｂｉ￣
ｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ [ Ｊ ] . Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ １９９８ꎬ １２５
(１５): ２９２５－２９３４.
[２２] 　 Ａｌｌｅｎ ＧＪꎬ Ｃｈｕ ＳＰꎬ Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ＣＬꎬ Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ
Ｋꎬ Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｔꎬ Ｔａｎｇ ＹＹꎬ Ｇｒｉｌｌ Ｅꎬ Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＩ. Ａ
ｄｅｆｉｎｅｄ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｐａ￣
ｒａｍｅｔｅｒｓ ｅｎｃｏｄｅｓ ｓｔｏｍａｔａｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ [ Ｊ] . Ｎａ￣
ｔｕｒｅꎬ ２００１ꎬ ４１１(６８４１): １０５３－１０５７.
[２３] 　 Ａｓｈｔａｍｋｅｒ Ｃꎬ Ｋｉｓｓ Ｖꎬ Ｓａｇｉ Ｍꎬ Ｄａｖｙｄｏｖ Ｏꎬ Ｆｌｕｈｒ
Ｒ. Ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｒｙｐｔｏｇｅｉｎ ｉｎ￣
ｄｕｃｅｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｏ￣
ｂａｃｃｏ Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ￣２ ｃｅｌｌｓ [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌꎬ
２００７ꎬ １４３(４): １８１７－１８２６.
[２４] 　 Ｍｉｅｓｅｎｂｏｃｋ Ｇꎬ Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓ ＤＡꎬ Ｒｏｔｈｍａｎ ＪＥ. Ｖｉ￣
ｓｕａｌｉｚｉｎｇ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｐＨ￣ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ [ Ｊ] . Ｎａ￣
ｔｕｒｅꎬ １９９８ꎬ ３９４(６６８９): １９２－１９５.
[２５] 　 Ｂｉ ＹＨꎬ Ｃｈｅｎ ＷＬꎬ Ｚｈａｎｇ ＷＮꎬ Ｚｈｏｕ Ｑꎬ Ｙｕｎ ＬＪꎬ
Ｘｉｎｇ Ｄ. Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｉｍ￣
ｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃ
ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｒｅ ｅａｒｌｙ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｃａｄ￣
ｍｉｕｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
[Ｊ] . Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌꎬ ２００９ꎬ １０１(１１): ６２９－６４３.
[２６] 　 Ｈｏｒｉｋａｗａ Ｋꎬ Ｙａｍａｄａ Ｙꎬ Ｍａｔｓｕｄａ Ｔꎬ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ
Ｋꎬ Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｍꎬ Ｍａｔｓｕ￣ｕｒａ Ｔꎬ Ｍｉｙａｗａｋｉ Ａꎬ
Ｍｉｃｈｉｋａｗａ Ｔꎬ Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ Ｋꎬ Ｎａｇａｉ Ｔ. Ｓｐｏｎｔａｎｅ￣
ｏｕｓ ｎｅｔｗｏｒｋ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
Ｃａ２＋ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓꎬ ｙｅｌｌｏｗ Ｃａｍｅｌｅｏｎ￣Ｎａｎｏ [ Ｊ] . Ｎａｔ
Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２０１０ꎬ ７(９): ７２９－７３２.
[２７] 　 肖凤娟ꎬ 常虹ꎬ 刘德龙. 离子电极电位滴定法研究钙
与钙调素结合平衡及其应用[ Ｊ] . 分析测试学报ꎬ
２００４ꎬ ２３(４): ４６－４８.
[２８] 　 Ｙｕａｓａ Ｋꎬ Ｍａｅｓｈｉｍａ Ｍ. Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅａｓ￣
ｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａ２＋￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍ￣
ｂｉｎａｎｔ ｒａｄｉｓｈ ｖａｃｕｏｌａｒ Ｃａ２＋￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ[Ｊ] . Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ ２００２ꎬ ６６(１１): ２３８２－２３８７.
[２９] 　 Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍꎬ Ｍｉｎｏｗａ Ｏꎬ Ｙａｇｉ Ｋ. Ｄｉｖａｌｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ[Ｊ] . Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ
１９８３ꎬ ９４(６): １９２５－１９３３.
[３０] 　 Ｄｏｂｎｅｙ Ｓꎬ Ｃｈｉａｓｓｏｎ Ｄꎬ Ｌａｍ Ｐꎬ Ｓｍｉｔｈ ＳＰꎬ Ｓｎｅｄ￣
ｄｅｎ ＷＡ. Ｔｈｅ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｅｎｓｏｒ
ＣＭＬ４２ ｐｌａｙｓ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｒｉｃｈｏｍｅ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ[ Ｊ] . Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍꎬ ２００９ꎬ ２８４(４６): ３１６４７－３１６５７.
[３１] 　 Ｊｏｈｎｓｏｎ ＣＭ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ａｓ ａ
ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ[Ｊ] . Ａｒｃｈ Ｂｉｏ￣
ｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓꎬ ２０１３ꎬ ５３１(１－２): １００－１０９.
[３２] 　 Ｙａｍｎｉｕｋ ＡＰꎬ Ｉｓｈｉｄａ Ｈꎬ Ｌｉｐｐｅｒｔ Ｄꎬ Ｖｏｇｅｌ ＨＪ. Ｔｈｅｒ￣
ｍｏｄｙｎａｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｎｏｎｃｏｄｅｄ ａｎｄ ｃｏｄｅｄ ｍｅｔｈｉｏ￣
ｎｉｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ [ Ｊ] . Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊꎬ
２００９ꎬ ９６(４): １４９５－１５０７.
[３３] 　 Ｊａｍｓｈｉｄｉｈａ Ｍꎬ Ｉｓｈｉｄａ Ｈꎬ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｃꎬ Ｇｉｆｆｏｒｄ
ＪＬꎬ Ｗａｌｓｈ ＭＰꎬ Ｖｏｇｅｌ ＨＪ. Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ
ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｖａｒｉａｎｔ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ: ｔｈｅ Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｘｔｅｎ￣
ｓｉｏｎ ｏｆ ＯｓＣａＭ６１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ
ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ [ Ｊ] . Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍꎬ
２０１３ꎬ ２８８(４４): ３２０３６－３２０４９.
[３４] 　 Ｇｉｆｆｏｒｄ ＪＬꎬ Ｊａｍｓｈｉｄｉｈａ Ｍꎬ Ｍｏ Ｊꎬ Ｉｓｈｉｄａ Ｈꎬ Ｖｏｇｅｌ
ＨＪ. Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ
ｓｏｙｂｅａｎ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｓ: ｔｏｗａｒｄｓ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ
ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎｓ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌꎬ ２０１３ꎬ ２５(１１): ４５１２－４５２４.
[３５] 　 Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ Ｌｉｕ ＢＦꎬ Ｌｉａｎｇ Ｓꎬ Ｊｏｎｅｓ ＲＬꎬ Ｌｕ ＹＴ. Ｍｏ￣
ｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｌｃｉ￣
ｕｍ / ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｒｉｃｅ
[Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊꎬ ２００２ꎬ ３６８(１): １４５－１５７.
[３６] 　 Ｚｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚ Ｋꎬ Ｚｉｅｎｋｉｅｗｉｃｚ Ａꎬ Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ￣Ｇａｒｃｉａ
ＭＩꎬ Ｃａｓｔｒｏ ＡＪ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃａｌｅｏｓｉｎ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｏｌｉｖｅ (Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ Ｌ.) ｐｏｌｌｅｎ
ｏｎｔｏｇｅｎｙ[ Ｊ] . ＢＭＣ ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌꎬ ２０１１ꎬ １１: １２２ －
１３６.
[３７] 　 Ｓｃｈｉｂｅｃｉ Ａꎬ Ｍａｒｔｏｎｏｓｉ Ａ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ２＋￣ｂｉｎ￣
ｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｂｙ ４５Ｃａ ａｕ￣
ｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ[Ｊ] . Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ１９８０ꎬ １０４(２):
３３５－３４２.
[３８] 　 Ａｎｔｈｏｎｙ ＦＡꎬ Ｂａｂｉｔｃｈ ＪＡ. Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｃａｌｃｉｕｍ￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ
[Ｊ] . Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ １９８４ꎬ １２(１): ７９－８９.
[３９] 　 Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＰꎬ ＭａｃＬｅｎｎａｎ ＤＨꎬ Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ＡＯ.
Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａ２＋￣ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓꎬ ｃａｌｓｅｑｕｅｓ￣
ｔｒｉｎꎬ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎꎬ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｃꎬ ａｎｄ Ｓ－１００ꎬ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ “Ｓｔａｉｎｓ￣ａｌｌ” [Ｊ] . Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍꎬ １９８３ꎬ ２５８(１８): １１２６７－１１２７３.
[４０] 　 Ｋａｍｅｓｈｉｔａ Ｉꎬ Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｈ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｗｏ￣ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅ￣
ｃｙｌ ｄｕｌｆａｔｅ￣ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ[Ｊ] .
Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍꎬ １９９７ꎬ ２４９(２): ２５２－２５５.
(责任编辑: 刘艳玲)
０７６ 植 物 科 学 学 报 第 ３２卷