全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(6)：619～623
Journa／of Wuhan Botanical Research
太白红杉 FISH-AFLP体系的建立
张传军，肖娅萍 ，王孝安
(陕西师范大学生命科学学院，西安 710062)
摘 要：分别以太白红杉的胚乳、干叶和鲜叶为材料，通过改良的CTAB法提取总DNA，经酶切连接、PCR预扩增、
PCR选择性扩增、凝胶电泳等程序，建立了太白红杉的FISH．AFLP分子标记体系。结果显示：引物E．ACG／M．CAC
和E-ACG／M—CAA在28份材料中扩增总带数分别为1856和2013条；以胚乳和鲜叶为材料，可以得到稳定、丰富的
扩增带。FISH-AFLP体系的建立为进一步分析太白红杉的遗传多样性奠定了基础。
关键词：太白红杉；遗传多样性；FISH．AFLP
中图分类号：Q75；Q94—336 文献标识码 ：A 文章编号：1000．470X(2007)06．0619．05
Establishment of FISH-AFLP System in Lar／x chinensis
ZHANG Chuan—Jun，XIAO Ya-Ping’，WANG Xiao—An
(co豇 of Sciences，Shaa i Normal University，Xi’81 710062，China)
Abstract：The endosperm．dry leaves and fresh leaves of Larix chinensis were used as materials．By
extracting DNA wit}I a／l improved method of CTAB．digesting DNA with Mse I and EcoR I．pre—selective
amplifcation．selective amplification．PAGE．FISH．AFLP technical system to detect genetic diversity in L．
chinensis was established successfuⅡv．W itl primer combinations E．ACG／M—CAC and E—ACG／M．CAA．
1856 an d 2013 AFLP fragments were detected in during 28 individuals．Stable and abundant ban ds can be
obtained wit}I t}Ie materials of endosperms and fresh leaves．The techniques could be applied in t}Ie further
an alysis of genetic diversity in L chinensis．
Key words：Larix chinensis：Genetic diversity：FISH．AnJI
太白红杉( chinensis Beissn．)也称太白落
叶松，为松科(Pinaceae)落叶松属( )红杉组植
物 J。太白红杉是我国特有种，仅分布在陕西秦岭
山地海拔2600 m到3500 m的区域内 J，被列为国
家二级珍稀濒危保护植物。太白红杉是秦岭山地森
林最上线的落叶乔木针叶林树种，是秦岭生态系统
的重要组成成分。在物种保存、科学研究、生态效益
等方面，具有重要的研究和保护价值。
尽管目前已经用同功酶、SSR、RAPD 等技
术对太白红杉的遗传多样性进行了研究，但是还存
在一些问题：由于研究手段的局限性及居群材料的
不同，其结果也不一致，如多态位点的比率、居群多
样性排序、聚类结果等相差较大；对作为太白红杉主
要分布地的太白山居群研究还不深入；太白红杉随
海拔的变化在形态学上发生了显著的变化，是否因
海拔生态系统的改变也导致了其居群间 DNA的变
化，这些问题都有待进一步的解决。
扩增片段长度多态性(amplifed fragment length
polymorphism，AFLP)是 1993年 由荷 兰 的 Zabeau
Marc和Vos Picter发展起来的新一代分子标记技
术 引。AFLP无需预先知道 DNA的序列，并且处
理的样品多，检测信息量大，灵敏度高，易于操作，实
验结果稳定可靠-9 J。AF【JP技术已经广泛应用于基
因追踪、基因分离、品种鉴定、QTL分析、杂种优势预
测、分子标记辅助选择育种和生物多样性等方面的
研究 。
我们分别以太白红杉胚乳和叶为材料，用
FISH—AFLP方法，通过对 DNA提取、酶切连接、预扩
增、选择性扩增等体系的优化，成功建立了太白红杉
AFLP反应体系，并对数据进行分析，为进一步从分
子生态学的角度分析太白红杉遗传多样性，揭示太
白红杉的遗传基础和分化机制奠定了基础。
收稿日期：2OO7-04-23，修回日期：2007—08-29。
基金项 目：国家自然科学基金资助项 目(30470324)。
作者简介：张传军(1979一)，男，陕西师范大学在读硕士，主要从事植物生物技术方面的研究。
+ 通讯作者(E-mail：yapingxiao@8nnu．edu．ca)o
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620 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验材料为采自陕西秦岭太白山居群的太白红
杉( chinensis Beissn．)。采样时各个体间距大
于50 m，分别取胚乳和叶。
胚乳：将种子温水浸泡过夜，无菌水冲洗3次。
在体视显微镜下用解剖刀去掉胚，取得胚乳。 。
干叶：采集新鲜幼嫩针叶，用吸水纸吸水直到
干燥。
鲜叶：采集新鲜幼嫩针叶放到塑料袋中，迅速带
回实验室置于 一80~C冰箱中备用。
1．2 实验仪器
台式离心机 DGL一16，UV-254暗箱式紫外透射
仪，DG一3D水平电泳槽，DG一11双稳数显电泳仪，
GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer，USA)，
Sigma 3K18型低温冷冻离心机(Sigma，USA)，ABI
PRISM 377 sequencer测序仪。
1．3 药品与试剂
AFLP核心试剂 (北京鼎 国生物技术有 限公
司提供)~．EcoRI(4 U／p．L)，Mse1(4 U／ L)，Taq酶
(2 U／ L)，T4 DNA Ligase(3 U／ L)，接头及扩增
引物见表 1。
表 1 接头、预扩增引物及选择性扩增引物
Table 1 Sequence of adapters，pre—amplificafion primers and
second amplifcation primers
名称
N8xne
核心序列
Core 8e( etIce
内切酶
位点特
异序列
ENZ
选择性
核苷酸
序列
ExT“
Rl 5-cTC
—
GTA GAC TGc GTA CC TTAA
-5adapter 3 CAT CTG ACG CAT GG ’
一
Mse I 5’一GAC GAT GAG TCC TGA G-3’ ⋯ ，
adapter 3’一TA CTC AGG ACA C ⋯
E00 5’一GAC TGC GTA CC A ArI’I’C A_3’
MOO 5’一GAT GAG TCC TGA G TA A C-3’
E1 5’一GAC TGC GTA CC A ArI’I’C AC G-3’
E2 5’一GAC TGC GTA CC A ArI’I’C AC G-3’
M1 5’一GATGAGTCC rGA G TA A CA C_3’
M2 5’一GAT GAG TCC TGA G TA A CA A-3’
· Enzyme specific sequence；++ Selective extension$cqUerlCe．
其中，EO0为 R I预扩增引物，MOO为 Mse I
预扩增引物；E1、E2为 R I选择性扩增引物，M1、
M2为 Mse I选择性扩增引物，并且 M1、M2为用
6-FAM(6-earboxy fluorescein)标记的荧光标记引物。
1．4 总 DNA的提取
称取材料0．05 g，液氮研磨至粉末后转移到2 mL
装 有 800 ILL 2×CTAB(eetyltrimethyl ammonium
bromide)提取缓冲液的离心管中；加入6O 巯基
乙醇混匀，6O℃预热 30 min，其问混匀 2～3次。取
出样品于室温放置，待冷却到室温加入 800 ILL氯
仿 ：异戊醇 (24：1)，振荡混匀；12 000 r／min离心
15 min；取上清加入 1．5倍体积的 1×CTAB沉淀
液；静置 2O～30 min，12 000 r／min离心 15 min；弃上
清，沉淀晾干溶解于 200 ILL TE—bufer；加入400 L
95％乙醇，2O ILL 3 mol／L NaAC，一2O℃沉淀 1 h；
12 000 r／min离心 15 min；500 ILL 75％乙醇清洗管
壁及沉淀，12 000 r／min离心 10 min；加入3O～5O L
TE—bufer；0．8％琼脂糖电泳检测。
1．5 酶切连接
限 制性酶切及连接体 系(2O L反应体系 )
0．5 mL离心管中分别加入：4 L模板 DNA(50 ng／
L)，1 ILL Adapter，2 ILL EcoR I／Mse I，2．5 IL
10×Reaction bufer，2．5 ILL 10 mmol／L ATP，1 IxL
T4 DNA Ligase，7 ILL AFLP—H2O。
酶切连接流程 混匀离心 10 s，PCR仪中37℃
保温5 h，8~C保温 4 h，4~C过夜。产物 4~C下短期
保存。
1．6 预扩增
预扩增反应体系(25 L反应体系) 0．2 mL
离心管中分别加入：2 IL 酶切连接模板 DNA，1 ILL
Pre—ampmix，0．5 ILL dNTPs，2．5 ILL 10×PCR bufer，
0．5 ILL Taq DNA Polymerase，18．5 ILL AFLP—H2O。
预扩增流程 混匀离心 10 s，按下列参数进行
PCR：94~C预变性2 min；94~C变性30 s，56~C复性
30 s，72~C延伸 80 s，30个循环；72~C延伸 5 min。产
物可以4~C短期保存。1．2％琼脂糖电泳检测。
1．7 选择性扩增
将预扩增产物用 AFLP—TE以 1：20的比例稀
释，作为选择性扩增的模板。
选择性扩增体系(25 L反应体系) 0．2 mL
离心管中分别加入：2 IxL选择性扩增模板 DNA，
2．5 ILL 10×PCR bufer，0．5 ILL dNTPS，1 ILL EcoR I
引物，1 ILL Mse I引物，0．5 ILL Taq DNA Polymerase，
17．5 ILL AFLP—H2O。
选择性扩增流程 混匀离心 10 s，按下列参数
进行 PCR：94~C预变性2 min；94~C变性 30 s，65~C
复陛30 s，72~C延伸80 s，1个循环；94~C变性 30 s，
65~C复性30 s(每个循环温度递减0．7cI=)，72~C延
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第6期 张传军等：太白红杉FISH．AFLP体系的建立 621
伸 80 s，14个循环；94℃变性 30 s，55℃复性 30 s，
72~C延伸8O s，23个循环。产物可以4℃短期保存。
1．8 聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳图谱由自动测序仪377扫描得到。电泳体
系为：4％变性聚丙烯酰胺凝胶制备好后 90 min即
可使用，也可以过夜(用保鲜膜封闭好)；电泳缓冲
液为1×TBE(Tris一硼酸缓冲液)(每次电泳上槽中
的缓冲液需要重新更换)；O．5 mL的离心管中加入
2 L上样 bufer，2 L选择性扩增产物，混合均匀，
PCR仪中95℃变性2 min，拿出后立即放到冰盒中
用于检测。
1．9 数据获得
通过添加内标(70—500 bp，间隔测试单位大小
为2 bp)，用 Binthere软件提取样品的各片段生成表
格，将表内的数值不为 0转换为 1(数值为“0”表示
没有条带，数值“1”表示有条带)，从而生成由“l”和
“0”组成的原始矩阵。
2 结果与分析
2．1 基因组DNA琼脂糖电泳检测
本试验用 CTAB法分别从太白红杉胚乳、干叶
和鲜叶中提取了基因组总 DNA。0．8％琼脂糖电泳
检测结果见图 1。
■一 一■
1～8。11～20．胚乳 ；9，10．干叶；21～30．鲜叶
1—8，11—20．Endosperm；9，10．Dry leaves；21—30．Fresh leaves
圈 1 DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果
Fig．1 The result of DNA agarose gel electrophoresis
从图 1可以看到，除 9、10号样的条带极弱，其
余样品在 21227 bp和5148 bp之间均有清晰的条
带。为排除人为因素及实验操作造成的 9、1O号样
DNA提取率低的可能性，重新提取了两次 9、10号
样。结果如图 1右下角所示，仍仅有极微弱的条带。
说明吸水纸干燥处理太白红杉针叶以保存 DNA的
方法不可行。
2．2 预扩增产物琼脂糖电泳检测
在 AFLP预扩增中选择了引物 E00／M00，其仅
含一个选择碱基，因此预扩增的选择性较低，条带应
呈现弥散型分布。1．2％琼脂糖凝胶电泳检测结果
见图 2。
1，3，5，7，11，13，15，19．胚乳；21，24，27，30．鲜叶
1，3，5，7，11，13，15，19．Endosperm；21，24，27，30．Freshleaves
图 2 太白红杉部分样品预扩增产物检测
Fig．2 The partial pre-amplifcation products of
Lar／x chinertsis
图2显示，预扩增片断多分布在 100—1000 bp
之间。说明预扩增的效果较好，能为选择性扩增提
供理想的模板，同时也证明了前面的DNA的提取、
酶切连接符合试验技术的要求。
2．3 选择性扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳
检测
本试验初步筛选的两个选择性引物为 E—ACG／
M—CAC；E—ACG／M—CAA。4％变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳胶片，经自动测序仪 377扫描，其结果见图3。
图3显示，除9、10号样外，其余样品无论是胚
乳还是新鲜的叶子，其选择性扩增产物的检测结果
显示电泳条带清晰、分辨率较高，重复实验证明具有
很高重复性和稳定性。9、10号样的选择性扩增产
物只在分子量较低的区域有少量的条带，分子量高
的区域极少。进一步说明其 DNA降解严重，不可作
为分子标记的材料。造成扩增产物少的原因可能是
吸水纸除水的速度较慢，在干燥的过程中 DNA遭到
降解。
2．4 扩增带分布分析
在28份供试验材料(9，10除外)中，引物 E—
ACG／M—CAC(El／M1)、E-ACG／M—CAA(E2／M2)扩
增的总条带分别为 1856和 2013条。图4显示，不
同供实验材料，以El／M1为引物扩增条带数变化较
大，平均扩增带为66条，其中26号材料条带最多为
l16条，而最少的 14号材料仅 17条；而引物 E2／M2
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武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
2 3 4 5 6 7 8 910 II1213141516 1718192021222324252627282930 I 2 3 4 5 6 1 8 9 10II12131415161718192021 222324252627
E-ACG／M -CAA E．ACG／M ．CAC
1—8，11—20．胚乳；9，10．干叶；21—30．鲜叶
1—8，11—20．Endosperm；9，10．D时 leaves；21—30．Fresh leaves
图 3 太白红杉选择性扩增产物检测
Fig．3 The selective amplification products of L chinensis
的扩增条带数变化相对较小，最多的为 18号植株有
100条，最少的为25号有 36条，平均为 72条。
1
童
血 主
器呈
螓 曼
不同植株
Thediferent Larix chinensis
1—8，11～20．胚乳；21～30．鲜叶
1—8，11-20．Endosperm；21—30．Fresh leaves
图 4 供试植株扩增带数目
Fig．4 The number8 of selective amplifcation
products of diferent L chinensis
以16 bp为单位(8个测试单位)作图5。图5
显示，随着分子量的递增，扩增带数目显著减少。条
带多集中于分子量 262 bp以下。在 70～212 bp、
214～356bp、358～500bp之间，E-ACG／M·CAC弓f
螓雪
扩增带的大小
The size amplified fragments
图 5 不同大小选择性扩增带分布
Fig．5 Th e diferent size amplifed fragments
物条带数分别为 1256条、474条、126条，E—ACG／M—
CAA条带数为 1171条、576条、266条，变化显著。
3 讨论
AFLP试验技术步骤繁多，需经总 DNA提取、酶
切连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳等一系列的步骤，任何的不当操作都会直接影
响实验的结果。
首先，提取高质量的DNA是分子生物学实验成
功的前提¨¨ 。高质量的DNA，既要求 DNA分子具
备完整性，又要符合严格的纯度要求。若 DNA断
裂，酶切片断的结果显然不能代表真实的 DNA结
构，指纹图谱的可靠性就会降低甚至完全不能反映
真实的情况。因此 ，既要保证供试材料 DNA没有降
解，又要在提取实验过程中轻拿轻放，避免剧烈振荡
而造成的 DNA断裂l1引。松科植物体本身就富含多
糖、酚、萜、酯等多种次生代谢物，且由于太白红杉生
长在高海拔地区，环境恶劣，生长速度极其缓慢，体
内聚集了较其他松科植物更多的次生代谢物质。在
破碎细胞提取DNA时，次生代谢物如酚类会在酚类
氧化酶的作用下生成有色的醌类物质，降低 DNA的
提取质量。因此 DNA纯度在本实验中显得尤为重
要。实验中通过在提取缓冲液、沉淀液中加大巯基
乙醇的量等措施降低酚类等的干扰 ，此外，作为强还
原剂的巯基乙醇还可以抑制核酸水解酶的作用，在
一 定程度上防止了DNA的降解。
裸子植物的胚乳DNA为单倍体，可作为分子生
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第6期 张传军等：太白红杉FISH—AFLP体系的建立
物学研究的材料 。本试验用改良的 CTAB法不
仅成功提取了太白红杉鲜叶中的 DNA，还以相同方
法提取了胚乳的DNA，且选择性扩增结果证明条带
稳定、清晰且丰富，完全符合 AFLP试验及分析的要
求。太白红杉的种子较新鲜的叶子更利于携带与保
存，处理也较为方便，所以以胚乳为材料对太白红杉
进行分子遗传学的研究具有重要的意义。但实验结
果显示 ，胚乳和叶子之间存在显著不同，应该将胚乳
和叶子区别对待。
其次，AFLP结果的准确性主要取决于 DNA酶
切的彻底性和接头连接的充分性 。模板 DNA的
量对 AFLP的影 响不 很敏感，但 总量应控 制在
200 ng左右。DNA量太少时，条带很弱或显不出
来 ；DNA量太多，酶切不易充分，容易出现拖尾的现
象，扩增带型模糊难辨。酶切的效果和接头与酶切
片段连接率都与反应时间的长短密不可分。处理时
间过短，酶切不彻底，接头与酶切片段连接不充分，
会造成预扩增片断的缺失而导致实验失败。本试验
采用酶切连接一步进行，采用 PCR仪中37~C保温
5 h、8℃保温 4 h、4~C过夜的步骤，反应在夜间完成。
这不仅可以节省时间，提高仪器的使用效率，更重要
的是充足的反应时间保证了酶切的彻底性和提高了
连接率，使实验结果更为准确。
实验显示 ，变性聚丙烯酰胺电泳的胶板质量直
接关系到最终电泳指纹图谱的好坏。制胶用的玻璃
板如果不洁净，就会影响谱带的计数。制胶时为保
持胶板的洁净，所使用的各种器材及工具都需要认
真清洗，如刚刚用完的制胶玻璃板应先用盐酸水溶
液浸泡，再用热水冲洗干净。胶片中的气泡会改变
指纹图谱结构，影响实验结果，制胶时应一次性灌
完，并边灌边拍打制胶板，以防止产生气泡。
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