全 文 ：植物科学学报　 ２０１３ꎬ ３１(５): ４９３~ ４９９
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０.３７２４ / ＳＰ.Ｊ.１１４２.２０１３.５０４９３
花苜蓿抗旱耐盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记筛选
刘 洁１ꎬ２ꎬ 胡 蝶１ꎬ２ꎬ 楚海家１ꎬ 闫 娟１∗ꎬ 李建强１∗
(１. 中国科学院武汉植物园ꎬ 中国科学院特色农业重点实验室ꎬ 武汉 ４３００７４ꎻ ２. 中国科学院大学ꎬ 北京 １０００４９ )
摘　 要: 为了给花苜蓿(Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ Ｔｒａｕｔｖ.)抗旱耐盐的生态适应性研究提供特异的遗传标记ꎬ 在已公
布的 ７０对鹰嘴豆抗旱耐盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记中筛选出稳定性好、 多态性高的 ８ 对引物ꎬ 并用这 ８ 对引物对挑选出
的 １１个居群的 ２８６ 个个体进行扩增ꎬ 获得 １１１ 个等位基因ꎮ 平均等位基因数为 １３􀆰 ８８ꎻ 平均观察杂合度为
０􀆰 ４９７ꎻ 平均预期杂合度为 ０􀆰 ６８７ꎻ 多态信息含量从 ０􀆰 ３１３到 ０􀆰 ８８３不等ꎬ 平均值为 ０􀆰 ６４９ꎮ 以上结果表明ꎬ 筛
选出来的 ８个 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记可以用于花苜蓿的遗传多样性分析ꎬ 而且遗传多样性处于较高水平ꎮ 多态性丰富的
ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物适用于花苜蓿生态适应性进化分析ꎬ 对揭示花苜蓿抗旱耐盐基因型的遗传变异和地理分布格局以
及探讨花苜蓿抗旱耐盐的适应性分化机制有重要意义ꎮ
关键词: 花苜蓿ꎻ ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记ꎻ 抗旱耐盐ꎻ 引物筛选
中图分类号: Ｑ３４６＋􀆰 ７　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣ ０８３７(２０１３)０５￣ ０４９３￣ ０７
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｏｕｇｈｔ￣ ａｎｄ Ｓａｌｉｎｉｔｙ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＥＳＴ￣ＳＳＲ
Ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ Ｔｒａｕｔｖ.
ＬＩＵ Ｊｉｅ１ꎬ２ꎬ ＨＵ Ｄｉｅ１ꎬ２ꎬ ＣＨＵ Ｈａｉ￣Ｊｉａ１ꎬ ＹＡＮ Ｊｕａｎ１∗ꎬ ＬＩ Ｊｉａｎ￣Ｑｉａｎｇ１∗
(１􀆰 Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｗｕｈａｎ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２􀆰 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ
ｄｒｏｕｇｈｔ￣ ａｎｄ ｓａｌｉｎｉｔｙ￣ｓｔｒｅｓｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ Ｔｒａｕｔｖ.ꎬ ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｅｉｇｈｔ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｇｏｏｄ
ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ７０ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｄｒｏｕｇｈｔ￣ａｎｄ ｓａｌｉｎｉｔｙ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＥＳＴ￣
ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ ｃｈｉｃｋｐｅａ. ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｅｉｇｈｔ ｐａｉｒｓ ｏｆ ＳＳＲ
ｐｒｉｍｅｒｓ ｂｙ ＳＳＲ￣ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ. Ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｅｌｅｖｅｎ ａｌｌｅｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄꎬ ｏｎ ａｖｅｒａｇｅꎬ
１３􀆰 ８８ ａｌｌｅｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｅｒ ｓｉｔｅ. Ｔｈｅ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ａｎｄ
ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ０􀆰 ４９７ ａｎｄ ０􀆰 ６８７ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｖａｌｕｅ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ０􀆰 ３１３ ｔｏ ０􀆰 ８８３ꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ ｗａｓ ０􀆰 ６４９. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ
ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍ.
ｒｕｔｈｅｎｉｃａꎬ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ａｔ ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ. Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｃａｎ ｂｅ
ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔｉｖｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈｅ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｏｕｇｈｔ￣ ａｎｄ ｓａｌｔ￣ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｍ. ｒｕｔｈｅｎｉｃａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ ꎻ Ｄｒｏｕｇｈｔ￣ ａｎｄ ｓａｌｉｎｉｔｙ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅꎻ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｐｒｉｍｅｒ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
　 　 　 收稿日期: ２０１３￣０３￣１１ꎬ 修回日期: ２０１３￣０８￣１３ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金青年科学基金项目(３１０００１４７)ꎮ
　 作者简介: 刘洁(１９８８－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为系统与进化植物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｓｕｎｓｈｉｎｅ３２３１＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｊｃａｓ＠ ｈｏｔｍａｉｌ􀆰 ｃｏｍꎻ ｌｉｊｑ＠ｗｂｇｃａｓ􀆰 ｃｎ)ꎮ
　 　 干旱和盐碱化是人类面临的世界性问题ꎬ 也是
制约作物和牧草产量的两个主要的环境因子ꎮ 据统
计ꎬ 干旱导致的减产已超过因其它因素所造成减产
的总和[１]ꎮ 据世界粮农组织和教科文组织的统计ꎬ
全球有盐渍土壤约 ９􀆰 ５亿 ｈｍ２ꎬ 占全球土地面积的
１０％ꎬ 广泛分布于 １００ 多个国家和地区ꎮ 在我国ꎬ
干旱半干旱地区占国土面积的 ４７％ꎬ 占总耕地面积
的 ５１％[２]ꎻ 特别在我国西北干旱半干旱地区ꎬ 随着
水资源的日益短缺ꎬ 干旱和土壤盐碱化已成为该地
区农牧业发展和生态环境的严重威胁ꎮ 据第二次土
壤普查统计ꎬ 我国盐渍土壤面积为 ３５００万 ｈｍ２ꎬ 其
中已开垦种植的盐渍土壤面积为 ５７７万 ｈｍ２ꎬ 尚有
１７００万 ｈｍ２左右的潜在盐渍化土壤[３]ꎮ ３１􀆰 １％的现
有耕地受到盐碱危害ꎬ 严重影响作物的产量和品
质ꎮ 特别在我国的干旱半干旱地区ꎬ 随着水资源
的日益短缺ꎬ 土壤干旱和盐碱化已成为该地区的
农业发展和生态环境的严重威胁ꎮ 因此ꎬ 在综合
改良土地干旱、 盐渍化问题的同时ꎬ 需要筛选和
培育抗旱耐盐碱高产品种ꎬ 使这些土地得到合理
利用ꎮ
花苜蓿(Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ Ｔｒａｕｔｖ.)是越年
生、 异交的草本植物ꎬ 具有抗旱、 耐寒、 耐盐碱、
耐瘠薄等特点ꎬ 产草量高ꎬ 适口性好ꎬ 是一种营养
价值较高的牧草ꎮ 主要分布在我国东北、 华北各地
及甘肃、 山东和四川ꎻ 蒙古、 俄罗斯西伯利亚(远
东地区)也有分布[４]ꎮ 花苜蓿生境多样化ꎬ 生长于
草原、 丘陵、 河岸或砂砾质土壤的山坡旷野ꎬ 这些
不同生境中水分、 温度和土壤等生态环境因子的差
异使花苜蓿形成各种独特且稳定的适应类群ꎬ 外部
形态差异较大ꎬ 是我国苜蓿属植物中较有特色的一
个物种ꎮ 由于生态幅较广ꎬ 进化出多种适应于各自
生境的生态型ꎬ 这些生态型对花苜蓿生态适应性的
研究和遗传育种都具有重要意义ꎮ
苜蓿属植物中紫花苜蓿 (Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ
Ｌｉｎｎ.)是一种优质的多年生豆科牧草ꎬ 对我国畜牧
业发展具有重要意义ꎮ 然而ꎬ 经研究发现花苜蓿是
苜蓿属中唯一可以适应干旱环境、 极低降雨量的石
质化环境和寒冷冬季的物种[５]ꎬ 且花苜蓿比紫花
苜蓿具有更高的营养利用效率ꎬ 更适合低投入耕作
系统[６]ꎮ 截至目前为止ꎬ 国内外对花苜蓿的抗性
基因鉴定的研究较少ꎬ 主要集中于表型特征评价ꎬ
生态特性分析等方面ꎬ 且数量少、 取样范围较小ꎬ
未能从分子水平阐明其优良基因分布特征ꎮ
ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记是通过对表达序列标签( ｅｘｐｒ
ｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇꎬ ＥＳＴ)中的简单重复序列
(ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔꎬ ＳＳＲ)进行开发产生的
一种遗传标记ꎮ 新型的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标记已成为重要
农艺性状定位、 基因作图、 遗传多样性、 比较基因
组学研究的重要工具[７]ꎮ 目前基于 ＥＳＴ数据的 ＳＳＲ
标记已在一些植物如黄瓜(Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ) [８]、 截
叶苜蓿(Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ) [９]、 小麦(Ｔｒｉｔｉｃｕｍ
ａｅｓｔｉｖｕｍ) [１０ꎬ１１]、 水稻 (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ) [１２]、 花生
(Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ) [１３]、 葡萄(Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ) [１４]、
棉花(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ) [１５]、 黑麦草(Ｌｏｌｉｕｍ
ｐｅｒｅｎｎｅ) [１６]等中已成功开发和应用ꎮ 本实验所选
择的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ是已被鉴定在其它豆科植物中与耐
盐抗旱性状相关的分子标记ꎬ 具有针对性ꎮ 本研究
的目的在于筛选出适用于花苜蓿的抗旱耐盐 ＥＳＴ￣
ＳＳＲ引物ꎬ 为进一步揭示花苜蓿抗旱耐盐基因型
的遗传变异和地理分布格局以及探讨花苜蓿抗旱耐
盐的适应性分化的分子基础做准备ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 实验材料
根据地理位置、 生境条件ꎬ 从全国 ２３ 个地点
中挑选出花苜蓿(Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ Ｔｒａｕｔｖ.)１１
个居群ꎬ 进行抗旱耐盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物筛选工作ꎮ
１１个居群分别是: 内蒙古自治区的满洲里(ＭＺＬ)、
克什克腾旗(ＫＱ)、 呼和浩特大青山(ＨＨ)、 达里
湖(ＤＬ)居群ꎻ 四川省的茂县(ＭＸ)居群ꎻ 甘肃省
的兴隆山(ＸＬＳ)居群ꎻ 陕西省的南泥湾(ＮＮ)居
群ꎻ 河北省的北戴河(ＢＤＨ)居群ꎻ 山东省的济南
(ＪＮ)居群ꎻ 辽宁省的彰武(ＺＷ)居群ꎻ 吉林省的
镇赉(ＺＬ)居群(见图 １)ꎮ 这 １１个居群覆盖了花苜
蓿在全国的分布范围ꎬ 各居群间有一定的地理距
离ꎮ 且各居群生境相差较大ꎬ 部分居群生境条件特
殊ꎬ 属于干旱半干旱地区(如克什克腾旗)或是盐
碱地(如达里湖)ꎬ 还有部分居群采样点土壤条件
特殊ꎬ 属于沙质土壤(如镇赉)ꎮ １１ 个居群的生境
资料见表 １ꎮ
４９４ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
图 １　 本研究 １１个居群分布图(居群编号见表 １)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ １１ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ
(Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｄｅ ａｓ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １)
　
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 ＰＣＲ扩增
目的片段的扩增通过聚合酶链式反应(ＰＣＲꎬ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)在热循环仪上进行ꎮ
ＰＣＲ反应体系总体积为 １０ μＬꎬ 其中包括 １ μＬ
１０~５０ ｎｇ的模板 ＤＮＡꎬ １ μＬ １０×ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒꎬ
０􀆰 ６ μＬ ＭｇＣｌ２(２５ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬ ０􀆰 ２ μＬ ｄＮＴＰ(每种
碱基浓度为 １０ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬ 正反向引物各 ０􀆰 ５ μＬ
(５ μｍｏｌ / Ｌ )ꎬ ０􀆰 １ μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ 酶 ( ５ Ｕ / μＬꎬ
ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)ꎮ ＰＣＲ反应程序: ９５℃预变性 ４ ｍｉｎꎻ
９４℃变性 ３０ ｓꎬ ５０℃~６０℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延伸
３０ ｓꎬ ３２个循环ꎻ ７２℃后延伸 ８ ｍｉｎꎮ
１􀆰 ２􀆰 ２　 引物退火温度的确定
从鹰嘴豆(Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌｉｎｎ.)的抗旱耐盐
的 １７７对 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标记[１７]中随机选取 ７０ 对引物
进行订购合成ꎬ 配置成 １００ μｍｏｌ贮存液ꎮ 取１０ μＬ
贮存液配置成 ５ μｍｏｌ 的引物溶液ꎬ 备用ꎮ 实验中
采用梯度扩增的方法分别确定各引物的退火温度ꎮ
一般来说ꎬ 引物的退火温度范围在 ５０℃~６０℃之
间ꎬ 最初对于所有引物选取 ５４℃作为退火温度ꎬ
再根据扩增结果对各引物的退火温度进行调整ꎬ 以
确定最适退火温度ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ３　 ＰＣＲ产物的电泳分离
ＰＣＲ产物的检测ꎬ 采用变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳银染检测: 加入 ３ / ４ 体积的变性剂(９８％甲酰
胺ꎬ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ ｐＨ ８􀆰 ０ ＥＤＴＡꎬ ０􀆰 ０５％溴酚蓝和
０􀆰 ０５％二甲苯腈)ꎬ ９５°Ｃ变性 ５ ｍｉｎꎬ 取 ３ μＬ样品
在 ６％变性聚丙烯酰胺凝胶(每 １００ ｍＬ凝胶溶液含
３０％丙烯酰胺溶液 ２０ ｍＬꎬ ５ ×ＴＢＥ 溶液２０ ｍＬꎬ
１０％过硫酸铵溶液 ０􀆰 ７ ｍＬꎬ 四甲基乙二胺溶液
３５ μＬ)上电泳ꎬ 电泳缓冲液为 １×ＴＢＥꎮ 电泳在六
一电泳仪上进行ꎬ 功率恒定 ５５ Ｗꎬ 电泳时间根据
目的片段大小而定ꎮ 用 ２５ ｂｐ ＤＮＡ 标记 ( Ｐｒｏ￣
ｍｅｇａꎬ Ｍａｄｉｓｏｎꎬ ＷＩꎬ ＵＳＡ)作产物片段大小的对
照标准ꎮ 电泳结束后银染显色ꎬ 银染参照 Ｓａｎｇｕｉ￣
ｎｅｔｔｉ等[１８]的程序ꎬ 略加改动ꎮ
读带ꎬ 筛选多态性引物ꎬ 送至生工生物工程
(上海)股份有限公司合成荧光引物ꎮ
１􀆰 ２􀆰 ４　 群体 ＳＳＲ扩增
依照以上 ＰＣＲ反应体系及反应程序ꎬ 对 １１个居
群 ２８６个个体进行扩增ꎬ 送往生工生物工程(上海)股
份有限公司进行 ＳＴＲ(ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ)分型ꎮ
表 １　 １１个居群原产地和生境条件
Ｔａｂｌｅ １　 Ｌｏｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｈａｂｉｔａｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ １１ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｒｕｔｈｅｎｉｃａ
居群编号
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｄｅ
居群原产地
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ
纬度
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
经度
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
年均降水(ｍｍ)
Ａｎｎｕａｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
ＭＺＬ 内蒙古满洲里南山 Ｍａｎｚｈｏｕｌｉꎬ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ １１７°２７′ ４９°３３′ ３０４
ＫＱ 内蒙古克什克腾旗 Ｈｅｘｉｇｔｅｎ Ｂａｎｎｅｒꎬ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ １１７°３１′ ４３°１５′ ３８３
ＨＨ 内蒙古呼和浩特大青山 Ｄａｑｉｎｇｓｈａｎꎬ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ １１１°４１′ ４０°５４′ ４００
ＤＬ 内蒙古达里湖 Ｄａｌｉ Ｎｕｒꎬ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ １１６°４７′ ４３°１６′ １１０
ＭＸ 四川茂县 Ｍａｏｘｉａｎꎬ Ｓｉｃｈｕａｎ １０３°５０′ ３１°４１′ １０８７
ＸＬＳ 甘肃兴隆山 Ｘｉｎｇｌｏｎｇｓｈａｎꎬ Ｇａｎｓｕ １０４°０３′ ３５°４７′ ３７８
ＮＮ 陕西南泥湾 Ｎａｎｎｉｗａｎꎬ Ｓｈａａｎｘｉ １０９°３８′ ３６°１９′ ５０５
ＢＤＨ 河北北戴河 Ｂｅｉｄａｉｈｅꎬ Ｈｅｂｅｉ １１９°２７′ ３９°５０′ ６５３
ＪＮ 山东济南 Ｊｉｎａｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ １１７°０２′ ３６°３７′ ６７４
ＺＷ 辽宁彰武 Ｚｈａｎｇｗｕꎬ Ｌｉａｏｎｉｎｇ １２２°３０′ ４２°３１′ ５１８
ＺＬ 吉林镇赉 Ｚｈｅｎｌａｉꎬ Ｊｉｌｉｎ １２３°００′ ４６°０６′ ４３０
５９４　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘 洁等: 花苜蓿抗旱耐盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记筛选
１􀆰 ３　 数据处理
利用 ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ １􀆰 ５ 软件对生工生物工程
(上海)股份有限公司 ＳＴＲ分型结果进行整理统计ꎬ
统计主要带型ꎬ 忽略弱杂带型ꎬ 统计稳定且易于分
辨条带ꎮ 用 Ｃｅｒｖｕｓ ３􀆰 ０软件[１９]计算等位基因数目
(ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ａｃｒｏｓｓ ａｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎬ Ａ)、 检
测到的个体数(ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓꎬ Ｎ)、
观察纯合度(ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ＨＯ)和期
望杂合度(ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ ＨＥ)ꎬ 它们都
是用来度量某一群体中特定基因座上等位基因纯合
程度的指标[２０]ꎮ 用多态信息含量(ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ＰＩＣ ) [２１]对标记基因多态性进
行估计ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＳＳＲ引物退火温度的筛选
选取已公布的 １７７ 对鹰嘴豆抗旱耐盐 ＥＳＴ￣
ＳＳＲ标记中的 ７０ 对ꎬ 按照参考文献[１７]中的反应
体系和反应程序进行多态性检测ꎬ 未得到如期效
果ꎮ 因此对确定所选引物的最适退火温度进行实验
测定ꎮ
结果显示ꎬ 当退火温度高于最适退火温度时ꎬ
无法扩增出条带或是条带弱ꎬ 扩增效果差ꎮ 当退火
温度低于最适退火温度时ꎬ 扩增条带过多ꎬ 特异性
差ꎬ 无法确定主带ꎮ 所以将扩增出的条带清晰、 主
带明显的反应温度确定为该引物的最适退火温度ꎮ
从筛选出的标记 ＩＣＣｅＭ０１４６ 来看ꎬ 在 ５４℃
时ꎬ 明显可见的条带多ꎬ 主带不明显ꎮ 所以对其退
火温度进行逐步提高ꎬ 分别在 ５５℃、 ５６℃、 ５７℃、
５８℃、 ５９℃、 ６０℃条件下进行扩增ꎬ 结果以 ５９℃
扩增效果最佳(见图 ２)ꎮ 反之ꎬ 对于 ５４℃条件下ꎬ
扩增产物弱或无的引物ꎬ 应逐步降低其退火温度ꎬ
以确定最佳反应条件ꎮ
２􀆰 ２　 多态性 ＳＳＲ引物的筛选
通过对 ７０ 对引物的扩增筛选ꎬ 其中 ２１ 对引
物可以扩增出 ＰＣＲ产物ꎬ 并且有 １２对引物在随机
选择的分别来自 ８ 个居群的 ８ 个个体间存在多态
性ꎮ 随后进行多次实验ꎬ 选择扩增稳定、 条带清晰
的引物ꎮ 最终筛选出 ８ 对引物ꎬ 即: ＩＣＣｅＭ００５５、
ＩＣＣｅＭ００５８、 ＩＣＣｅＭ００６３、 ＩＣＣｅＭ００８３、 ＩＣＣｅＭ０１４６、
Ｍ: ＤＮＡ标记ꎮ 图中数字表示片段长度ꎬ 单位为 ｂｐꎮ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ. Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｇｕｒｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ
ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔꎬ ｕｎｉｔ ｉｓ ｂｐ.
图 ２　 引物 ＩＣＣｅＭ０１４６在 ５４℃(ａ)和 ５９℃(ｂ)
的扩增结果
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＳＳＲ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ (５４℃ (ａ) ａｎｄ ５９℃ (ｂ))
　
ＩＣＣｅＭ０１６５、 ＩＣＣｅＭ００９１、 ＩＣＣｅＭ０１０５(表 ２)ꎮ
２􀆰 ３　 ＳＳＲ引物的扩增结果及多态信息
筛选出 ８ 对标记之后ꎬ 分别用 ＦＡＭ、 ＨＥＸ 两
种荧光标记标定ꎬ 送至生工生物工程(上海)股份
有限公司进行毛细电泳ꎬ 利用软件 ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ
１􀆰 ５ 读带ꎬ Ｃｅｒｖｕｓ ３􀆰 ０ 软件进行各标记的等位基
因频率分析ꎬ 结果统计见表 ３ꎮ ８ 个多态性 ＥＳＴ￣
ＳＳＲ标记在检测的 ２８６ 个个体中共获得 １１１ 个等
位基因ꎮ 平均等位基因数为 １３􀆰 ８８ꎬ 平均观察杂合
度为 ０􀆰 ４９７ꎬ 平均预期杂合度为 ０􀆰 ６８７ꎬ 多态信息
含量从 ０􀆰 ３１３到 ０􀆰 ８８３不等ꎬ 其中 ＩＣＣｅＭ００８３最
高ꎬ 而 ＩＣＣｅＭ００６３最低ꎬ 平均值为 ０􀆰 ６４９ꎮ
３　 讨论
ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物由于其来源于基因表达序列ꎬ
且侧翼序列的保守程度和 ＳＳＲ 进化的稳定性决定
着同一种 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物在不同物种间的通用性ꎮ
４０􀆰 ７％小麦的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物在大麦、 燕麦、 黑麦、
水稻和玉米中具有通用性[１０]ꎻ 苇状羊茅(Ｆｅｓｔｕｃａ
ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ)的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物在水稻和小麦中的
扩增率分别为 ５９％和 ７１％[２２]ꎮ 而在本实验 ７０ 对
引物中ꎬ 只有 ２１对扩增出产物ꎬ 仅占 ３０％ꎬ 通用
６９４ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
表 ２　 筛选出的 ８对多态性 ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物的详细信息
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物编号
Ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｄｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
退火温度(°Ｃ)
Ｔｍ
重复类型
Ｍｏｔｉｆ
片段范围(ｂｐ)
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｉｚｅ
ＩＣＣｅＭ００５５ ＧＴＧＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＴＧＴＡＧ ５２ (ＴＣ)８ＴＡ(ＴＣ)２０ １８０~２１０
ＩＣＣｅＭ００５８ ＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＴ ５９ (ＡＴ)１６ ２６１~２９０
ＩＣＣｅＭ００６３ ＴＴＧＴＴＧＣＡＡＡＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡ ５０ (ＴＣ)１２ ２３０~２６０
ＩＣＣｅＭ００８３ ＧＡＴＧＣＴＣＧＡＴＣＡＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＧＣＡＴＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＣＣ ５０ (ＡＡＧ)６ ２１０~２５１
ＩＣＣｅＭ０１４６ ＴＴＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＧＡＡ ５９ (ＡＴ)９ ２４０~２６０
ＩＣＣｅＭ０１６５ ＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＴＣＴＧＴＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＧ ５０ (ＡＣＣ)６ １７０~１８０
ＩＣＣｅＭ００９１ ＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＴＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＴ ５２ (ＴＡ)９ ２７０~２９０
ＩＣＣｅＭ０１０５ ＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡ ５２ (ＡＴ)８ ２５１~２７０
表 ３　 各标记的等位基因频率分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ａｌｌｅｌｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｉｇｈｔ ｌｏｃｉ
位点
Ｌｏｃｕｓ
等位基
因数
Ａ
检测个
体数
Ｎ
观测杂
合度
ＨＯ
预期杂
合度
ＨＥ
多态信息
含量
ＰＩＣ
ＩＣＣｅＭ００５５ ２０ ２７１ ０􀆰 ５２８ ０􀆰 ６８３ ０􀆰 ６３８
ＩＣＣｅＭ００５８ ２０ ２６５ ０􀆰 ５８１ ０􀆰 ８０７ ０􀆰 ７８４
ＩＣＣｅＭ００６３ ４ ２８６ ０􀆰 ３７８ ０􀆰 ３６４ ０􀆰 ３１３
ＩＣＣｅＭ００８３ ２５ ２６０ ０􀆰 ６５４ ０􀆰 ８９４ ０􀆰 ８８３
ＩＣＣｅＭ０１４６ １６ ２７０ ０􀆰 ４４４ ０􀆰 ７８３ ０􀆰 ７５４
ＩＣＣｅＭ０１６５ ８ ２８５ ０􀆰 ４１１ ０􀆰 ６６４ ０􀆰 ６０８
ＩＣＣｅＭ００９１ ９ ２８０ ０􀆰 ４５４ ０􀆰 ６６０ ０􀆰 ６０５
ＩＣＣｅＭ０１０５ ９ ２８３ ０􀆰 ５２３ ０􀆰 ６３９ ０􀆰 ６０４
Ｍｅａｎ １３􀆰 ８８ ２７５ ０􀆰 ４９６５ ０􀆰 ６８６７ ０􀆰 ６４８６
　 　 注: Ａꎬ 在所有居群中检测到的等位基因数ꎻ Ｎꎬ 检测个体
数ꎻ ＨＯꎬ 观察杂合度ꎻ ＨＥꎬ 预期杂合度ꎻ ＰＩＣꎬ 多态信
息含量ꎮ
Ｎｏｔｅｓ: Ａꎬ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓ ａｃｒｏｓｓ ａｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓꎻ Ｎꎬ
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓꎻ Ｈｏꎬ Ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙ￣
ｇｏｓｉｔｙꎻ ＨＥꎬ Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎻ ＰＩＣꎬ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ.
性偏低ꎮ 除去随机选择的因素ꎬ 没有对反应条件如
实验试剂用量、 扩增反应的循环数目等进行系统完
善的调整ꎬ 也对扩增结果产生了一定的影响ꎮ
ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物来自高度保守的 ＤＮＡ 转录区ꎬ
其揭示的多态性在理论上应低于基因组 ＳＳＲ标记ꎬ
对于区分亲缘关系较近的基因型灵敏度不及基因组
ＳＳＲ [２３ꎬ２４]ꎮ 然而ꎬ 李鸿雁等[２５]利用 １２对 ＳＳＲ 引
物在内蒙古花苜蓿 ４ 个居群 １４８ 份材料中共获得
６６个位点ꎬ 平均等位基因数为 ５􀆰 ５ꎬ 本研究中 ８
对 ＥＳＴ￣ＳＳＲ引物在 １１个居群的 ２８６个个体中共获
得了 １１１个位点ꎬ 平均等位基因数目为 １３􀆰 ９ꎬ 考
虑到本研究中的实验样本数目是前者的二倍ꎬ 粗略
将其按照样本比例进行估算ꎬ 两者平均等位基因近
似ꎮ 常玮等[２６]以 ２１ 份大豆不同基因型的基因组
ＤＮＡ为模板分别选取 ３０ 对多态性的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引
物和 ３０对基因组 ＳＳＲ引物进行扩增ꎬ 带型统计结
果显示: 大豆 ＥＳＴ￣ＳＳＲ与基因组 ＳＳＲ在供试基因
型间多态性指数均值分别为 ０􀆰 ５５和 ０􀆰 ４４ꎬ 二者揭
示的多态性水平差异不大ꎮ 研究表明ꎬ ＥＳＴ￣ＳＳＲ
在遗传多样性分析过程中同样可以真实地反应其遗
传变异的水平ꎮ
平均预期杂合度可反映群体的遗传一致性的程
度[２７]ꎮ 平均预期杂合度越高ꎬ 反映群体的遗传一
致性就越低ꎬ 其遗传多样性就越丰富ꎮ 由本结果可
知ꎬ ＩＣＣｅＭ００６３ 的平均预期杂合度值最低ꎬ 为
０􀆰 ３６４ꎬ 其余 ７ 个标记均具有较高的预期杂合度ꎮ
多态信息含量是衡量微卫星 ＤＮＡ 座位变异程度高
低的重要指标ꎮ 当某个微卫星标记的多态信息含量
大于 ０􀆰 ５ 时ꎬ 表明该标记为高度多态位点ꎻ 大于
０􀆰 ２５且小于 ０􀆰 ５时ꎬ 为中度多态位点ꎻ 小于 ０􀆰 ２５
时ꎬ 该座位为低度多态位点[２１]ꎮ 本实验中ꎬ ＥＳＴ￣
ＳＳＲ 标记除了 ＩＣＣｅＭ００６３ 的多态信息量值为
７９４　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘 洁等: 花苜蓿抗旱耐盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记筛选
０􀆰 ３１３ꎬ 属于中度多态位点外ꎬ 其余 ７ 个标记属于
高度多态位点ꎮ 由上可知ꎬ 平均预期杂合度的结果
与多态信息含量值得出的结果基本一致ꎮ 本结果表
明ꎬ 即使普遍认为 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标记的多态性较低ꎬ
但在本实验中 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标记具有较高的多态性ꎬ
一方面可能是因为本实验采用的是 ＳＴＲ 分型ꎬ 利
用荧光引物进行仪器自动读带ꎬ 这相对于利用聚丙
烯酰胺凝胶电泳进行手工读带增加了准确率ꎬ 并提
高了分辨率ꎮ 另一方面ꎬ 本实验选取了花苜蓿的
１１个居群ꎬ 基本覆盖了花苜蓿在国内的分布范围ꎬ
并且考虑到了所选居群的生态环境因素ꎬ 使得各标
记检测到的多态条带较多ꎮ 由此表明筛选出来的 ８
对 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记在研究群体中呈现较高的多态性ꎬ
各标记在所选居群中具有较高水平的遗传多样性ꎬ
可以用于花苜蓿遗传多样性分析ꎬ 是苜蓿属 ＤＮＡ
分子标记体系的一个重要补充ꎮ
４　 结论
ＥＳＴ￣ＳＳＲ处于基因编码区ꎬ 对 ＱＴＬ 和基因精
细定位具有重要作用ꎬ 可与基因数据库中已知序列
比较ꎬ 获得一些与生物生长、 发育、 代谢、 繁殖和
衰老死亡等一系列生理生化过程相关的分子遗传信
息ꎬ 是基因组 ＳＳＲ 标记的补充ꎮ 本实验中从近缘
种鹰嘴豆[１８]已公布的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记中筛选了 ８个
适用于花苜蓿的标记ꎬ 其与耐盐抗旱这一特性具有
高度的相关性ꎬ 对于花苜蓿耐盐抗旱这一生态适应
特征的进一步研究提供了有效的分子标记ꎮ
参考文献:
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ｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ: ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉ￣
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[ ９ ] 　 Ｅｕｊａｙ Ｉꎬ Ｓｌｅｄｇｅ Ｍ Ｋꎬ Ｗａｎｇ Ｌꎬ Ｍａｙ Ｇ Ｄꎬ Ｃｈｅｋ￣
ｈｏｖｓｋｉｙ Ｋꎬ Ｚｗｏｎｉｔｚｅｒ Ｊ Ｃꎬ Ｍｉａｎ Ｍ Ａ Ｒ. Ｍｅｄｉｃａ￣
ｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｒｅｖｅａｌ ｃｒｏｓｓｐｅｃｉｅｓ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓｐｐ. [Ｊ] . Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅ￣
ｎｅｔꎬ ２００４ꎬ １０８(３): ４１４－４２２.
[１０] 　 Ｇｕｐｔａ Ｐ Ｋꎬ Ｒｕｓｔｇｉｓ Ｓꎬ Ｓｈａｒｍａ Ｓꎬ Ｓｉｎｇｈ Ｒꎬ Ｋｕ￣
ｍａｒ Ｎꎬ Ｂａｌｙａｎ Ｈ Ｓ. Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒ￣
ｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉ￣
ｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｂｒｅａｄ ｗｈｅａｔ[Ｊ] . Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ
２００３ꎬ ２７０: ３１５－３２３.
[１１] 　 Ｎｉｃｏｔ Ｎꎬ Ｃｈｉｑｕｅｔ Ｖꎬ Ｇａｎｄｏｎ Ｂꎬ Ａｍｉｌｈａｔ Ｌꎬ
Ｌｅｇｅａｉ Ｆꎬ Ｌｅｒｏｙ Ｐꎬ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｍꎬ Ｓｏｕｒｄｉｌｌｅ Ｐ.
Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｍｐｌｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ (ＳＳＲ) ｍａｒｋｅｒｓ
ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ (ＥＳＴｓ)[Ｊ] .
Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔꎬ ２００４ꎬ １０９: ８００－８０５.
[１２] 　 Ｔｅｍｎｙｋｈ Ｓꎬ Ｐａｒｋ Ｗ Ｄꎬ Ａｙｒｅｅ Ｎꎬ Ｃａｒｔｉｎｈｏｕｒ Ｓꎬ
Ｈａｕｃｋ Ｎꎬ Ｌｉｐｏｖｉｃｈ Ｌꎬ Ｃｈｏ Ｙ Ｇꎬ Ｉｓｈｉｉ Ｔꎬ Ｍｃ￣
Ｃｏｕｃｈ Ｓ Ｒ. Ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｒｉｃｅ (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ.)
[Ｊ] . Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔꎬ ２０００ꎬ １００: ６９７－７１２.
[１３] 　 Ｌｉａｎｇ Ｘ Ｑꎬ Ｃｈｅｎ Ｘ Ｐꎬ Ｈｏｎｇ Ｙ Ｂꎬ Ｌｉｕ Ｈ Ｙꎬ Ｚｈｏｕ
Ｇ Ｙꎬ Ｌｉ Ｓ Ｘꎬ Ｇｕｏ Ｂ Ｚ. Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ＥＳＴ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ＳＳＲ
ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｐｅａｎｕｔ (Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ.) ａｎｄ
Ａｒａｃｈｉｓ ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓ[ Ｊ] . ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌꎬ ２００９ꎬ
９: ３５.
[１４] 　 Ｓｃｏｔｔ Ｋ Ｄꎬ Ｅｇｇｌｅｒ Ｐꎬ Ｓｅａｔｏｎ Ｇꎬ Ｒｏｓｓｅｔｔｏ Ｍꎬ
Ａｂｌｅｔｔ Ｅ Ｍꎬ Ｌｅｅ Ｌ Ｓꎬ Ｈｅｎｒｙ Ｒ Ｊ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＳＲｓ
ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｇｒａｐｅ ＥＳＴｓ[Ｊ] . Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔꎬ
２０００ꎬ １００: ７２３－７２６.
[１５] 　 Ｈａｎ Ｚ Ｇꎬ Ｇｕｏ Ｗ Ｚꎬ Ｓｏｎｇ Ｘ Ｌꎬ Ｚｈａｎｇ Ｔ Ｚ. Ｇｅ￣
ｎｅｔｉｃ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＥＳＴ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｄｉｐｌｏｉｄ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｕｍ ｉｎ ａｌｌｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ
ｃｏｔｔｏｎ [ Ｊ ] . Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００４ꎬ ２７２:
３０８－３２７.
８９４ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
[１６] 　 Ｂｒｕｎｏ Ｓꎬ Ｔｏｒｂｅｎ Ａꎬ Ｕｒｓｕｌａ Ｆ. Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｐｅ￣
ｒｅｎｎｉａｌ ｒｙｅｇｒａｓｓ ( Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ Ｌ.) [ Ｊ] . Ｍｏｌ
Ｂｒｅｅｄꎬ ２００８ꎬ ２１: ５３３－５４８.
[１７] 　 Ｖａｒｓｈｎｅｙ Ｒ Ｋꎬ Ｈｉｒｅｍａｔｈ Ｐ Ｊꎬ Ｌｅｋｈａ Ｐꎬ Ｋａｓｈｉｗａ￣
ｇｉ Ｊꎬ Ｂａｌａｊｉ Ｊꎬ Ｄｅｏｋａｒ Ａ Ａꎬ Ｖａｄｅｚ Ｖꎬ Ｘｉａｏ Ｙ Ｌꎬ
Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ Ｒꎬ Ｇａｕｒ Ｐ Ｍꎬ Ｓｉｄｄｉｑｕｅ Ｋ Ｈ Ｍꎬ Ｔｏｗｎ
Ｃ Ｄꎬ Ｈｏｉｓｉｎｇｔｏｎ Ｄ Ａ. Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅ
ｏｆ ｄｒｏｕｇｈｔ￣ ａｎｄ ｓａｌｉｎｉｔｙ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ＥＳＴｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ
ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ ｃｈｉｃｋｐｅａ
(Ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ Ｌ.) [Ｊ] . ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓꎬ ２００９ꎬ
１０: ５２３.
[１８] 　 Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ Ｃ Ｊꎬ Ｄｉａｓ Ｎ Ｅꎬ Ｓｉｍｐｓｏｎ Ａ Ｊ. Ｒａｐｉｄ
ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｓｅｐａ￣
ｒａｔｅｄ ｏｎ ｐｏｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ[Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬ
１９９４ꎬ １７: ９１５－９１９.
[１９] 　 Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ Ｓ Ｔꎬ Ｔａｐｅｒ Ｍ Ｌꎬ Ｍａｒｓｈａｌｌ Ｔ Ｃ. Ｒｅｖｉｓｉｎｇ
ｈｏｗ ｔｈｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ ＣＥＲＶＵＳ ａｃｃｏｍｍｏ￣
ｄａｔｅｓ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｕｃｃｅｓｓ ｉｎ ｐａｔｅｒ￣
ｎｉｔｙ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ[ Ｊ] . Ｍｏｌ Ｅｃｏｌꎬ ２００７ꎬ １６: １０９９－
１１０６.
[２０] 　 Ｒａｙｍｏｎｄ Ｍꎬ Ｒｏｕｓｓｅｔ Ｆ. ＧＥＮＥＰＯＰ ( ｖｅｒｓｉｏｎ １.
２): ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔｓ
ａｎｄ ｅｃｕｍｅｎｉｃｉｓｍ [ Ｊ] . Ｊ Ｈｅｒｅｄꎬ １９９５ꎬ ８６ ( ３):
２４８－２４９.
[２１] 　 Ｂｏｔｓｅｉｎ Ｄꎬ Ｗｈｉｔｅ Ｒ Ｌꎬ Ｓｋｏｌｎｉｃｋ Ｍ Ｃꎬ Ｄａｖｉｓ Ｒ Ｗ.
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ ｍａｐ ｉｎ ｍａｎ
ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ
[Ｊ] . Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔꎬ １９８０ꎬ ３２(３): ３１４－３３１.
[２２] 　 Ｓａｈａ Ｍ Ｃꎬ Ｍｉａｎ Ｍ Ａ Ｒꎬ Ｅｕｊａｙｌ Ｉꎬ Ｚｗｏｎｉｔｚｅｒ Ｊ Ｃꎬ
Ｗａｎｇ Ｌ Ｊꎬ Ｍａｙ Ｇ Ｄ. Ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ ＥＳＴ￣ＳＳＲ ｍａｒ￣
ｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｃｒｏｓｓ ｓｅｖｅｒａｌ ｇｒａｓｓ ｓｐｅ￣
ｃｉｅｓ[Ｊ] . Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔꎬ ２００４ꎬ １０９: ７８３－７９１.
[２３] 　 Ｇａｏ Ｌ Ｆꎬ Ｔａｎｇ Ｊꎬ Ｌｉ Ｈꎬ Ｊｉａ Ｊ Ｚ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃ￣
ｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｉｎ ｍａｊｏｒ ｃｒｏｐｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｕｔａ￣
ｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ [ Ｊ ] . Ｍｏｌ
Ｂｒｅｅｄꎬ ２００３ꎬ １２: ２４５－２６１.
[２４] 　 Ｇｕｐｔａ Ｐ Ｋꎬ Ｖａｒｓｈｅｎｅｙ Ｒ Ｋ. Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｍｐｈａｓｉｓ ｏｎ ｂｒｅａｄ
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Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓꎬ ２００２: ２９－６２.
(责任编辑: 张 平)
９９４　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 刘 洁等: 花苜蓿抗旱耐盐 ＥＳＴ￣ＳＳＲ标记筛选