全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(1)：74-79
Journa／of Wuhan Botanical Research
结缕草生物技术研究进展
贺杰 。，孙振元 ，魏建华 ，王宏芝 ，校现周。，李瑞芬 ¨
(1．北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京 100089；2．中国林业科学院林业研究所 ，
北京 100091：3．华南热带农业大学，海南儋州 571737)
摘 要：结缕草属植物具有耐干旱、耐盐和耐践踏等优良特性。最近的研究表明，基因转移与重组技术在结缕草遗
传改良中具有巨大应用潜力；结缕草遗传连锁图谱构建取得重要进展；基因克隆和基因资源研究正在展开。结合
当前有关结缕草生物技术研究现状，综述了结缕草基因工程和基因资源方面的研究进展，讨论了存在的问题并展
望其前景。
关键词：结缕草；组织培养；遗传转化；基因资源
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：lOOO·470X(2006)01—0074-06
Advance on the Study of Biotechnology in Zoysiagrass
HE Jie ·’
，
SUN Zhen—Yuan2
，
WEI Jian—Hua ，WANG Hong—Zhi ，Xiao Xian．Zhou’，LI Rui—Fen ’
(1．BeijingAgro-Biotechnology Research Center。曰咖 Academy矿Agricultural and Fo~try 5c／enc~，Beijing 100089，China；
2．Research Institute ofForestry，ChineseAcademy ofForestry，Beijing 100091，China；3．South China
Unlwrslty旷Tropical Agdcula~，Danzhou，Hainan 571737，China)
Abstract：Some species in the genus Zoysia possess agronomicaUy useful traits such as drought toler-
alice，salt tolerance and wear tolerance．Recent studies show that DNA transfer and recombination tech—
nology provides great potential for genetic improvement of zoysiagrasses；molecular linkage maps were
constructed from Zoysiajaponica and its hybrids with Zoysia matrela；the researches on gene cloning and
gene resource are in progress．In this review，we summarized the current knowledge in the study ofgenet-
ic transformation an d gene resource in zoysiagrass，an d pointed out some problems an d prospects．
Key words：Zoysiagrass(Zoysia spp．)；Tissue culture；Genetic transformation；Gene resource
结缕草(Zoysia spp．)是禾本科 (Gramineae)画
眉草亚科(Chloridoideae)结缕草属(Zoysia)多年生
暖季型草坪植物，分布范围较广，其跨度约为20个
纬度，34个经度，但主要分布于亚洲，在非洲等温暖
地区亦有分布。我国结缕草资源居世界首位，结缕
草也是我国唯一具有出口创汇能力的草种。我国有
该属植物5种、2变种、1变型H】，其中5个种已经用
于草坪草种质研究和开发利用，即 日本结缕草(
japonica Steud．)、中华结缕草(z．sinica Hance)、大
穗结缕草(z．macrostachya Franch．&Say．)、沟叶结
缕草[Z．Matrela(L．)Mer．]和细叶结缕草 (z．
tea．ifolia Wild．)。结缕草具有耐干旱、耐盐、耐践
踏、耐瘠薄、耐低修剪等优点 J，是一种很有发展潜
力的草坪草，但绿色期较短成为限制其应用的主要
障碍。
近20年来，生物技术发展迅速，为植物遗传改
良提供了新的途径。研究人员将生物技术应用于结
缕草遗传改良和基因资源研究中，并取得了重要进
展，延长结缕草绿色期也将成为可能。
1 结缕草再生体系的建立
植株再生体系的建立是遗传转化成功的前提和
保障，而外植体的选择是建立植株再生体系的首要
环节。就结缕草而言，常用的外植体除成熟的种子
外，还有幼穗、幼果、匍匐茎分生组织等。但由于成
熟或已分化的外植体缺少较强的二次生长的自然能
力【3 ，因此结缕草一般都用胚性愈伤组织、胚性细
胞悬浮系及其原生质体来分化再生植株。
1．1 以成熟胚为外植体再生体系的建立
以成熟种子为外植体，优点是取材不受季节和
收稿 日期：2005·06·28。修回日期：2005．09—15。
基金项 目：国家 863计划资助项目(2002AA241061)。
作者简介：贺杰(1978一)，女。河南周 口人，在读硕士生。主要从事植物生物技术方面的研究工作。
· 通讯作者(E·mail：liruifen@yahoo．eom．en)o
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第 1期 贺 杰等：结缕草生物技术研究进展 75
时间的限制，缺点是愈伤组织诱导受种子活力状况、
附属结构等因素影响。由于结缕草种子存在一定的
休眠特性，颖壳等附属结构不利于彻底消毒和激素
吸收。目前主要采用 除去颖壳消毒后直接接
种H 】，也有切取胚再接种的[9】。但由于结缕草种
子极小，切取胚比较费工费时，难以操作，一般不采
用此方法接种。在以成熟胚为外植体诱导愈伤组织
中，用 Ms[ -6· 、LS[’，。 和 N6 E9,10]基本培养基添加合
适浓度激素诱导愈伤组织。Asano等在 1989年把
无菌幼苗接种在改良的 N6培养基(添加 Na：SO ·
2H：0、CuSO。·5H：O、有机酸、维生素)上首次诱导
出愈伤组织并通过原生质体培养获得再生植株 引，
而未改良的 N 培养基不适宜结缕草成熟胚愈伤组
织的诱导和分化 】。维生素 VB。对 LS培养基诱导
和继代胚性愈伤组织是必需的 J。总的来说，MS
培养基比较适宜结缕草成熟胚诱导愈伤组织和分化
植株。
不同外植体的内源激素不同，诱导愈伤组织时
在培养基上添加的外源激素种类和水平不同。建立
与优化结缕草组培再生体系显得非常重要，特别是
外源生长素与分裂素的比例适合与否，是影响胚性
愈伤组织的诱导率及植株再生率的主要因素[4 】。
结缕草是禾本科植物中比较难以培养的物种，
在由结缕草成熟胚诱导愈伤组织的过程中，经常会
出现不同状态的愈伤组织。其中较软、水渍状的愈
伤组织容易产生 ¨ ，这类愈伤组织没有再生能力。
如何把不具有胚性的愈伤组织变成胚性愈伤组织，
是建立结缕草稳定、成熟再生体系的关键。结合我
们研究室的工作经验和资料报道，通过：①适当调整
诱导培养基中激素的浓度和配比，如 1—3 mg／L的
2，4一D配比低浓度的6-BA(O．1—0．3 mg／L) 川、一
定浓度的 NAA(1．0 mg／L)与2，4一D(3．0 mg／L)组
合 ；②适当增加继代次数 ；③添加有机成分，如
VB。、肌醇和 仅一酮戊二酸 等，均可增加胚性愈伤
组织的比例。目前，以日本、中华结缕草组培再生体
系的建立和优化研究较多，但都没有太大的突破，高
频再生愈伤系的获得仍存在一定难度。本研究室通
过反复摸索，初步建立与获得了中华结缕草高频再
生愈伤系，用于遗传转化研究(另文发表)。
1．2 以幼穗、匍訇茎等为外植体再生体系的建立
大多数草坪草是异花授粉植物，所谓的品种或
材料在遗传上是异质体(Heterogeneous)。如果以种
子为外植体，不同种子可能代表不同的基因型，但选
择幼穗、茎节(包括匍匐茎和根茎)为外植体就可克
服该缺点。
尽管目前 日本和韩国研究者利用 日本结缕草、
沟叶结缕草和中华结缕草的幼穗、幼胚 J引、茎
尖口 和匍匐茎段 诱导出愈伤组织并再生出植
株，但再生率均很低。研究表明结缕草幼穗、幼胚的
全能性优于茎尖[1引，茎尖优于匍匐茎段，而匍匐茎
段是组培快繁的理想材料。
以幼穗、幼胚、匍匐茎等为外植体诱导愈伤组
织，最大的好处是不通过继代扩繁可获得大量同一
基因型愈伤组织，为研究结缕草基因型对植株再生
的影响提供理想外植体。但取材除受季节和时间的
限制、不宜消毒外 ，结缕草的分布和生殖受地域性影
响很大，一般难以获得合适的幼穗和幼胚外植体。
椐资料分析，到目前为止，结缕草遗传转化的外植
体，仍以成熟胚为主。
2 结缕草遗传转化
草坪草的遗传转化方法可分为原生质体转化法
和不依赖于原生质体转化法。前者包括电激转化
法、聚乙二醇(PEG)介导法，后者包括基因枪法、碳
化硅介导转化法、农杆菌介导转化法等。但到目前
为止，报道的结缕草转化方法主要有原生质体法、基
因枪法和农杆菌介导转化法。
2．1 原生质体介导结缕草的遗传转化
原生质体转化法是基于原生质体具有摄取外来
物质的特性，通过渗透或电击处理可诱导原生质体
摄人外源 DNA¨ 。1980年后，由于采用了胚性细
胞悬浮系或胚性愈伤组织制备原生质体，各种草坪
草原生质体培养及再生植株技术相继成功，使得
DNA直接导人原生质体的转化技术能够应用于草
坪草。Inokuma等 通过热激和聚乙二醇(PEG)介
导法将潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)和p一葡萄糖
醛酸酶基因(gus)(用 Adh 1作为启动子)和 N一乙酰
基转移酶基因(Pat)导入 日本结缕草原生质体 ，获
得了抗潮霉素的转基因植株，从而开创了草坪草用
该转基因法的先例。但 由于原生质体培养难度较
大，目前运用该法进行遗传转化的研究较少。
2．2 农杆菌介导结缕草的遗传转化
目前 ，农杆菌介导的转基因技术已十分有效地
应用于双子叶植物的遗传转化。由于单子叶植物不
是农杆菌的天然宿主，曾认为农杆菌介导法不适合
于单子叶植物，特别是禾本科植物的遗传转化。但
随着对农杆菌侵染机理的深入研究和相应技术的提
高，农杆菌介导单子叶植物包括禾本科植物的基因
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76 武 汉 植 物 学 研 究 第24卷
转化已获得成功。据不完全统计，迄今已有7个科
2O多种单子 叶植 物利用农 杆菌介导 法转化成
功 。
1998～2001年间，柴明良 通过A．tumefac／ens
LBA4404介导，将 hpt基因、bar基因、GFP基因及
gus基因导人由日本结缕草种子诱导的胚性愈伤组
织中，得到了再生植株，这是世界上首例用农杆菌介
导法获得草坪草转基因成功的报道。Rahman等 lJ
建立了 A．tumefaciens介导的日本结缕草品种 YK—
EM2高效转化体系，并确定了A．tumefaciens菌株、
潮霉素浓度等关键因子的最佳组合。目前研究表
明，影响结缕草农杆菌介导转化率的主要因素有两
个：一是受体组织的状态(包括再生能力和转化能
力)；二是促进农杆菌侵染的各种因素 。其中
酚类物质可以激活农杆菌 Ti质粒的 基因以促进
转化，效果最佳的是 AS(乙酰丁香酮)；而且甜菜
碱、去除钙离子及与农杆菌共培养时间、温度能明显
提高 Gus基因瞬时表达水平。钙离子在农杆菌侵染
过程中的作用并不十分明确，但 gus基因瞬时表达
证明钙离子的存在抑制转化效率 J，这可能是由于
在农杆菌侵染过程中钙离子参与了植物防御反应而
导致的结果。这些研究标志着结缕草农杆菌转化方
法日益成熟。
2．3 基因枪介导结缕草的遗传转化
由于基因枪法既避免了原生质体再生培养的困
难，又克服了农杆菌的宿主限制，受体材料广泛，因
此问世后得到广泛应用。到 目前为止，基因枪法已
在多种冷季型 (cool—season type)和暖季型(warm—
sea8on type)草坪草的基因转化中获得成功[1 。但
目前通过基因枪转化结缕草成功获得转基因植株的
报道极少 。
尽管原生质体转化法、基因枪转化法和农杆菌
转化法在结缕草遗传转化中都有报道，但都只是处
于摸索、建立与优化遗传转化体系。导人的外源基
因都是报告或标记筛选基因，导人重要功能基因的
研究还有待于开展。其中农杆菌介导转化法具有其
很大的优势，不仅操作简单、设备便宜、转化频率高
等，且外源基因在植物基因组中插入的片段多为单
拷贝，很少出现共抑制现象和外源基因表达沉默，遗
传稳定性好。农杆菌介导法很有可能成为结缕草遗
传转化的主要方法，将通过基因工程育种培育出抗
逆、优质和绿色期延长的结缕草新品系(种)。
2．4 结缕草遗传转化中应注意的问题
结合作者本人工作及实验室的工作，提出以下
问题，以引起注意：
(1)转化受体的选择：无论是原生质体转化法、
农杆菌介导法，还是基因枪法 ，获得转化再生植株的
关键是选择适宜的转化受体，特别是转化受体的状
态直接影响转化效果。本实验室采用高频再生胚性
愈伤系作为转化受体，在筛选过程中采取多轮逐步
加大筛选压的策略；在分化过程中筛选压对植株再
生影响较大，采取先无后有，先低后高的措施对提高
转化效率有明显作用。
(2)在遗传转化中基因型是一个非常值得重视
的问题：因为由不同基因型获得的转基因植株在分
子或表型的差异，是由基因插入造成的，还是由不同
基因型引起的，不能解释清楚。目前以建立同一基
因型的胚性愈伤系来解决这一问题 J。如在选择
外植体时，注重外植体基因型的一致性，就可避免在
遗传操作中由组培外植体基因型不同而造成的麻
烦。
(3)外源功能基因的选择：根据结缕草的利用
和分布，因地制宜确定育种目标，选择合适的外源基
因，比如针对病虫害，选择几丁质酶基 因等；选择
CBF／DREB1、eF5一A等类型转录因子转化，不仅可
以培育出抗旱、抗寒性增强，还可改变株型、延长绿
色期，是比较理想的外源 目标基因。同时应用反义
抑制或 RNAi技术对结缕草绿色期进行表达调控研
究，或导人提高光合效率关键酶基因等都有助于创
制出新的结缕草种质。
综上所述，结缕草转基因研究还处于转化体系
建立和优化阶段，但基因转移和重组技术在结缕草
的遗传改良研究中已显示出巨大的应用潜力。
3 生物技术在结缕草基因资源研究方面的
应用
由于结缕草具有兼性繁殖、雌蕊先熟和种间杂
交可育等生物学特性，导致天然种间杂种的普遍存
在和 丰 富 的遗传 变 异，形 态种 的确 定 非 常 困
难 】。这给育种工作造成一定的困难。生物技
术的发展和应用，为结缕草种质资源研究和新品种
培育提供了有力的手段。
3．1 在种质资源研究方面的应用
种质资源的评价和筛选研究是种质创新和培育
新品种的基础。目前，美国、日本、韩国等都在结缕
草种质资源方面加大研究力度。研究者们从形
态 矧、蛋白 圳和分子 批 3个不 同层次对 日本、
中华、细叶和大穗等不同种、不同种质的结缕草进行
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第 1期 贺 杰等 ：结缕草生物技术研究进展
了初步研究。虽然分子标记技术在农作物种质资源
方面得到广泛而深入应用，但由于整个草坪业研究
水平的滞后以及结缕草等草坪草资源一直得不到足
够的重视，分子标记技术很晚才应用在结缕草资源
研究上。首先13本学者 Choi Joon Soo等用 RAPD技
术成功地鉴定 出结缕草 的 5个种 、 58个生态
型 ；并将从形态上很难区分的中华结缕草与大穗
结缕草，用 RAPD(random amplifed polymorphism
DNA，随机扩增多态性 DNA)技术对其进行了成功
分析 。Weaver等用 DAF法 (DNA amplifcation
fingerprinting，DNA扩增产物指纹分析)鉴定了8个
结缕草品种 。Yaneshita等用 RFLP法(restriction
fragment length polymorphisma，限制性内切酶片段
长度多态性)分析，将 5种结缕草分成 3组 ；并采
用叶绿素 DNA、细胞核 DNA RFLP分析将形态上难
以区分的材料划归不同种，特别是对大穗结缕草和
13本结缕草、13本结缕草和沟叶结缕草以及 日本结
缕草和中华结缕草间的天然杂种进行了区分[3引。
这些研究解决了结缕草属内不同种、杂交种和品种
间存在混乱、亲缘关系不清的问题，为结缕革新品种
的培育奠定了基础。
3．2 在结缕草遗传图谱构建等方面的应用
了解结缕草染色体组背景对结缕草遗传图谱构
建、基因操作等具有重要作用。最早报道结缕草的
染色体数 2n=4x=40-2 ，而且基于 RFLP分析表
明，结缕草是异源四倍体 】。Ebina等利用 AFLP
(amplifed fragment length polymorphism，扩增片段长
度多态性)和 Yaneshita等用 RFLP技术分别构建了
13本结缕草和沟叶结缕草杂交种的分子遗传 图
谱 引。2004年 Cai等利用无性系自交后代群体
构建了13本结缕草 AFLP遗传图谱[3 。但报道的
连锁群数(the number of linkage groups)均不同，而
且不符合结缕草染色体数 ／,=20。Cai等指出，结缕
草为异花授粉植物，且染色体数较多，构建高密度连
锁图谱比较困难；RFLPs和 SSRs(simple sequence
repeats)共显性分子标记(co-dominant marker)可使
该图谱更加精细-3 。尽管如此，这些分子标记的发
展和连锁图谱的构建，对结缕草的分类、分子标记辅
助育种和基因克隆等仍具有重要指导意义。
3．3 在基因标记定位和克隆等方面的应用
结缕草属植物具有耐盐性[3 ，研究表明，主要
是通过叶片上盐腺分泌 Na 和积累可溶性甘氨酸甜
菜碱来减轻盐害 引，定位和克隆结缕草耐盐基因是
研究者的期望。根据发展起来的 RFLPs和 AFLPs
分子标记，13本学者Kiyosada 等对结缕草耐盐数
量性状位点(QTL)进行了分析，通过同源基因序列
分离克隆到细叶结缕草耐盐基因 BADH(betaine al-
dehyde dehydrogenase，甜菜碱脱氢酶基因)(Genbank
登录号：AB161712)，并将耐盐基因 BADH和 FAD
(faty acid desaturase，脂 肪酸脱饱 和酶基 因)的
RFLPs分子标记整合到 AFLP遗传连锁图谱上，为
进一步寻找和克隆结缕草耐盐主效基因打下了基
础。
13本结缕草和沟叶结缕草在形态和抗寒性等方
面差异较大，Makoto等根据其杂交后代在叶宽、叶
长、根茎结节长、秋季叶色和抗寒性等方面的分离情
况，对这些性状进行了 QTL分析，发现叶片宽度是
该属植物分类的一个关键指标 】。Yaneshita[4 根
据一个种间杂种 Miyako(z．japonica×z．matret／a)
RFLP的连锁图，鉴定 出与结缕草冬季叶片色泽有
关的数量性状位点。13本结缕草的耐寒性明显优于
沟叶结缕草 J，研究表明，在低温下 13本结缕草具
有较强的光合能力 ．43 J。最近，Nomura等从 13本结
缕草中克隆了一个编码 C 循环关键酶 PCK(phos．
phoenolpyruvate earboxykinase，磷酸烯醇丙醇酸羧基
激酶)的基因，该基因全长7 kB，该基因在 13本结缕
草维管束鞘中表达；并克隆了 ZjPck基因的特异性
启动子，在 C，植物水稻中进行特异性表达研究 】。
绿色期是制约结缕草广泛应用的限制因素之一 ，培
育冬季保持绿色的结缕革新品种 (系)是结缕草育
种的主要目标。目前许多衰老诱导叶绿素降解基因
被克隆，在 Genbank中查询发现，韩国 Paek等在 13
本结缕草中克隆出衰老诱导的叶绿体持绿基因(se．
neseence-inducible chloroplast stay-green protein gene，
SGR)(Genbank登录号：AY850154)。在此研究基
础上可通过基因工程技术反义抑制叶绿素降解基因
或过量表达叶绿体持绿基因，进而培育出冬季保持
绿色的结缕草新品种(系)。
4 问题与展望
随着分子生物学和草坪业的发展，最近几年对
结缕草生物技术方面的研究取得了重要进展。尽管
如此，与其它农作物相比，草坪草生物技术方面的研
究比较滞后；与美国、13本、韩国等相比，我国对结缕
草生物技术的研究基本属于空白，应该加强这方面
的研究力度和深度。针对 目前结缕草研究现状 ，提
出结缕草生物技术研究方面存在的问题并进行展
望。
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78 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
4．1 建立结缕草稳定、高效再生体系
建立稳定、高效再生体系是结缕草基因工程的
前提。虽然结缕草组培再生体系已取得了一定进
展，但稳定、高效组培再生体系的获得仍存在一定困
难，特别是高频再生愈伤系的保存技术还未获得突
破，成为发展稳定、高频再生体系的瓶颈。对于再生
能力较高的愈伤系除了采用超低温保存技术外，还
可探索愈伤组织与组培苗无性系反复诱导的方式以
保持愈伤组织的高频再生能力。
4．2 完善结缕草遗传转化研究
目前已成功将一些标记基 因或报告基因，如
、bar、gus等导入结缕草，特别是农杆菌介导的转
化技术在结缕草转基因研究中显示出巨大的优势。
如果将耐寒、抗病等重要功能基因导入坪用价值较
高的草坪草品种(系)中，有望培育出优质高抗的结
缕草新品种(系)。据目前研究报道，利用转录因子
来改良植物的抗病性、抗逆性和改变株型，能获得较
为理想的效果L45 ；而且通过 antisense(反义抑制)或
RNAi技术抑制叶绿素降解基因，或正义表达新克隆
的持绿基因，有可能培育出绿色期延长且坪用价值
优良的结缕草新品系(种)。
4．3 加强结缕草基因资源的研究
结缕草是我国的特色资源，携带有抗旱、耐盐和
高光效等重要基因。尽管近年来开展了一些种质资
源方面的研究工作，但深度和广度不够。挖掘和鉴
定具有重要性状的种质资源，并对其进行遗传分析，
建立作图群体，是进行基因分离和克隆的前提。分
子标记技术(RAPD、RFLP和 AFLP)已在结缕草种
质资源研究上应用，但 目前还需发展 SSR、EST—SSR
或 ISSR标记。利用这些标记在研究结缕草资源的
起源进化、基因多样性和遗传图谱等方面具有巨大
的优越性 。
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