全 文 ：植物科学学报　 ２０１３ꎬ ３１(５): ５００~ ５０９
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 ３７２４ / ＳＰ􀆰 Ｊ􀆰 １１４２􀆰 ２０１３􀆰 ５０５００
石斛 ＳＳＲ标记的开发及可转移性分析
邱道寿ꎬ 郑希龙ꎬ 蔡时可ꎬ 郑锦荣ꎬ 罗焕明ꎬ 张 蕾ꎬ 邓瑞云ꎬ 李 武ꎬ 刘晓津∗
(广东省农业科学院作物研究所ꎬ 广东省农作物遗传改良重点实验室ꎬ 广州 ５１０６４０)
摘　 要: 当前已开发的石斛(Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ)ＳＳＲ标记仅 １００余对ꎬ 难以满足研究的需要ꎮ 为开发更多石斛分子标
记ꎬ 本研究通过生物信息学方法从公共核酸数据库搜索石斛 ＳＳＲꎮ 结果表明ꎬ ＧｅｎＢａｎｋ 收录的 ３５９９ 条石斛
ＤＮＡ序列经拼接获得 １３４３条 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ序列ꎮ 经搜索ꎬ 共检测出 ２８３个 ＳＳＲꎬ 分布于 ２０５条 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ序列ꎬ 平
均每 ２８１５ ｂｐ含一个 ＳＳＲꎮ 通过序列比对ꎬ 剔除 ８６条已开发引物的 ＳＳＲ￣ＤＮＡ序列ꎬ 从剩余的 １１９ 条序列设计
７６对引物ꎬ 并在石斛属 ３２ 个种间进行可转移性分析ꎬ 结果显示 ４７ 对引物得到有效扩增ꎬ 种间可转移率为
５１􀆰 １％~９５􀆰 ７％ꎬ 平均为 ７５􀆰 ９％ꎮ 有效扩增引物中有 ４６ 对在石斛种间具多态性ꎬ 检测出等位基因数 ２~８ 个ꎬ
平均 ４􀆰 ０ 个ꎮ 选取 １０ 对多态性引物扩增 ６０ 份铁皮石斛资源ꎬ 每对引物检测出等位基因数 ２~５ 个ꎬ 平均 ３􀆰 ４
个ꎮ 根据 ＳＳＲ扩增带型将 ６０份铁皮石斛资源聚为 ５大类ꎬ 同一类型内的表型较类群间接近ꎮ 对 ＤＭ１２１ 扩增产
物测序表明铁皮石斛种内的 ＳＳＲ等位变异由 ＳＳＲ重复次数差异造成ꎬ 而石斛种间的 ＳＳＲ 等位变异还包含 ＳＳＲ
位点侧翼序列的插入缺失以及替换ꎮ
关键词: 石斛ꎻ ＳＳＲꎻ 开发ꎻ 可转移性ꎻ 多态性
中图分类号: Ｑ９４９􀆰 ７１＋８􀆰 ４３　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１３)０５￣０５００￣１０
　 　 　 收稿日期: ２０１２￣１１￣０６ꎬ 修回日期: ２０１３￣０８￣０７ꎮ
　 基金项目: 广东省社会发展项目(２０１１Ａ０３０１００００２)ꎻ 广东省部产学研结合项目(２０１１Ｂ０９０４００５３７)ꎻ 广东省良种培育和引进项目
(粤财农[２０１１]５８４号 粤农计[２０１１]１４３号)ꎻ 广东省农科院院长基金项目(２０１１０９)ꎮ
　 作者简介: 邱道寿(１９６５－ )ꎬ 男ꎬ 博士ꎬ 副研究员ꎬ 主要从事岭南药材育种与生物技术研究(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｄｓｑｉｕ＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｘｊ６３０６＠ａｌｉｙｕｎ􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＳＳＲ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
ＱＩＵ Ｄａｏ￣Ｓｈｏｕꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉ￣Ｌｏｎｇꎬ ＣＡＩ Ｓｈｉ￣Ｋｅꎬ ＺＨＥＮＧ Ｊｉｎ￣Ｒｏｎｇꎬ
ＬＵＯ Ｈｕａｎ￣Ｍｉｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｌｅｉꎬ ＤＥＮＧ Ｒｕｉ￣Ｙｕｎꎬ ＬＩ Ｗｕꎬ ＬＩＵ Ｘｉａｏ￣Ｊｉｎ∗
(Ｃｒｏｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６４０ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｏ ｄａｔｅꎬ ｏｎｌｙ １００ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄꎬ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ
ｆａｒ ｆｒｏｍ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ. Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓꎬ ｗｅ ｍｉｎｅｄ ＳＳＲ ｏｆ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｒｏｍ ｐｕｂｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄａｔａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｓｏｍｅ １３４３ Ｕｎｉ￣ＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ３５９９ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ. Ｂｙ
ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｎｉ￣ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ２８３ ＳＳＲｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ２０５ Ｕｎｉ￣ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ
ｗｉｔｈ ａｎ ａｖｅｒａｇｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ １ ＳＳＲ ｐｅｒ ２８１５ ｂｐ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ８６ ｏｆ ｔｈｅ
２０５ ＳＳＲ￣ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｈａｄ ａｌｒｅａｄｙ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｓｉｇｎ ｐｒｉｍｅｒｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ７６ ｐｒｉｍｅｒ
ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ １１９ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｍｏｎｇ ３２
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４７ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｗｉｔｈ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒａｔｅｓ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ５１􀆰 １％ ｔｏ ９５􀆰 ７％ ( ａｖｅｒａｇｅ ７５􀆰 ９％) . Ｏｆ ｗｈｉｃｈꎬ ４６ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓ
ｗｅｒｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｉｔｈ ２－８ ａｌｌｅｌｅｓ (ａｖｅｒａｇｅ
４􀆰 ０ ａｌｌｅｌｅｓ) . Ｔｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎ ６０
ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅꎬ ａｎｄ ２－５ ａｌｌｅｌｅｓ (ａｖｅｒａｇｅ ３􀆰 ４ ａｌｌｅｌｅｓ) ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｐｅｒ ＳＳＲ ｌｏｃｕｓ.
Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＳＳＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎꎬ ｔｈｅ ６０ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ
ｆｉｖｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓꎬ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｓｅｒ ｗｉｔｈｉｎ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｔｈａｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｌｕｓｔｅｒｓ. Ｔｈｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＭ１２１ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ
ｗａｓ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ ｍａｉｎｌｙ ｔｏ ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＲ ｒｅｐｅａｔ ｎｕｍｂｅｒｓꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｉｎｄｅｌ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ
ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｆｌａｎｋｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍꎻ ＳＳＲꎻ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎻ Ｔｒａｎｓｆｅｒꎻ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
　 　 石斛(Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ Ｓｗ.)为兰科第二大属ꎬ 全
球共有 １５００ ~１６００ 种[１]ꎬ 我国有 ７６ 种[２]ꎮ 尽管
我国石斛资源仅占世界 ５％ꎬ 但其药用开发利用一
直走在前沿ꎮ 药用石斛的基原植物为铁皮石斛
(Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ Ｍｉｇｏ)、 金钗石
斛 ( Ｄ􀆰 ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ.)、 马鞭石斛 ( Ｄ􀆰 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ
Ｈｏｏｋ􀆰 Ｖａｔ􀆰 ｏｃｕ１ａｔｕｍ Ｈｏｏｋ.)及其近似种ꎮ 其中ꎬ
铁皮石斛尤为珍品ꎬ 位列“中华九大仙草”之首ꎮ
药用石斛具有益胃生津ꎬ 滋阴清热之功效ꎮ 用于热
病津伤、 口干烦渴、 胃阴不足、 食少干呕、 病后虚
热不退、 阴虚火旺、 骨蒸劳热、 目暗不明、 筋骨痿
软等症[３]ꎮ 此外ꎬ 石斛兰具有极高的观赏价值ꎬ
因其花姿优雅、 花色鲜艳、 花形优美、 花期长ꎬ 被
喻为“四大观赏洋兰”之一ꎮ 然而ꎬ 由于毁林开荒
以及过度采挖ꎬ 野生石斛资源遭到很大破坏ꎬ 很多
种类已被列为国家重点保护珍稀濒危药用植
物[４－７]ꎮ 因此ꎬ 保护野生石斛资源已迫在眉睫ꎬ 而
开展野生石斛资源的收集和研究则是保护石斛资源
实现我国药用石斛可持续利用的关键ꎮ
近年来分子标记逐步应用于石斛种质资源研
究ꎬ 其中 ＳＳＲ(Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓꎬ 简单
序列重复)标记由于具有多态性高、 可重复性强、
共显性等优点ꎬ 成为石斛主要分子标记之一ꎮ 然
而ꎬ 目前已开发的石斛 ＳＳＲ标记仅 １００余对[８－１５]ꎬ
难于满足研究的需要ꎮ 因此ꎬ 开发 ＳＳＲ 标记成为
近期石斛分子标记研究的重要内容ꎮ
随着测序技术的发展ꎬ 公共数据库中快速增长
的 ＤＮＡ序列成为 ＳＳＲ标记的重要来源ꎮ 从核酸数
据库中开发 ＳＳＲ 标记具有简便、 快捷、 节约成本
等诸多优点[１６]ꎬ 现已成为动植物 ＳＳＲ 标记开发的
主要途径ꎮ 鉴于此ꎬ 本研究拟利用 ＧｅｎＢａｎｋ 收录
的石斛 ＤＮＡ序列ꎬ 采用生物信息学方法开发 ＳＳＲ
标记ꎬ 并对其在石斛属种间的可转移性以及铁皮石
斛资源中的遗传多样性进行系统分析与评价ꎮ 本研
究旨在通过石斛 ＳＳＲ标记开发和可转移性分析为后
续研究者提供更多具有多态性的石斛 ＤＮＡ标记ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 实验材料
从ＧｅｎＢａｎｋ(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ􀆰 ｎｃｂｉ􀆰 ｎｌｍ􀆰 ｎｉｈ􀆰 ｇｏｖ / )
下载石斛 ＤＮＡ序列 ３５９９条(截止 ２０１２年 ３ 月 ２０
日)ꎬ 其中 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 序列 ２７９６ 条ꎬ ＥＳＴ ( Ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇꎬ 表达序列标签)序列 ８０２
条ꎬ ＧＳＳ(Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｕｒｖｅｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ 基因组勘
测序列)序列 １条ꎮ
３２个石斛(Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ)种用于 ＳＳＲ 可转移
性分析ꎬ ６０ 份铁皮石斛资源用于 ＳＳＲ 多态性分
析ꎬ 材料由广东省旱地作物资源库南药资源圃提供
(表 １)ꎮ
１􀆰 ２　 基因组 ＤＮＡ提取
每个材料取生长期叶片 １ ｇꎬ 采用植物基因组
大量提取试剂盒提取(Ｂｉｏｔｅｋｅꎬ Ｃｈｉｎａ)ꎬ 超微量紫
外 /可见分光光度计(ＮＤ￣２０００Ｃꎬ Ｔｈｅｒｍｏꎬ ＵＳＡ)
测量 ＤＮＡ浓度ꎮ
１􀆰 ３　 ＤＮＡ序列拼接
采用 ＴＩＧＲ基因指数聚类工具(ＴＩＧＲ Ｇｅｎｅ Ｉｎ￣
ｄｉｃｅｓ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ Ｔｏｏｌｓꎬ 简 称 ＴＧＩＣＬꎬ ｈｔｔｐ: / /
ｃｏｍｐｂｉｏ􀆰 ｄｆｃｉ􀆰 ｈａｒｖａｒｄ􀆰 ｅｄｕ / ｔｇｉ / ｓｏｆｔｗａｒｅ / ) 对 石
斛 ＤＮＡ序列进行拼接ꎮ 当 ＤＮＡ 序列重叠超过 ５０
个核苷酸且相似度达到 ９０％ꎬ 同时序列不匹配长
度不超过 ２０个核苷酸时被认为符合拼接要求ꎮ
１􀆰 ４　 ＳＳＲ位点搜索
采用自动搜索 ＳＳＲ位点的 Ｐｅｒｌ脚本 ＭＩｃｒｏＳＡ￣
ｔｅｌｌｉｔｅ ( ＭＩＳＡꎬ ｈｔｔｐ: / / ｐｇｒｃ􀆰 ｉｐｋ￣ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ􀆰 ｄｅ /
ｍｉｓａ / )在 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ序列中搜索 ＳＳＲ位点ꎮ 在本研
究中ꎬ ＳＳＲ 位点的搜索设置几个限制因子: 最短
１５ ｂｐꎬ 二核苷酸最少重复 ８ 次ꎬ 三核苷酸至少重
复 ５次ꎬ 四核苷酸、 五核苷酸、 六核苷酸至少重复
１０５　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邱道寿等: 石斛 ＳＳＲ标记的开发及可转移性分析
表 １　 ３２种石斛样品的名称与来源
Ｔａｂｌｅ １　 Ｎａｍｅ ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ３２ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ
序号 Ｎｏ. 种名 Ｓｐｅｃｉｅｓ 产地 Ｌｏｃａｌｉｔｙ　 序号 Ｎｏ. 种名 Ｓｐｅｃｉｅｓ 产地 Ｌｏｃａｌｉｔｙ　
１ 重唇石斛 Ｄ􀆰 ｈｅｒｃｏｇｌｏｓｓｕｍ 广西 Ｇｕａｎｇｘｉ １７ 喇叭唇石斛 Ｄ􀆰 ｌｉｔｕｉｆｌｏｒｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
２ 唇石斛 Ｄ􀆰 ａｐｈｙｌｌｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ １８ 霍山石斛 Ｄ􀆰 ｈｕｏｓｈａｎｅｎｓｅ 安徽 Ａｎｈｕｉ
３ 卓花石斛 Ｄ􀆰 ａｎｏｓｍｕｍ 广东 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ １９ 美花石斛 Ｄ􀆰 ｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ 广西 Ｇｕａｎｇｘｉ
４ 翅萼石斛 Ｄ􀆰 ｃａｒｉｎｉｆｅｒｕｍ 浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ ２０ 广西石斛 Ｄ􀆰 ｓｃｏｒｉａｒｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
５ 密花石斛 Ｄ􀆰 ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ 海南 Ｈａｉｎａｎ ２１ 细茎石斛 Ｄ􀆰 ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ 浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ
６ 束花石斛 Ｄ􀆰 ｃｈｒｙｓａｎｔｈｕｍ 广西 Ｇｕａｎｇｘｉ ２２ 梳唇石斛 Ｄ􀆰 ｓｔｒｏｎｇｙｌａｎｔｈｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
７ 短棒石斛 Ｄ􀆰 ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ 浙江 Ｚｈｅｊｉａｎｇ ２３ 金钗石斛 Ｄ􀆰 ｎｏｂｉｌｅ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
８ 鼓槌石斛 Ｄ􀆰 ｃｈｒｙｓｏｔｏｘｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ２４ 拟滇桂石斛 Ｄ􀆰 ｎｉｄｉａｎｇｕｉ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
９ 反瓣石斛 Ｄ􀆰 ｅｌｌｉｐｓｏｐｈｙｌｌｕｍ 广东 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ２５ 报春石斛 Ｄ􀆰 ｐｒｉｍｕｌｉｎｕｍ 缅甸 Ｂｕｒｍａ
１０ 晶帽石斛 Ｄ􀆰 ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ２６ 齿瓣石斛 Ｄ􀆰 ｄｅｖｏｎｉａｎｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
１１ 铁皮石斛 Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ２７ 球花石斛 Ｄ􀆰 ｔｈｙｒｓｉｆｌｏｒｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
１２ 流苏石斛 Ｄ􀆰 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ 广西 Ｇｕａｎｇｘｉ ２８ 小美石斛 Ｄ􀆰 ｂｅｌｌａｔｕｌｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
１３ 剑叶石斛 Ｄ􀆰 ａｃｉｎａｃｉｆｏｒｍｅ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ２９ 翅梗石斛 Ｄ􀆰 ｔｒｉｇｏｎｏｐｕｓ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
１４ 细叶石斛 Ｄ􀆰 ｈａｎｃｏｃｋｉｉ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ３０ 聚石斛 Ｄ􀆰 ｌｉｎｄｌｅｙｉ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
１５ 钩状石斛 Ｄ􀆰 ａｄｕｎｃｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ３１ 棒节石斛 Ｄ􀆰 ｆｉｎｄｌａｙａｎｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
１６ 聚石斛 Ｄ􀆰 ｌｉｎｄｌｅｙｉ 云南 Ｙｕｎｎａｎ ３２ 杯鞘石斛 Ｄ􀆰 ｇｒａｔｉｏｓｉｓｓｉｍｕｍ 云南 Ｙｕｎｎａｎ
４次ꎬ 不包含单核苷酸类型ꎮ
１􀆰 ５　 ＳＳＲ引物设计
根据 ＳＳＲ 位点两端的保守区域ꎬ 采用 Ｐｒｉｍｅｒ
ｐｒｅｍｉｅｒ ５软件设计引物ꎮ 引物设计基于下列原则:
(１)溶解温度(Ｔｍ)５０℃~６０℃ꎬ 最适温度 ５５℃ꎻ
(２)扩增产物大小 ８０~３５０ ｂｐꎻ (３)引物长度 １８~
２６ ｂｐꎻ (４)引物 ＧＣ含量 ４０％~６０％ꎮ
１􀆰 ６　 ＰＣＲ扩增
ＰＣＲ 反应体系 ( ２０ μＬ ): １ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ
(５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌꎬ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ｐＨ ８􀆰 ３ꎬ
１􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２ꎬ ０􀆰 １％明胶)ꎬ １ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶ꎬ ５０ ~１００ ｎｇ 模板 ＤＮＡꎬ ０􀆰 １５ μｍｏｌ / Ｌ引
物ꎬ ０􀆰 ２ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰꎮ 反应条件为 ９４℃预变性
５ ｍｉｎꎻ ９４℃变性 １ ｍｉｎꎬ ５５℃退火 ３０ ｓꎬ ７２℃延
伸 １ ｍｉｎꎬ ３５个循环ꎻ ７２℃延伸 ５ ｍｉｎꎮ 扩增产物
在 ６􀆰 ０％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳(电泳缓冲
液 １×ＴＢＥꎬ 电压 ７５ Ｖꎬ 时间 ２􀆰 ５ ｈ)ꎬ ０􀆰 １％ ＡｇＮＯ３
染色ꎬ 于 ＢＩＯＲＡＤ 凝胶成像系统下观察、 照相、
读带ꎮ
１􀆰 ７　 ＰＣＲ产物克隆与测序
采用 ＰＡＧＥ 胶回收试剂盒(Ｂｉｏｔｅｋｅꎬ Ｃｈｉｎａ)
回收扩增产物ꎬ 回收产物与克隆载体 ｐＭＤ１８￣Ｔ 连
接后转化大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ 重组子经
鉴定后送北京华大基因有限公司测序ꎮ
１􀆰 ８　 数据统计与分析
观察各 ＳＳＲ位点在供试样本间 ＰＣＲ 扩增条带
的差异ꎬ 清晰带赋值为“１”ꎬ 无扩增带的赋值为
“０”ꎬ 用 Ｅｘｃｅｌ软件统计整理ꎮ 采用 Ｓｉｍｐｓｏｎ指数
计算 ＳＳＲ 位点的多态性信息含量(ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔꎬ ＰＩＣ) [１３]ꎮ
ＰＩＣ ＝ １ －∑
ｎ
ｉ＝１
ｐｉ ２ꎮ 式中 ｎ ＝该位点的等位基因
数ꎬ ｐｉ＝第 ｉ个等位基因在群体中的频率ꎮ 采用遗
传进化分析软件 ＮＴＳＹＳｐｃ ２􀆰 １ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｘｅ￣
ｔｅｒｓｏｆｔｗａｒｅ􀆰 ｃｏｍ / ｃａｔ / ｎｔｓｙｓｐｃ / ｎｔｓｙｓｐｃ􀆰 ｈｔｍｌ)进行
聚类分析ꎬ 所用的聚类方法为 ＵＰＧＭＡꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 ＤＮＡ序列拼接
为了减少冗余序列ꎬ 提高 ＤＮＡ 序列质量ꎬ 获
得比单个 ＤＮＡ序列更长ꎬ 且来自同一位点的共有
序列ꎬ 本实验采用 ＴＧＩＣＬ工具对石斛 ＤＮＡ序列进
行拼接ꎮ 结果表明ꎬ ３５９９条 ＤＮＡ序列经拼接后共
获得 １３４３ 条 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ 序列ꎬ 其中片段重叠群
(ｃｏｎｔｉｇｓ)１６０条ꎬ 单片段(ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ)１１８３条ꎮ
２􀆰 ２　 ＳＳＲ分布频率及特点
利用 Ｐｅｒｌ脚本 ＭＩＳＡ 在 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ 序列中搜索
ＳＳＲꎬ 结果从 １３４３ 条 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ 序列中共搜索到
２０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
２８３个 ＳＳＲꎬ 分布于 ２０５ 条 ＤＮＡ 序列ꎬ 其中含有
ＳＳＲ １个以上的 ＤＮＡ序列 ７６条ꎬ 平均每 ２８１５ ｂｐ
１个 ＳＳＲ(表 ２)ꎮ
已搜索到的石斛 ＳＳＲ 种类较为丰富ꎬ 二至六
核苷酸重复均存在ꎬ 但出现的频率存在较大差异
(表 ２)ꎮ 二核苷酸重复出现频率最高ꎬ 共 ２０９ 个ꎬ
占总 ＳＳＲ的 ７３􀆰 ８％ꎬ 其次是三核苷酸重复(６５个ꎬ
２３􀆰 ０％)、 四核苷酸重复(４ 个ꎬ １􀆰 ４％)、 五核苷
酸(３ 个ꎬ １􀆰 １％)和六核苷酸重复(２ 个ꎬ ０􀆰 ７％)ꎮ
所有重复平均长度为 ３１􀆰 ４ ｂｐꎬ 其中二核苷酸、 三
核苷酸、 四核苷酸、 五核苷酸和六核苷酸平均
ＳＳＲ长度分别为 ３４􀆰 ７、 ２３􀆰 ２、 ２５、 ２０、 ２７ ｂｐꎮ
在搜索出的石斛 ＳＳＲ中共观察到 １９种重复基
序( ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ)ꎬ 其中二、 三、 四、 五、 六核苷
酸重复基序分别为 ３、 ８、 ３、 ３、 ２ 种ꎮ 出现频率
最高的 ３种重复基序包括 ＡＣ / ＧＴ (３７􀆰 ８％)、 ＡＧ /
ＣＴ (３４􀆰 ６％)和 ＡＡＧ / ＣＴＴ (１８􀆰 ０％)ꎬ 其余 １６ 种
重复基序仅占 ９􀆰 ５％(表 ３)ꎮ
表 ２　 石斛 ＤＮＡ序列中无冗余 ＳＳＲ搜索结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｕｍｍａｒｙ ｏｆ ｍｉｎｉｎｇ ＳＳＲ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
查询项目
Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｔｅｍ
片段重叠群 (ｂｐ)
Ｃｏｎｔｉｇｓ
单片段 (ｂｐ)
Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｓ
合计 (ｂｐ)
Ｔｏｔａｌ
检测的序列总数 Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｅｘａｍｉｎｅｄ １６０ (１３２３７０) １１８３ (６６４１７３) １３４３ (７９６５４３)
鉴定的 ＳＳＲ总数 Ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ＳＳＲｓ ４２ ２４１ ２８３
含 ＳＳＲ的序列数 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＳＳＲ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ３２ １７３ ２０５
含 １个以上 ＳＳＲ 的序列数 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １ ＳＳＲ ７ ４４ ５１
复合型 ＳＳＲ的数目 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＳＳＲｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ９ ６１ ７０
二核苷酸 Ｄｉ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ２６ １８３ ２０９
三核苷酸 Ｔｒｉ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １４ ５１ ６５
四核苷酸 Ｔｅｔｒａ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １ ２ ３
五核苷酸 Ｐｅｎｔａ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １ １ ２
表 ３　 石斛中 １９种 ＳＳＲ基序的出现频率与数量
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｐｅａｔｓ ｏｆ １９ ＳＳＲ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
重复基序
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆｓ
重复单元数　 Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｒｅｐｅａｔ ｕｎｉｔｓ
４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ >１２ 合计 Ｔｏｔａｌ
ＡＣ / ＧＴ － － － － １７ １５ １０ ７ ５ ５３ １０７
ＡＧ / ＣＴ － － － － ２０ １３ ９ ３ ５ ４８ ９８
ＡＴ / ＡＴ － － － － １ １ ２ ４
ＡＡＣ / ＧＴＴ － １ １ １ ３
ＡＡＧ / ＣＴＴ － １０ １０ ５ ５ ３ ６ ５ ５ ２ ５１
ＡＣＣ / ＧＧＴ － １ １
ＡＣＧ / ＣＴＧ － １ １ ２
ＡＧＣ / ＣＧＴ － １ １
ＡＧＧ / ＣＣＴ － ２ １ ３
ＡＧＴ / ＡＴＣ － １ １
ＣＣＧ / ＣＧＧ － ３ ３
ＡＡＡＧ / ＣＴＴＴ １ １
ＡＡＡＴ / ＡＴＴＴ １ １
ＡＧＡＴ / ＡＴＣＴ ２ ２
ＡＡＴＡＴ / ＡＴＡＴＴ １ １
ＡＣＡＧＣ / ＣＧＴＧＴ １ １
ＡＧＣＴＣ / ＡＧＴＣＧ １ １
ＡＡＴＡＣＴ / ＡＴＧＡＴＴ １ １
ＡＡＴＧＣＧ / ＡＣＧＣＴＴ １ １
合计 Ｔｏｔａｌ ５ １８ １３ ８ ４６ ３３ ２５ １５ １５ １０５ ２８３
３０５　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邱道寿等: 石斛 ＳＳＲ标记的开发及可转移性分析
２􀆰 ３　 ＳＳＲ引物设计及多态性检测
为了避免对同一 ＳＳＲ￣ＤＮＡ 序列重复设计引
物ꎬ 将前人开发的 １１３ 对 ＳＳＲ 引物与本研究搜索
到的 ２０５条 ＳＳＲ￣ＤＮＡ序列进行比对[８－１５]ꎬ 发现有
８６条 ＳＳＲ￣ＤＮＡ序列已被用于开发 ＳＳＲ 引物ꎬ 其
中 １２条被重复设计出 ２５ 对引物(表 ４)ꎮ 鉴于此ꎬ
本研究只针对剩余的 １１９条 ＳＳＲ￣ＤＮＡ序列设计引
物ꎬ 共设计引物 ７６ 对ꎬ 其余 ４３ 条序列由于 ＳＳＲ
侧翼序列太短或者结构复杂而未能成功设计ꎮ已设
表 ４　 同一位点已设计的引物
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｒｏｍ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｌｏｃｉ
ＳＳＲ位点数
Ｎｏ􀆰 ｏｆ
ＳＳＲ ｌｏｃｉ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
ＳＳＲ位点数
Ｎｏ􀆰 ｏｆ
ＳＳＲ ｌｏｃｉ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
１ ＧＳＳＲ３ꎬＢＷＨ００９ ７ ＧＳＳＲ２９ꎬＤＯ￣０７
２ ＧＳＳＲ８ꎬＳ１３６ ８ ＧＳＳＲ３０ꎬＢＷＨ００７
３ ＧＳＳＲ１５ꎬＤＯ￣０３ꎬＤＯ￣１１ ９ ＸＭＬ００５ꎬＦ８
４ ＧＳＳＲ１６ꎬＤＯ￣０１ １０ ＸＭＬ００７ꎬＦ２７
５ ＧＳＳＲ２２ꎬＢＷＨ０１２ １１ ＹＹＨ００３ꎬＹＹＨ００４
６ ＧＳＳＲ２５ꎬＯＡ２３ １２ ＹＹＨ００９ꎬＹＹＨ０１２
　 　 注: 标记 ＯＡ、ＤＯ、Ｆ、ＸＭＬ、ＹＹＨ、ＢＷＨ、ＧＳＳＲ 引自参考文献
[８ꎬ９ꎬ１０ꎬ１１ꎬ１２ꎬ１４ꎬ１５]ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｍａｒｋｅｒ ＯＡꎬＤＯꎬＦꎬＸＭＬꎬＹＹＨꎬＢＷＨ ａｎｄ ＧＳＳＲ ｗａｓ ｄｅ￣
ｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ[８ꎬ９ꎬ１０ꎬ１１ꎬ１２ꎬ１４ꎬ１５] .
计引物的 ＤＮＡ 序列包含 ５ 种重复类型ꎬ 其中含
二、 三、 四、 五、 六核苷酸重复分别为 ４５、 ２５、
３、 ２、 １条ꎮ
　 　 采用新设计的 ７６ 对引物扩增 ３２ 个石斛种基
因组 ＤＮＡꎬ 检测 ＳＳＲ在石斛种间的可转移性ꎮ 结
果发现有 ４７ 对引物能扩增出清晰条带ꎬ 其余 ２９
对无扩增产物ꎮ 可扩增引物有 ４５ 对扩增长度与预
期相近ꎬ 另外 ２ 对明显大于预期ꎮ ４７ 对可扩增引
物在石斛种间的可转移率为 ５１􀆰 １％ ~９５􀆰 ７％ꎬ 平
均为 ７５􀆰 ９％ꎬ 其中 ４６对检测出多态性ꎬ 占可扩增
引物的 ９７􀆰 ９％ꎮ 每对多态性引物检测出等位基因
数 ２~８个(图 １、 表 ５、 表 ６)ꎬ 平均 ４􀆰 ０个ꎬ 表明
ＳＳＲ在石斛种间多态性高ꎮ 为进一步检验 ＳＳＲ 在
石斛种内的多态性ꎬ 随机挑选 １０ 对 ＳＳＲ 引物
( ＤＭ４、 ＤＭ６、 ＤＭ８、 ＤＭ３４、 ＤＭ４５、 ＤＭ６８、
ＤＭ８１、 ＤＭ１１２、 ＤＭ１２１、 ＤＭ１４１)扩增 ６０ 份铁
皮石斛资源基因组 ＤＮＡꎬ 结果 １０对引物均能检测
出多态性ꎬ 检测等位基因数 ２~５个ꎬ 平均 ３􀆰 ４个ꎬ
被检测位点的多态性信息量 ( ＰＩＣ) 为 ０􀆰 ４７３ ~
０􀆰 ７８７ꎬ 平均 ０􀆰 ６８４(图 １)ꎮ 将 １０对引物的扩增带
型数字化后聚类分析ꎮ 结果显示 １０对 ＳＳＲ引物能
够区分 ５６ 份铁皮石斛资源ꎬ 但未能将 ＮＹＴ６９ 与
ＮＹＴ７０、 ＮＹＴ１０７与 ＮＹＴ１０８ 区分开ꎮ 在相似系数
为 ０􀆰 ５５处ꎬ ６０份资源被划分为 ５大类ꎬ 各类群依
次包含 ４、 ４２、 １１、 ２和 １ 份资源(图 ２)ꎮ 进一步
观察铁石石斛的形态性状发现同一类群内铁皮石斛
的表型较类群间接近ꎬ 其中单独聚为一类的品系
ＮＹＴ１１２表型与其他类群差异最大ꎬ 该品系由铁皮
石斛与霍山石斛杂交获得ꎮ 另外ꎬ ＮＹＴ６９ 与
ＮＹＴ７０、 ＮＹＴ１０７和 ＮＹＴ１０８表型极为相似ꎮ
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M
225 bp
198 bp
143 bp
１~１５代表石斛种类: 卓花石斛(１)ꎬ 翅萼石斛(２)ꎬ 密花石斛(３)ꎬ 束花石斛(４)ꎬ 短棒石斛(５)ꎬ 鼓槌石斛(６)ꎬ 反瓣石斛(７)ꎬ 晶
帽石斛(８)ꎬ 唇石斛(９)ꎬ 流苏石斛(１０)ꎬ 剑叶石斛(１１)ꎬ 细叶石斛(１２)ꎬ 钩状石斛(１３)ꎬ 聚石斛(１４)ꎬ 喇叭唇石斛(１５)ꎻ １６~３０
代表铁皮石斛品系: ＮＹＴ１１ (１６)ꎬ ＮＹＴ１２ (１７)ꎬ ＮＹＴ１３ (１８)ꎬ ＮＹＴ１４ (１９)ꎬ ＮＹＴ１５ (２０)ꎬ ＮＹＴ２２ (２１)ꎬ ＮＹＴ３２ (２２)ꎬ ＮＹＴ３８
(２３)ꎬ ＮＹＴ４５ (２４)ꎬ ＮＹＴ４７ (２５)ꎬ ＮＹＴ４９ (２６)ꎬ ＮＹＴ５１ (２７)ꎬ ＮＹＴ５２ (２８)ꎬ ＮＹＴ５６ (２９)ꎬ ＮＹＴ５７ (３０)ꎻ Ｍ代表 ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ
箭头标示的条带为测序条带ꎮ
１－１５ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ: Ｄ􀆰 ａｎｏｓｍｕｍ ( １ )ꎬ Ｄ􀆰 ｃａｒｉｎｉｆｅｒｕｍ ( ２ )ꎬ Ｄ􀆰 ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ ( ３ )ꎬ Ｄ􀆰 ｃｈｒｙｓａｎｔｈｕｍ ( ４ )ꎬ
Ｄ􀆰 ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ (５)ꎬ Ｄ􀆰 ｃｈｒｙｓｏｔｏｘｕｍ ( ６)ꎬ Ｄ􀆰 ｅｌｌｉｐｓｏｐｈｙｌｌｕｍ ( ７)ꎬ Ｄ􀆰 ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ ( ８)ꎬ Ｄ􀆰 ａｐｈｙｌｌｕｍ ( ９)ꎬ Ｄ􀆰 ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ ( １０)ꎬ
Ｄ􀆰 ａｃｉｎａｃｉｆｏｒｍｅ (１１)ꎬ Ｄ􀆰 ｈａｎｃｏｃｋｉｉ (１２)ꎬ Ｄ􀆰 ａｄｕｎｃｕｍ ( １３)ꎬ Ｄ􀆰 ｌｉｎｄｌｅｙｉ ( １４)ꎬ Ｄ􀆰 ｌｉｔｕｉｆｌｏｒｕｍ ( １５)ꎻ １６ －３０ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｌｉｎｅｓ ｏｆ
Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ: ＮＹＴ１１ (１６)ꎬ ＮＹＴ１２ (１７)ꎬ ＮＹＴ１３ (１８)ꎬ ＮＹＴ１４ (１９)ꎬ ＮＹＴ１５ (２０)ꎬ ＮＹＴ２２ (２１)ꎬ ＮＹＴ３２ (２２)ꎬ ＮＹＴ３８ (２３)ꎬ
ＮＹＴ４５ (２４)ꎬ ＮＹＴ４７ (２５)ꎬ ＮＹＴ４９ (２６)ꎬ ＮＹＴ５１ (２７)ꎬ ＮＹＴ５２ (２８)ꎬ ＮＹＴ５６ (２９)ꎬ ＮＹＴ５７ (３０)ꎻ Ｍ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ.
Ｂａｎｄｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ ｗｅｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ.
图 １　 引物 ＤＭ１２１扩增的微卫星等位基因聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ａｌｌｅｌｅｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ＤＭ１２１
４０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
表 ５　 石斛 ＳＳＲ引物的特性
Ｔａｂｌｅ ５　 Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
正向引物
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５􀆳－３􀆳)
反向引物
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５􀆳－３􀆳)
重复基序
Ｒｅｐｅａｔ ｍｏｔｉｆ
预期大小
Ｅｘｐｅｃｔｅｄ
ｓｉｚｅ
(ｂｐ)
实际大小
Ｓｉｚｅ
(ｂｐ)
等位
基因数
Ａｌｌｅｌｅ
Ｎｏ.
转移率
Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｒａｔｅ
ＤＭ２ ＧＡＧＴＣＧＴＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＴＴＧＴ ＡＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＴＡＴＧＴＣＣＧＴＡＴ (ＡＧＴＣＧ)４ ２７６ ２７６~３１０ ３ １００.０％
ＤＭ３ ＣＴＣＣＧＧＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＴＧＣ ＴＣＡＣＴＴＧＣＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＣ (ＴＣ)１３ １７８ １７８~２００ ２ １００.０％
ＤＭ４ ＧＧＣＧＴＣＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＡＧＴＴ ＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣＣＣＡＡＴ (ＡＴＧＣＧＡ)４ ２３３ ６００~７００ ３ ８４.４％
ＤＭ５ ＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧＴＧＡＴＴＡＣＣＧＴＴ ＡＴＧＣＴＡＴＡＣＣＡＧＴＣＡＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣ (ＣＴ)１９ ２４３ ２４３~２９０ ６ ９３.８％
ＤＭ６ ＧＧＧＧＡＧＧＧＴＴＧＣＡＡＡＴＡＴＧ ＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＡＧＴＡＡＴＣＡＣ (ＣＴ)２６ ２５７ ２５７~２８０ ５ ７５.０％
ＤＭ７ ＡＡＡＧＣＧＴＣＡＡＴＡＡＧＧＧＡＡＣＴＡＡＣＣ ＣＡＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＧ (ＡＡＧ)８ ２５０ ２５０~２９０ ５ ８１.３％
ＤＭ８ ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡ ＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡ (ＡＧ)１８ ２８６ ２８０~３００ ６ ９６.９％
ＤＭ９ ＴＣＡＡＴＣＴＧＡＴＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＧＣＴ ＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡ (ＧＣＴ)７ １４２ １４０~１６０ ４ ９６.９％
ＤＭ３４ ＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＣＧＴＡＴＣＣＡＣ ＧＣＣＴＡＧＣＣＴＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＣＣＴ (ＣＡＧ)８ ２４８ ２１０~２５０ ４ ８４.４％
ＤＭ３６ ＴＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＡＴＴＴＡＣＡＴＡＧＴＧ ＧＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＴＴＣＡ (ＣＴＴ)１０ ２８０ ２６０~２９０ ４ ７８.１％
ＤＭ４５ ＴＡＴＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＧＧＡ ＴＡＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＡＡ (ＧＴ)８３ ２０８ ２００~３００ ４ ２５.０％
ＤＭ５９ ＣＴＡＡＡＴＧＴＧＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＴＧ ＧＧＧＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＣＡＡＧＣＴ (ＧＴ)３２ １５４ １５４~１６５ ２ １００.０％
ＤＭ６０ ＧＡＴＣＡＴＧＴＴＡＴＡＧＧＧＴＴＧＧＡＡＡＴ ＡＡＡＡＧＡＣＴＴＧＧＣＴＡＡＧＡＡＧＴＡＣＡＡ (ＧＴ)１７ ２３０ ２００~２３０ ２ １８.８％
ＤＭ６８ ＡＧＣＡＴＴＴＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＴＧＡＴＣ ＡＴＴＧＴＣＣＴＣＧＣＣＧＡＴＡＴＧＡＧＴＡ (ＣＴ)１６(ＣＡ)２０ １９７ １９０~２３０ ４ １００.０％
ＤＭ７６ ＴＣＡＡＡＴＴＧＡＡＴＧＴＡＡＣＴＡＡＴＣＣＣＴ ＡＡＴＣＡＡＡＴＣＧＡＣＴＴＡＡＣＡＴＧＧＴＴＡ (ＣＡ)２０ ２４６ ２４６~２５６ ２ ２８.１％
ＤＭ８１ ＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣＧＡＴＡＴＧＣＴＧ ＴＣＧＧＣＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＧ (ＧＡ)３１ １０７ １００~１１５ ２ １００.０％
ＤＭ８５ ＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＧＡＣＡＧＣ ＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＧＡＴＣＣＴＣ (ＴＧ)２６ １８０ ２９０~３５０ ４ ７５.０％
ＤＭ１１２ ＣＴＧＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＴ ＧＡＣＣＧＡＡＣＡＣＣＴＴＡＧＡＣＣＴＡＴＴＴＴ (ＡＣ)１０ ２５５ ２４０~２６０ ４ ７１.９％
ＤＭ１１３ ＣＴＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＴＴＣＴＴＡＧＣ ＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＡＣＴＡＧ (ＡＧＡＴ)８ １５０ １５０~２１０ ６ ８１.３％
ＤＭ１１８ ＴＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＣ ＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＧＡ (ＣＴＴ)７ ９９ ９０~１１０ ３ ７５.０％
ＤＭ１１９ ＧＧＴＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＡＴＡＧ ＣＡＣＡＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴＡＡＧＧ (ＧＡ)２１ １１１ ８０~１２０ ６ ９３.８％
ＤＭ１２０ ＡＡＡＧＡＴＧＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴ ＧＣＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡ (ＡＣ)１４ １２６ ８０~１３０ ７ ９６.９％
ＤＭ１２１ ＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＧＣＧＧＴＣＧＴＴ ＡＡＡＧＣＡＡＣＡＡＴＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＣ (ＧＡＧ)７ １６１ １４０~１８０ ８ ９６.９％
ＤＭ１２２ ＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＣＡＴＧＧＡ ＡＧＴＣＧＣＣＴＴＡＧＡＴＧＧＴＴＴＧＧＴ (ＡＣＡ)７ ２６９ ２６９ １ ６.３％
ＤＭ１２３ ＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＴＧ ＡＴＣＡＧＴＡＴＣＣＡＣＡＡＣＡＴＴＴＡ (ＴＴＧ)９ １８４ １８０~２１０ ４ １００.０％
ＤＭ１２５ ＴＣＡＴＴＡＧＧＧＣＡＣＴＴＧＡＴＴＡＣＴＴＡＣＡ ＡＴＴＣＴＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＣ (ＡＧＡ)９ ２２２ ２１０~２３０ ４ ９６.９％
ＤＭ１３７ ＣＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＴＴＴＧ ＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＡＡＧＡＧＣＣ (ＣＴＴ)９ １５２ １３０~１６０ ４ １００.０％
ＤＭ１４１ ＧＧＣＡＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＡ ＧＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴ (ＡＡＴＡ)５ ２１９ ２１０~２４０ ４ ８１.３％
ＤＭ１４２ ＧＧＣＡＣＴＡＴＴＣＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＡ ＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴ (ＴＡＴＡＴ)４ ２０７ ２２０~２５０ ５ ９０.６％
ＤＭ１６５ ＣＣＡＴＣＧＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＣＴＧＴＴ ＧＣＧＴＡＧＣＧＴＡＴＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＡＡ (ＧＧＣ)５ ２５７ ２３０~２８０ ４ ９６.９％
ＤＭ１６９ ＣＧＡＡＡＧＡＴＧＣＧＧＡＣＣＡＧＡ ＡＴＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＴＧＡＧＧＴＡＴ (ＡＧ)８ ２６３ ２６３~３５０ ６ ６８.８％
ＤＭ１７１ ＣＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＡＧＴＣＣＴＣＡ ＴＧＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡ (ＣＡ)８ １８８ １８８~２０５ ３ ２１.９％
ＤＭ１７２ ＣＡＴＣＣＴＧＧＴＴＡＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧ ＡＡＴＡＣＴＴＧＴＧＧＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＴＡ (ＧＴ)８ １０８ １０８~１５０ ４ ３４.４％
ＤＭ１７８ ＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡ ＣＧＣＣＡＣＣＣＴＡＣＡＣＴＡＡＧＡＡＡＡ (ＣＡ)９ ２９０ ２９０~３１０ ３ １００.０％
ＤＭ１８０ ＡＴＣＧＧＧＣＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＴＡＣ ＣＴＧＴＣＧＧＴＡＧＧＡＴＡＡＡＧＣＡＡＡＡ (ＣＡ)９ １２５ １２５~１３５ ３ ７８.１％
ＤＭ１８２ ＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＧＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＡ ＴＴＡＣＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＡＣＴＡＡＧＡＡＡＴ (ＡＣ)９ ２３９ ２２０~２３９ ２ ４３.８％
ＤＭ１８３ ＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＡＣＧＡＡＧＡＧＣＣＡＧ ＴＧＡＴＴＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＴ (ＡＡＧ)６ １３９ １３９~１５０ ２ ４３.８％
ＤＭ１８４ ＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＴＧＡＧＣ ＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＣＡＧＴ (ＴＣＴ)６ １６２ １６２~１８０ ３ ８７.５％
ＤＭ１８６ ＧＣＣＴＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＴＣＴ ＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣ (ＴＴＣ)６ ２３２ １８０~２８０ ７ １００.０％
ＤＭ１８８ ＡＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＧＡＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧ ＡＴＧＴＴＴＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡ (ＡＧＡ)５ １８３ ２９０~３１０ ３ ５０.０％
ＤＭ１８９ ＣＣＡＴＴＣＣＧＣＴＧＣＴＡＴＡＡＣＣＴＧ ＡＧＣＡＧＧＣＣＧＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＣ (ＧＣＧ)５ ２９１ ２８０~３００ ３ ９３.８％
ＤＭ１９３ ＧＧＡＣＧＣＡＣＣＡＴＴＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣ ＧＴＣＴＧＴＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＣＧＡＡＡＧＣ (ＴＴＣ)５ １５５ １５５~１７０ ３ ５９.４％
ＤＭ１９４ ＧＧＡＣＴＣＡＣＴＧＡＡＡＧＣＧＣＡＡＣＡ ＡＴＴＧＡＡＧＧＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＴ (ＣＴ)８ ２１０ ２００~２４０ ５ ５９.４％
ＤＭ１９５ ＧＣＧＴＧＧＡＡＡＧＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＧＡ ＡＡＧＴＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣ (ＧＡ)８ １２３ １２０~１５０ ５ ５６.３％
ＤＭ１９８ ＡＡＡＡＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡ ＧＡＴＧＡＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣ (ＴＣＴ)６ ２５８ ２１０~２７０ ４ １００.０％
ＤＭ１９９ ＧＴＧＴＣＴＧＣＣＣＧＡＧＴＡＡＡＡＧＣ ＡＣＧＴＣＡＣＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＴＣＴ (ＴＧＣ)６ ２１６ ２１６~２３５ ４ １００.０％
ＤＭ２００ ＧＴＣＡＧＡＡＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴ ＧＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧＡＧＣＣ (ＴＧＧ)６ ９８ ９８~１２０ ５ ４３.８％
５０５　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邱道寿等: 石斛 ＳＳＲ标记的开发及可转移性分析
表 ６　 ＳＳＲ引物在 ３２种石斛中的可转移性
Ｔａｂｌｅ ６　 Ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｍｏｎｇ ３２ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
石斛种类编号　 　 Ｎｏ􀆰 ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０ ２１ ２２ ２３ ２４ ２５ ２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３１ ３２
ＤＭ２ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ３ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ４ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ５ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ６ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ７ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ８ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ９ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ３４ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ３６ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ４５ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ５９ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ６０ √ √ √ √ √ √
ＤＭ６８ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ７６ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ８１ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ８５ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１１２ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１１３ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１１８ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１１９ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１２０ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１２１ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１２２ √ √
ＤＭ１２３ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１２５ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１３７ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１４１ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１４２ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１６５ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１６９ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１７１ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１７２ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１７８ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８０ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８２ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８３ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８４ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８６ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８８ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１８９ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１９３ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１９４ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１９５ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１９８ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ１９９ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
ＤＭ２００ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √
转移率
Ｔｒａｎｓｆｅｒ
ｒａｔｅ(％)
８０.９ ９３.６ ８９.４ ６３.８ ８０.９ ８５.１ ７４.５ ８３.０ ６１.７ ７４.５ ８９.４ ８０.９ ７４.５ ７６.６ ５７.４ ７４.５ ７８.７ ７８.７ ６８.１ ７６.６ ７４.５ ８５.１ ７２.３ ９５.７ ６１.７ ７２.３ ７２.３ ６８.１ ５１.１ ８３.０ ８３.０ ６６.０
６０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
图 ２　 基于 ６０个铁皮石斛品系 ＳＳＲ数据生成的非加权配对组算术平均法(ＵＰＧＭＡ)聚类图
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｄｅｎｄｒｏｇｒａｍ ｗａｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅ
(ＵＰＧＭＡ) ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＳＲ ｄａｔａ ｏｆ ６０ ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ
　 　 为揭示石斛 ＳＳＲ 多态性的成因ꎬ 将引物
ＤＭ１２１在 ３个石斛种(Ｄ􀆰 ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ、 Ｄ􀆰 ｈａｎｃｏｃｋｉｉ、
Ｄ􀆰 ｃａｒｉｎｉｆｅｒｕｍ)和 ２ 个铁皮石斛品系中 (ＮＹＴ１５、
ＮＹＴ４９)的扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳回收
主带 ＤＮＡꎬ 随后进行测序 (图 １)ꎮ 结果表明ꎬ
ＤＭ１２１在 ＮＹＴ１５和 ＮＹＴ４９中的主带 ＤＮＡ序列仅
在 ＳＳＲ 位点上存在差异ꎬ 其中 ＮＹＴ４９￣２ 比
ＮＹＴ４９￣１ 增加 ３ 个 ＡＧＧ 基 序ꎬ ＮＹＴ１５ 则 比
ＮＹＴ４９￣１多出 ２ 个 ＡＧＧ 基序ꎮ 而 Ｄ􀆰 ｃａｒｉｎｉｆｅｒｕｍ、
Ｄ􀆰 ｃａｐｉｌｌｉｐｅｓ、 Ｄ􀆰 ｈａｎｃｏｃｋｉｉ 和 Ｄ􀆰 ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ(ＮＹＴ１５
和 ＮＹＴ４９)在 ＤＭ１２１位点上除了 ＳＳＲ重复次数差
异外ꎬ 其侧翼序列也存在差异ꎬ 包括两处插入缺失
( ＩｎＤｅｌꎬ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ)和三处碱基替换
(Ｃ￣Ｇ、 Ｇ￣Ａ和 Ａ￣Ｔ)(图 ３)ꎮ 上述结果说明铁皮石
斛品系间 ＳＳＲ 多态性由 ＳＳＲ 重复次数差异造成ꎬ
而石斛种间的多态性则与 ＳＳＲ 重复次数变动ꎬ 侧
翼序列的插入缺失和碱基替换有关ꎮ
３　 讨论
本研究从总长 ７９６５４３ ｂｐ 的 Ｕｎｉ￣ＤＮＡ 序列中
共搜索到 ２８３ 个 ＳＳＲ 位点ꎬ 平均每 ２８１４ ｂｐ 出现
一个 ＳＳＲꎮ 与水稻 (Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)、 高粱 ( Ｓｏｒ￣
ｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ)、 短柄草(Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｓｙｌｖａｔｉｃ￣
ｕｍ)等单子叶植物[１８]相比ꎬ 本研究中石斛 ＳＳＲ频
７０５　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邱道寿等: 石斛 ＳＳＲ标记的开发及可转移性分析
　 重复序列以虚线框标示ꎮ 点突变和插入缺失区用实线框标记ꎮ
　 Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｄａｓｈｅｄ ｂｏｘ. Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｄｅｌ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｒｅ ｍａｒｋｅｄ ｂｙ ｂｏｘ ｗｉｔｈ ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅ.
图 ３　 引物 ＤＭ１２１扩增的 ６条 ＳＳＲ与源自 ＤＮＡ序列(登记号: ＦＪ８２１１５７)的原始 ＳＳＲ的序列比对
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｘ ＳＳＲ ｂａｎｄｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＤＭ１２１
ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎａｌ ＳＳＲ￣ｄｅｒｉｖｅｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ.: ＦＪ８２１１５７)
率明显偏高ꎬ 这除了与石斛基因组序列特性有关
外ꎬ 还与 ＤＮＡ序列的组成有关ꎮ 用于开发 ＳＳＲ的
３３６４条 ＤＮＡ序列中有 ２１２条序列来自 ＳＳＲ富集文
库ꎬ 这些序列导致统计结果偏离正常水平ꎮ 剔除上
述 ２１２条 ＳＳＲ 序列ꎬ ＳＳＲ 出现频率为 １ / ６８８７ ｂｐꎬ
仍高于短柄草、 高粱ꎬ 但略低于水稻ꎬ 而与蝴蝶兰
(Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ａｍａｂｉｌｉｓ)相比ꎬ 石斛 ＳＳＲ 出现频
率稍高[１９]ꎮ
本研究供试的 ７６ 对 ＳＳＲ 引物中有 ２９ 对未能
有效扩增ꎬ 其原因可能是扩增区段存在较复杂的高
级结构ꎮ 在可扩增的 ４７ 对引物中ꎬ ２ 对扩增产物
片断大于预期长度ꎬ 由于这 ２ 对引物来自 ＥＳＴ 序
列ꎬ 推测其扩增产物包含内含子ꎮ 此外ꎬ 电泳检测
扩增产物还发现一些扩增产物存在多条电泳带的现
象ꎬ 由于本研究采用的退火温度较高ꎬ 其原因可能
是石斛基因组较复杂[２０]ꎬ 存在多个与引物同源的
序列ꎮ
近年来公共数据库中核酸序列的增加极大方便
了 ＳＳＲ标记的开发ꎮ 例如ꎬ 肖冬长等曾利用 Ｇｅｎ￣
Ｂａｎｋ中收录的石斛 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 序列开发了 ２１ 对
扩增效果良好的 ＳＳＲ引物[１５]ꎮ 但公共数据库 ＤＮＡ
序列的共享性常导致同一 ＳＳＲ 位点被不同研究团
队重复设计引物ꎮ 本文共发现 １２个石斛 ＳＳＲ位点
被重复设计引物ꎮ 为此ꎬ 在做好序列拼接的基础
上ꎬ 应将 ＳＳＲ￣ＤＮＡ 序列与前人开发的 ＳＳＲ 引物
进行仔细比对ꎬ 剔除已开发引物的 ＤＮＡ 序列ꎬ 避
免对同一位点重复设计引物ꎮ
本研究利用新开发的 ＳＳＲ引物扩增 ３２个石斛
种ꎬ 不仅方便新标记在所检测石斛种中的直接利
用ꎬ 同时还揭示 ＳＳＲ 在石斛种间具有较高可转移
性(７５􀆰 ９％)ꎮ 一般来说ꎬ 植物 ＳＳＲ 在属间可转移
性极低ꎬ 但在属内具有较高的可转移性ꎬ 但不同物
种间可转移性仍存在一定差异[２１－２４]ꎮ 显然ꎬ ＳＳＲ
在石斛属内较高的可转移性极大地减轻了引物开发
的工作量ꎬ 同时为研究种间进化关系提供了一条有
效的途径ꎮ 除了可转移性外ꎬ 本研究开发的 ＳＳＲ
在石斛种间和种内均具有高度的多态性ꎬ 且聚类分
析结果与表型分类相似ꎬ 说明 ＳＳＲ对石斛具有良好
的鉴别能力ꎬ 可作为品种资源鉴定的一个辅助工具ꎮ
参考文献:
[ １ ] 　 包雪声ꎬ 顺庆生ꎬ 陈立钻. 中国药用石斛彩色图谱
[Ｍ] . 上海: 复旦大学出版社ꎬ ２００１: １－４０.
[ ２ ] 　 陈心启ꎬ 吉占和. 中国兰花全书[Ｍ] . 北京: 中国林
业出版社ꎬ １９９８.
[ ３ ] 　 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(２０１０ 版ꎬ
一部) [Ｍ] . 北京: 中国医药科技出版社ꎬ ２０１０:
８７ꎬ ２６６.
[ ４ ] 　 淳泽. 药用石斛的资源危机与保护对策[Ｊ] . 资源开
发与市场ꎬ ２００５ꎬ ２１(２): １３９－１４０.
[ ５ ] 　 蒋波ꎬ 詹源庆ꎬ 黄捷. 金钗石斛濒危原因及其野生
资源保护[Ｊ] . 中国野生植物资源ꎬ ２００５ꎬ ５: ３７－
３９.
[ ６ ] 　 何涛ꎬ 淳泽ꎬ 罗傲雪ꎬ 范益军ꎬ 刘静ꎬ 胡明珠. 四
８０５ 植 物 科 学 学 报 第 ３１卷　
川石斛野生资源及其保护研究[Ｊ] . 应用与环境生
物学报ꎬ ２００８ꎬ ５: ７１０－７１５.
[ ７ ] 　 李耀亭ꎬ 陈乃富ꎬ 邓辉ꎬ 刘明珍ꎬ 何祥林. 霍山石
斛产业化发展的问题与对策 [ Ｊ] . 生物学杂志ꎬ
２００９ꎬ ０２: ６７－６９.
[ ８ ] 　 Ｙｕｅ Ｇ Ｈꎬ Ｌａｎ￣Ｃｈａｎ Ｌ Ｔꎬ Ｈｏｎｇ Ｙ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ( ＳＳＲ) ｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ
[Ｊ] . Ｍｏｌ Ｅｃｏｌ Ｒｅｓｏｕｒꎬ ２００６ꎬ ６: ８３２－８３４.
[ ９ ] 　 Ｇｕ Ｓꎬ Ｄｉｎｇ Ｘ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｄｅｎ￣
ｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅꎬ ａｎ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ ｈｅｒｂ ｅｎｄｅｍｉｃ
ｔｏ Ｃｈｉｎａ [ Ｊ] . Ｍｏｌ Ｅｃｏｌ Ｎｏｔｅｓꎬ ２００７ꎬ ７: １１６６ －
１１６８.
[１０] 　 Ｆａｎ Ｗ Ｊꎬ Ｌｕｏ Ｙ Ｍꎬ Ｌｉ Ｘ Ｘꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ
Ｈｏｏｋꎬ ａｎ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｅｎｄｅｍｉｃ ｈｅｒｂ[Ｊ] .
Ｍｏｌ Ｅｃｏｌ Ｒｅｓｏｕｒꎬ ２００９ꎬ ９: ３７３－３７５.
[１１] 　 谢明璐ꎬ 侯北伟ꎬ 韩丽ꎬ 马艳红ꎬ 丁小余. 珍稀铁
皮石斛 ＳＳＲ标记的开发及种质纯度鉴定[Ｊ] . 药学
学报ꎬ ２０１０ꎬ ０５: ６６７－６７２.
[１２] 　 Ｙｕａｎ Ｙ Ｈꎬ Ｈｏｕ Ｂ Ｗꎬ Ｘｕ Ｈ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｔｈｙｒｓｉｆｌｏ￣
ｒｕｍ ｏｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｍａｒｋｅｔ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉ￣
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ [ Ｊ] . Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ
Ｂｕｌｌꎬ ２０１１ꎬ ３４: １７９４－１８００.
[１３] 　 郑基阳ꎬ 陈乃富ꎬ 王晖ꎬ 高鹏ꎬ 邵剑文ꎬ 朱国萍.
霍山石斛微卫星标记的筛选及遗传多样性分析[Ｊ] .
中国中药杂志ꎬ ２０１１ꎬ ２１: ２９２６－２９３１.
[１４] 　 Ｈｏｕ Ｂꎬ Ｔｉａｎ Ｍꎬ Ｌｕｏ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘ ｓｉｔｕ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ
ｔｈｅ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ ( Ｏｒｃｈｉ￣
ｄａｃｅａｅ ) ｕｓｉｎｇ ｎｅｗ ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ
ｍａｒｋｅｒｓ[ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌꎬ ２０１２ꎬ ２９８: １４８３－
１４９１.
[１５] 　 Ｘｉａｏ Ｄꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚꎬ Ｇｕａｎ Ｙ. Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ
ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｒｏｍ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ
ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ[Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｕｌｌꎬ ２０１２ꎬ ７: ８８－９２.
[１６] 　 Ｍａｎ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｙꎬ Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ａｒｇｕｔａ (Ａｃｔｉｎｉｄｉ￣
ａｃｅａｅ) ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＮＣＢＩ ｄａｔａ ｐｌａｔｆｏｒｍ[Ｊ] . Ａｍ
Ｊ Ｂｏｔꎬ ２０１１ꎬ ９８: ｅ３１０－３１５.
[１７] 　 Ｗｅｉｒ Ｂ Ｓ. Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ: Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｉｓ￣
ｃｒｅｔｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ [Ｍ] . Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄꎬ
Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ: Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄꎬ
１９９０: ４４５.
[１８] 　 Ｓｏｎａｈ Ｈꎬ Ｄｅｓｈｍｕｋｈ Ｒ Ｋꎬ Ｓｈａｒｍａ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅ￣
ｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏ￣
ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ: ａｎ ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｍａｒｋｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔ ｉｎ Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ[Ｊ] . ＰＬｏＳ Ｏｎｅꎬ ２０１１ꎬ ６:
ｅ２１２９８.
[１９] 　 张君毅ꎬ 陈瑞凤. 蝴蝶兰 ＥＳＴ￣ＳＳＲｓ分析[Ｊ] . 植物
生理学通讯ꎬ ２０１０ꎬ ４６(６): ５５９－５６３.
[２０] 　 王立安ꎬ 徐晋麟. 石斛属的染色体数Ⅰ. １０ 种[Ｊ] .
武汉植物学研究ꎬ １９８９ꎬ ７(２): １１２－１１４ꎬ ２０９－
２１０.
[２１] 　 Ｃｈａｎｄｒａ Ａꎬ Ｔｉｗａｒｉ Ｋ Ｋꎬ Ｎａｇａｉｃｈ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ
ｆｒｏｍ ｔｒｏｐｉｃａｌ ｆｏｒａｇｅ Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ￣ｓｐｅｃｉｅｓ
ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ [ Ｊ ] . Ｇｅｎｏｍｅꎬ ２０１１ꎬ ５４: １０１６ －
１０２８.
[２２] 　 Ｗａｎｇ Ｈꎬ Ｗａｌｌａ Ｊ Ａꎬ Ｚｈｏｎｇ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｖｅｌｏｐ￣
ｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ￣ｓｐｅｃｉｅｓ / ｇｅｎｅｒａ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｕｓｉｎｇ ４５４ ｇｅ￣
ｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｃｈｏｋｅｃｈｅｒｒｙ (Ｐｒｕｎｕｓ ｖｉｒｇｉｎｉ￣
ａｎａ Ｌ.) [ Ｊ ] . Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐꎬ ２０１２ꎬ ＤＯＩ: １０.
１００７ / ｓ００２９９￣０１２￣１３１５￣ｚ.
[２３] 　 Ｌｅｓｓｅｒ Ｍ Ｒꎬ Ｐａｒｃｈｍａｎ Ｔ Ｌꎬ Ｂｕｅｒｋｌｅ Ｃ Ａ. Ｃｒｏｓｓ￣
ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＳＳＲ ｌｏｃｉ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ
ｔｒａｎｓｃｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｌｏｄｇｅｐｏｌｅ ｐｉｎｅ [ Ｊ] .
Ｍｏｌ Ｅｃｏｌ Ｒｅｓｏｕｒꎬ ２０１２ꎬ １２: ４４８－４５５.
[２４] 　 Ｌｉａｎｇ Ｘꎬ Ｃｈｅｎ Ｘꎬ Ｈｏｎｇ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ＥＳＴ￣
ｄｅｒｉｖｅｄ ＳＳＲ ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｐｅａｎｕｔ ( Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙ￣
ｐｏｇａｅａ Ｌ.) ａｎｄ Ａｒａｃｈｉｓ ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓ [ Ｊ] . ＢＭＣ
Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌꎬ ２００９ꎬ ２４: ３５.
(责任编辑: 王豫鄂)
９０５　 第 ５期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 邱道寿等: 石斛 ＳＳＲ标记的开发及可转移性分析