全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(4): 589598 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31161140346)和引进国际先进农业科学技术计划(948计划)重大国际合作项目(2011-G3)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何中虎, E-mail: zhhecaas@163.com, Tel: 010-82108547
Received(收稿日期): 2012-10-21; Accepted(接受日期): 2013-01-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130128.1000.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00589
普通小麦 TaDep1基因克隆与特异性标记开发
刘亚男 1 夏先春 1 何中虎 1,2,*
1中国农业科学院作物科学研究所/国家小麦改良中心, 北京 100081; 2 CIMMYT中国办事处, 北京 100081
摘 要: OsDep1 (dense and erect panicle 1)控制水稻产量性状, 影响穗长、直立性和着粒密度。根据水稻 OsDep1基因
序列, 采用同源克隆技术克隆了普通小麦第 5 同源群染色体上的 TaDep1 基因, 它包含 5 个外显子和 4 个内含子, 与
水稻 OsDep1 基因结构相似。TaDep1-A1、TaDep1-B1 和 TaDep1-D1 的编码序列长度分别为 918、888 和 900 bp, 编
码 305、295和 299个氨基酸残基。在普通小麦品种中检测到 5个 TaDep1-A1等位变异、4个 TaDep1-B1等位变异和
2 个 TaDep1-D1 等位变异。根据 TaDep1-A1 和 TaDep1-B1 位点不同等位变异间的 SNP 和 InDel, 开发了 3 对显性互
补标记和 1个共显性标记, 可以准确鉴别不同等位基因。共显性标记 dep19是根据 TaDep1-B1第 5外显子一个 30 bp
的 InDel开发的, 可准确区分 TaDep1-B1c与 TaDep1-B1a、TaDep1-B1b和 TaDep1-B1d。用这些标记对 406份小麦品
种进行检测, 不同基因型的千粒重、株高、穗长、小穗数和穗节间均差异不显著, 说明 TaDep1基因与我国现有小麦
品种的产量性状相关不显著。
关键词: 普通小麦; 直立密穗基因; 等位变异; 基因特异性标记
Characterization of Dense and Erect Panicle 1 Gene (TaDep1) Located on
Common Wheat Group 5 Chromosomes and Development of Allele-Specific
Markers
LIU Ya-Nan1, XIA Xian-Chun1, and HE Zhong-Hu1,2,*
1 Institute of Crop Sciences / National Wheat Improvement Center, Beijing 100081, China; 2 CIMMYT China Office, c/o Chinese Academy of Agri-
cultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Dense and erect panicle 1 (OsDep1) gene is an important QTL controlling yield associated traits such as panicle length,
erect type, and grain density in rice. In the present study, full-length genomic DNA sequences of TaDep1 on common wheat group
5 chromosomes were cloned by homologous cloning approach based on the sequences of rice OsDep1. TaDep1 has five exons and
four introns, similar to that of rice OsDep1. The coding sequences of TaDep1-A1, TaDep1-B1, and TaDep1-D1 were 918, 888, and
900 bp, encoding polypepetides of 305, 295, and 299 amino acids, respectively. Five allelic variants on TaDep1-A1 locus, four on
TaDep1-B1 locus, and two on TaDep1-D1 locus were identified. Three pairs of complementary dominant markers and one
codominant marker were developed based on the sequence polymorphisms presented in allelic variants of TaDep1-A1 and Ta-
Dep1-B1. The codominant marker dep19, which can accurately discriminate the allelic variants of TaDep1-B1c from those of Ta-
Dep1-B1a, TaDep1-B1b, and TaDep1-B1d, was developed from a 30 bp InDel of different allelic variants at the fifth exon of Ta-
Dep1-B1. No significant association was found among the yield associated traits such as thousand-kernel weight, plant height,
panicle length, spikelet number and spikelet spacing in 406 cultivars, indicating that these genes have no significant effect on the
yield-related traits in current Chinese wheat cultivars.
Keywords: Common wheat (Triticum aestivum L.); Dense and erect panicle1 (Dep1) gene; Allelic variation; Allele-specific
markers
随着人口增加和消费水平的提高, 小麦需求仍
在继续增加, 但进一步扩大种植面积的可能性很小,
因此高产更高产仍是我国小麦育种最基本、最重要
的目标[1]。分子标记辅助选择用于作物育种研究已
有 20多年的历史, 小麦育种中常用的分子标记包括
连锁标记(SSR 等)和依据基因序列开发的功能标记
590 作 物 学 报 第 39卷
又称基因标记(STS等)[1]。功能标记可以区分同一位
点的不同等位基因, 是育种家进行分子育种的理想
标记。迄今为止, 已经开发并用于小麦育种的功能
标记有 97个, 可检测加工品质、农艺性状和抗病性
相关的 30个位点的 93个等位基因[2]。
小麦单位面积产量由穗数、穗粒数和千粒重共
同决定。产量三因素构成受区域、栽培条件和品种
特性等的影响 , 增加穗粒数往往会导致穗数减少 ,
而千粒重的增加则是相对独立的 [3], 它主要取决于
特定地区的灌浆期和品种的灌浆速度等。产量是典型
的数量性状, 在小麦 21 个连锁群上都定位到相应位
点[4-7], 但与产量性状紧密连锁的标记屈指可数。在产
量构成因素中, 千粒重受遗传特性的影响最大, 主要
表现为加性效应, 广义遗传力高达 59%~80% [8]。利
用分子标记已定位了一些千粒重的 QTL[7,9-12], 小麦
中与粒重有关的基因 TaSus2、TaGW2 和 TaCwi 已被
克隆, 已经开发功能标记并进行了验证[13-15]。
OsDep1 (dense and erect panicle 1)是一个控制
水稻产量性状的关键多效基因, 位于第 9 染色体长
臂上[16], 可以解释穗弯曲表型变异的 41.7%[17], 调
控穗长、分枝数、籽粒数、着粒密度、粒重和株高,
进而影响产量 [17-20]。Kong 等 [16]首次报道了水稻
OsDep1 基因的染色体定位, Yan 等[17]也将 OsDep1
定位在相同的第 9染色体上, Zhou等[18]和Wang等[19]
分别对 OsDep1 基因进行图位克隆并对其基因结构及
功能进行了分析。Huang等[20]克隆了 OsDep1基因, 并
对其在水稻根、茎、叶、叶鞘、花序分生组织和花序
中的表达, 对穗型结构和产量的影响进行了研究; 同
时克隆了直立穗型品种中的 Osdep1 基因, 与 OsDep1
基因相比在第 5外显子有 637 bp的缺失和 12 bp的插
入, 影响了基因的表达, 进而影响水稻穗型结构。
OsDep1 是一个膜蛋白基因 , 其表达蛋白位于
细胞膜上, 由 5 个外显子和 4 个内含子组成, 编码
426 个氨基酸残基 , 与人类的角蛋白关联蛋白 5~4
家族同源。这个基因包括 3 个 VWFC 结构域(氨基
酸残基 99~153、276~316 和 339~385)、1 个跨膜结
构域(氨基酸残基 88~106)和 1 个 4-二硫化碳核心区
域(氨基酸残基 153~166) [18-20]。Osdep1是一个功能
性获得突变, Osdep1 在第 5 外显子的 InDel(637 bp
缺失和 12 bp的插入), 编码的蛋白产物在 C端缺失
了 231 个氨基酸, 包括 2 个 VWFC 功能域[18-20]。
Osdep1 产生一个类似磷脂酰乙醇胺结合蛋白的区
域, 与 GS3基因 N末端功能具有同源性[21]。Osdep1
能增强分生组织的活性、缩短花序节间和提高细胞
增殖, 引起稻穗变短、直立, 水稻植株出现半矮化、
降低穗颈长度并使穗着粒密度和枝梗数目增加、穗
粒数增多, 从而增产 15.0%~20.0% [20,22]。大麦、普
通小麦和乌拉尔图小麦中 DEP1 基因都有 C末端的
缺失, 下调 TaDep1使小麦穗子变长, 小穗密度下降
和小穗数减少, 说明功能突变发生在小麦和大麦系
的分化之前[20]。
图位克隆是分离基因的有效方法[23], 但普通小
麦为异源六倍体 , 基因组庞大 , 重复序列多 , 直接
进行图位克隆难度很大。利用比较基因组学方法 ,
同源克隆产量相关基因并开发功能标记, 可为分子
标记辅助育种提供可靠的标记[14-15,24-26]。迄今为止,
采用这一方法已克隆小麦许多重要农艺性状和品质
性状基因, 开发了功能标记并在小麦育种中应用[2]。
本研究旨在采用同源克隆技术克隆普通小麦 TaDep1
基因, 分析其等位变异, 开发相应的基因特异性标
记, 明确不同等位基因在中国小麦品种中的分布规
律, 为小麦高产育种提供信息。
1 材料与方法
1.1 材料与性状测定
中国春、PH82-2、内乡 188、中优 9507和 CA9632
用于 TaDep1 基因克隆及测序。一套中国春缺体–四
体系和双端体系由澳大利亚悉尼大学McIntosh教授
提供。
2001—2002 和 2002—2003 年度在河南安阳中国
农业科学院棉花研究所实验站种植北方和南方冬麦区
的 196 份小麦品种。随机取 200 粒种子称重, 测定千
粒重, 2次重复。2009—2010年度在中国农业科学院作
物科学研究所北京试验站种植北方冬麦区的 210份育
成品种或高代系。随机选取 10株, 测定其株高、穗长、
小穗数和穗节间; 随机取 200粒种子称重, 2次重复。
对所有性状数据均取每个基因型的平均值, 利用 SAS
软件Windows Version 9.0进行统计分析。
1.2 DNA提取
混合剪取每个品系叶片 , 采用澳大利亚 Triti-
carte公司提供的 CTAB法提取小麦基因组 DNA。用
单籽粒法提取品种基因组DNA, 每个品种提取 3粒,
用于开发标记的定位与验证。
1.3 Dep1基因克隆及序列分析
根据小麦品种中国春的 TaDep1 mRNA 全长序
列(GenBank登录号为 FJ039902)和水稻OsDep1基因
第 4期 刘亚男等: 普通小麦 TaDep1基因克隆与特异性标记开发 591
gDNA (GenBank 登录号为 FJ039904)和 cDNA 序列
(GenBank 登录号为 FJ039905)设计引物[20]。以中国
春基因组 DNA为模板扩增小麦 TaDep1基因全长序
列。根据拼接序列的特异位点设计引物, 用中国春
缺体–四体系 N5A-T5B、N5B-T5D和 N5D-T5A进行
定位, 确定扩增片段的染色体位置。
在 MJ Research PTC-200 PCR 扩增仪上进行
PCR, PCR体系 20 µL, 含模板DNA 50 ng, Taq酶 1 U,
上、下游引物(5 μmol L–1)各 1.0 μL, dNTP (25 μmol
L–1) 0.2 μL, 10×PCR缓冲液 2 μL, 用无菌蒸馏水补
充反应体系至 20 μL。PCR程序为 95℃预变性 5 min;
95℃变性 45 s, 退火 30 s, 延伸 1.5 min, 35个循环;
72℃终延伸 10 min, 4℃保温。退火温度和延伸时间
依据引物和扩增片段长度而不同。PCR 扩增产物经
2.0%琼脂糖凝胶电泳分离 , 将目标片段挖胶回收 ,
用 pMD18-T 载体进行克隆, 由生工生物工程(上海)
有限公司测序。
克隆千粒重和穗部性状有差异的 5 个普通小麦
品种的 TaDep1 基因序列全长。引物的 PCR 扩增和
DNA序列测定均重复 3次, 确保核苷酸序列的准确
性。每个品种至少测定 18个克隆, 以确定 TaDep1
等位基因序列。DNA序列全长和氨基酸残基等位变
异采用 DNAMAN 软件分析。根据 TaDep1 全长和
mRNA 序列(FJ039902)确定内含子位置, 用中国春
缺体-四体系 N5A-T5B、N5B-T5D和 N5D-T5A进行
定位。
1.4 特异性标记开发
根据 5 个普通小麦品种 TaDep1-A1 和 TaDep1-
B1等位基因的序列差异设计 3对显性互补标记和 1
个共显性标记, 用 406份小麦品种进行验证。
2 结果与分析
2.1 TaDep1基因克隆及序列分析
根据水稻 OsDep1基因(FJ039904) DNA序列全
长、cDNA序列(FJ039905)和普通小麦中国春 TaDep1
mRNA全长序列(FJ039902)设计 2对引物, 并扩增中
国春基因组 DNA, 经测序、比对、分析和拼接获得
3 条不同长度的同源序列。根据序列差异设计 6 对
特异引物, 用中国春缺-四体 N5A-T5B、N5B-T5D
和 N5D-T5A将其分别定位在 5A、5B和 5D染色体
上(表 1和图 1) , 用中国春双端体系 DT5AS和
DT5AL 将 TaDep1-A1基因定位于 5AL。
表 1 克隆 TaDep1基因与染色体定位的引物序列
Table 1 Primers used for cloning TaDep1genes and their chromosomal locations
引物
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
染色体定位
Chromosomal location
扩增区域
Amplication region (bp)
PCR产物的长度
Size of PCR fragment (bp)
F: CGGTGGTGGTGCTGGAG 5A 14–1812 1808 dep1a1
R: CAAAGCAAGGAATTAGACTAGTGAC
F: GCCTGTTTCTGTTTTCTTTATCAAC 5A 1434–3108 1675 dep1a2
R: GCATCGGCATCCGTCTG
F: CGGTGGTGGTGCTGGAG 5B 14–2403 2390 dep1b1
R: ACAGATGAATACTGCGTCCCTAC
F: TCACTTTTGAGTCACTATTTTGGG 5B 1296–3025 1730 dep1b2
R: GCATCGGCATCCGTCTG
F: CGGTGGTGGTGCTGGAG 5D 14–1919 1906 dep1d1
R: ATTGTACACGGATATTAGCAGGTAG
F: ATCCATAAACGATAATGCTCTCG 5D 1688–2940 1253 dep1d2
R: GCATCGGCATCCGTCTG
普通小麦 TaDep1基因由 5个外显子和 4个内含
子组成, 与水稻OsDep1基因结构相似, 内含子的剪
接位点结构为典型的 GT-AG型。中国春 5A、5B和
5D 染色体上的 TaDep1 基因组 DNA 序列起始密码
子至终止密码子全长为 3141、3058 和 2973 bp, 编
码序列长度为 918、888和 900 bp, GC含量在 60%
以上, 编码 305、295和 299个氨基酸残基。
中国春、PH82-2、内乡 188、中优 9507和 CA9632
5A 染色体上的 TaDep1-A1 等位变异分别命名为
TaDep1-A1a、TaDep1-A1b、TaDep1-A1c、TaDep1-A1d
592 作 物 学 报 第 39卷
和 TaDep1-A1e, 有 11 个 SNP 和 1 个 InDel, 其中 2
个 SNP 位于外显子(表 2)。TaDep1-A1a 与 TaDep1-
A1b的 DNA序列只在 2019 bp有 1个 SNP的差异,
cDNA和氨基酸序列相同。TaDep1-A1c、TaDep1-A1d
和 TaDep1-A1e的 cDNA和氨基酸序列一致, 差异存
在于内含子区。TaDep1-A1a、TaDep1- A1b与 TaDep1-
A1c、TaDep1-A1d和 TaDep1-A1e相比在第 4外显子
区存在 1个 SNP为中性突变, 由色氨酸(Trp)变成半
胱氨酸(Cys), 第 5 外显子有 1 个 SNP 为中性突变,
脯氨酸(Pro)变成亮氨酸(Leu)。
图 1 利用中国春缺体-四体系对扩增 TaDep1全长的引物进行染色体定位
Fig. 1 Chromosomal localization of primers amplifying TaDep1 full length sequence using nullisomic–tetrasomic lines of Chinese
Spring (CS)
M: DNA ladder DL2000; 泳道 a、d、g、j、m和 p: CS N5A-T5B; 泳道 b、e、h、k、n和 q: CS N5B-T5D;
泳道 c、f、i、l、o和 r: CS N5D-T5A。
M: DNA ladder DL2000; Lanes a, d, g, j, m, and p: CS N5A-T5B; Lanes b, e, h, k, n, and q: CS N5B-T5D;
Lanes c, f, i, l, o, and r: CS N5D-T5A.
表 2 普通小麦 TaDep1等位变异及其特征
Table 2 Common wheat TaDep1 allelic variants and its
characteristics
等位基因
Allele
基因全长
Full length (bp)
SNP InDel
TaDep1-A1a 3141
TaDep1-A1b 3141 11 1
TaDep1-A1c 3142
TaDep1-A1d 3142
TaDep1-A1e 3142
TaDep1-B1a 3058
TaDep1-B1b 3056 13 4
TaDep1-B1c 3026
TaDep1-B1d 3058
TaDep1-D1a 2973 2 2
TaDep1-D1b 2973
中优 9507与中国春 TaDep1-B1 DNA全长序列
相同, 被命名为 TaDep1-B1a, PH82-2、内乡 188 和
CA9632 的 TaDep1-B1 等位变异被命名为 TaDep1-
B1b、TaDep1-B1c和 TaDep1-B1d, 有 13个 SNP和 4
个 InDel, 其中 5个 SNP和 1个 InDel位于外显子区
(表 2)。TaDep1-B1a与 TaDep1-B1b cDNA和氨基酸
序列相同 , 差异出现在内含子区。TaDep1-B1c 与
TaDep1-B1a、TaDep1-B1b 和 TaDep1-B1d 相比第 2
外显子中有 1个 SNP为中性突变, 谷氨酸(Glu)变为
甘氨酸(Gly), 第 5 外显子有 1 个 30 bp 的 InDel。
TaDep1-B1a、TaDep1-B1b 与 TaDep1-B1c、TaDep1-
B1d 相比第 3 外显子 1 个 SNP 为中性突变, 由甘氨
酸(Gly)变成半胱氨酸(Cys), 其他外显子 SNP 为同
义突变。
中国春 TaDep1-D1 DNA序列被命名为 TaDep1-
D1a, PH82-2、内乡 188、中优 9507和 CA9632基因
DNA 序列完全一致 , 被命名为 TaDep1-D1b。
TaDep1-D1 的 2 个等位基因序列比对表明, 第 1 内
含子中有 2个 InDel, 第 4、第 5外显子分别有 1个
SNP(表 2)。TaDep1-D1a 第 4 外显子 SNP 为同义突
变, 第 5外显子 SNP为中性突变, 亮氨酸(Leu)变为
缬氨酸(Val)。
根据克隆的普通小麦 5 个 TaDep1-A1、4 个
TaDep1-B1 和 2 个 TaDep1-D1 等位基因、水稻 Os-
Dep1 (FJ039905)、大麦 HvDep1 (FJ039903)和乌拉尔
图小麦 TuDep1 (GQ324995)的氨基酸序列, 构建了
一个系统发育树(图 2)。它包含 3个主要分支, 分支
Ι由 TaDep1-A1、TaDep1-B1和 TaDep1-D1组成, 分
支 ΙΙ 由大麦 HvDep1 和乌拉尔图小麦 TuDep1 组成,
分支 ΙΙΙ 为水稻 OsDep1, 其遗传距离与分支 Ι 和 ΙΙ
相差很远。分支 Ι 中 TaDep1-A1、TaDep1-B1 和
TaDep1-D1 各自聚类为一个群, 每个群又可分为 2
个簇。普通小麦 TaDep1-A1c、TaDep1-A1d和 TaDep1-
A1e 聚成一簇, TaDep1-A1a 和 TaDep1-A1b 聚成一
簇。在 TaDep1-B1 群中 , TaDep1-B1c 自成一簇 ,
TaDep1-B1a、TaDep1-B1 和 TaDep1-B1d 聚成一簇
第 4期 刘亚男等: 普通小麦 TaDep1基因克隆与特异性标记开发 593
(图 2)。普通小麦 TaDep1-A1、TaDep1-B1和 TaDep1-
D1 等位基因的聚类结果与前面的序列分析结果相
同, 每个簇中的等位基因具有很高的相似性, 不同
簇间的序列差异较大。
图 2 普通小麦 TaDep1-A1、TaDep1-B1和 TaDep1-D1等位变异与水稻 OsDep1、大麦 HvDep1和乌拉尔图小麦 TuDep1的系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree of alleles on TaDep1-A1, TaDep1-B1 and TaDep1-D1 loci in common wheat, OsDep1 in rice, HvDep1 in barley,
and TuDep1 in T. urartu
系统发育树用 Geneious Pro V 4.8.3软件基于邻位相连算法构建。每一分支点上的数字为自举值, 图旁的标尺代表每一个位点的核苷
酸替换率, 百分比为等位基因与水稻氨基酸序列相似度。
The tree was constructed using software Geneious Pro V 4.8.3 with neighbor joining algorithm. Bootstrap values are shown and the scale bar
indicates the number of nucleotide substitutions per site. The percentage represents the identity between allele and rice amino acid sequences.
2.2 基因特异性标记开发
70A1/A2R和 82A1/A2R 是根据 TaDep1-A1c 和
TaDep1-A1b第 1内含子 857 bp处的碱基差异设计的
1对显性互补标记, 以标记 70A1/A2R扩增 TaDep1-
A1c 基因型, 以标记 82A1/A2R 扩增 TaDep1-A1b, 2
个标记的扩增片段长度相同, 均为 642 bp (表 3)。
根据 TaDep1-A1d和 TaDep1-A1e第 1内含子 395
bp处 1个 SNP设计了标记 95A2/A1R和 96A2/A1R。
95A2/A1R 可特异性扩增 TaDep1-A1d, PCR 扩增片
段长度为 518 bp; 用 96A2/A1R 扩增 TaDep1-A1e,
PCR扩增片段长度为 517 bp (表 3)。根据 TaDep1-B1b
与 TaDep1-B1c第 5外显子上 30 bp的 InDel开发了
1 个共显性标记 dep19 (表 3), 在 TaDep1-B1c 和
TaDep1-B1b中扩增片段长度分别为 515 bp和 545 bp
(图 3和图 4)。根据 TaDep1-B1a 和 TaDep1-B1d第 4
外显子上 SNP, 设计了 1 对显性互补标记 95B3/2R
和 96B3/2R。95B3/2R在 TaDep1-B1a中扩增片段长
度为 796 bp, 96B3/2R在 TaDep1-B1d中扩增片段长
度为 800 bp (表 3)。
2.3 基因特异性标记验证
用标记 70A1/A2R、82A1/A2R、dep19、95B3/2R
和 96B3/2R对冬麦区 196份品种进行检测(表 4)。用
显性互补引物 70A1/A2R和 82A1/A2R检测 TaDep1-
A1 位点, TaDep1-A1c 基因型有 128 份, 61 份为
TaDep1-A1b 基因型, 2 种基因型间千粒重平均值为
44.8 g和 43.7 g, 差异不显著。北部冬麦区共 45份,
TaDep1-A1c基因型 32份, TaDep1-A1b基因型 13份;
黄淮冬麦区 102份, TaDep1-A1c基因型 60份, 42份
为 TaDep1-A1b 基因型; 长江中下游冬麦区 22 份,
TaDep1-A1c基因型 17份, TaDep1-A1b基因型 5份;
西南冬麦区 20 份, TaDep1-A1c 基因型 19 份, Ta-
Dep1-A1b基因型 1份。
594 作 物 学 报 第 39卷
表 3 小麦 TaDep1-A1和 TaDep1-B1位点等位基因的分子标记
Table 3 Molecular markers for TaDep1-A1 and Dep1-B1 loci
标记
Marker
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
等位基因
Allele
扩增长度
Size of PCR fragment (bp)
70A1/A2R F: GGGGAGAAGAGAATAATGCCC TaDep1-A1c 642
R: AGACATGAAAACGCAATGCAGT
82A1/A2R F: GGGGAGAAGAGAATAATGCCT TaDep1-A1b 642
R: AGACATGAAAACGCAATGCAGT
95A2 /A1R F: GCTAGGCCGTTCAATTCTTTAGTA TaDep1-A1d 518
R: GCAGAGCACCATGTGTTTTATAAC
96A2/A1R F: CTAGGCCGTTCAATTCTTTAGTG TaDep1-A1e 517
R: GCAGAGCACCATGTGTTTTATAAC
dep19 F: ATCGTAGGGACGCAGTATTCA TaDep1-B1b 545
R: CAGCCTCCCTTGTCGCA TaDep1-B1c 515
95B3/2R F: CAGGGTAAACGAGTTTGTCGG TaDep1-B1a 796
R: TGTGCATCGAGGGCAGGA
96B3/2R F: TTTCAGGGTAAACGAGTTTGTCTG TaDep1-B1d 800
R: TGTGCATCGAGGGCAGGA
图 3 TaDep1-B1不同等位基因第 5外显子部分序列比对
Fig. 3 Alignment of part of the fifth exon from TaDep1-B1a, TaDep1-B1b, TaDep1-B1c, and TaDep1-B1d
阴影部分代表插入或缺失。The shadow represents InDel.
图 4 通过检测中国春缺四体系对标记 dep19染色体定位(a)和普通小麦品种扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(b)
Fig. 4 Chromosomal localization of marker dep19 by the test of Chinese Spring nullisomic-tetrasomic lines (a) and polymorphism
test of PCR fragments amplified with dep19 in common wheat cultivars on a 4% denaturing polyacrylamide gel (b)
M: DNA ladder DL2000。等位基因 TaDep1-A1c扩增片段长度为 515 bp, 等位基因 TaDep-A1b扩增片段长度为 545 bp。
M: DNA ladder DL2000. The 515 bp and 545 bp PCR fragments were amplified in genotypes TaDep1-A1c and TaDep1-A1b, respectively.
用显性互补标记 95B3/2R 和 96B3/2R 扩增
TaDep1-B1a 和 TaDep1-B1d 基因型, 154 份品种为
TaDep1-B1a, 千粒重平均值 44.4 g; TaDep1-B1d基因
型 37份, 千粒重平均值为 44.4 g。两种基因型间的千
粒重差异不显著(表 4)。北部冬麦区品种 49 份, 其中
TaDep1-B1a和 TaDep1-B1d基因型分别有 25份和 24
份; 黄淮冬麦区 98 份, 含 TaDep1-B1a 基因型 87 份,
TaDep1-B1d 基因型 11 份; 长江中下游冬麦区 22 份,
含 TaDep1-B1a基因型 20份, TaDep1-B1d基因型 2份;
西南冬麦区 22份, 都为 TaDep1-B1a基因型。
第 4期 刘亚男等: 普通小麦 TaDep1基因克隆与特异性标记开发 595
表 4 196份小麦品种中不同分子标记检测基因型与千粒重相关性
Table 4 Association between allelic variants of TaDep1-A1 and TaDep1-B1 and thousand kernel weight in196 cultivars tested with
different markers
标记
Marker
基因型
Genotype
材料数
Number of cultivars
千粒重
1000-kernel weight (g)
粒重变幅
Range of 1000-kernel weight
70A1/A1R TaDep1-A1c 128 44.8 a 33.2–55.9
82A1/A1R TaDep1-A1b 61 43.7 a 32.4–56.7
95B3/2R TaDep1-B1a 154 44.4 a 32.4–56.7
96B3/2R TaDep1-B1d 37 44.4 a 33.2–53.0
dep19 TaDep1-B1b 124 44.2 a 32.4–56.7
dep19 TaDep1-B1c 69 45.1 a 33.4–55.7
千粒重数据后相同字母表示基因型间差异没有达到 5%显著水平。
The same letter after 1000-kernel weight indicates no significant differences among genotypes at 0.05 probability level.
用共显性标记 dep19 检测 TaDep1-B1b 和
TaDep1-B1c 基因型, 2 种基因型品种数分别为 124
份和 69份, 千粒重平均值为 44.2 g和 45.1 g, 差异
不显著(表 4)。北部冬麦区品种 48份, 其中 TaDep1-
B1b基因型 41份, TaDep1-B1c基因型 7份; 黄淮冬
麦区 102份, 含 TaDep1-B1b基因型 60份, TaDep1-
B1c 基因型 42 份; 长江中下游冬麦区 22 份, 含
TaDep1-B1b基因型 16份, TaDep1-B1c基因型 6份;
西南冬麦区 21 份, 含 TaDep1-B1b 基因型 7 份,
TaDep1-B1c基因型 14份。
用共显性标记 dep19 检测北方冬麦区 210 份育
成品种及高代系的千粒重、株高、穗长、小穗数和
穗节间, 基因型 TaDep1-B1b 和 TaDep1-B1c 差异也
不显著(表 5)。
表 5 210份小麦品种中以标记 dep19检测的基因型与产量性状间相关性
Table 5 Association analysis between allelic variants of TaDep1-B1 and yield traits in 210 cultivars tested with dep19
表型
Trait
基因型
Genotype
材料数
Number of cultivars
产量性状
Yield traits
产量性状变幅
Range of yield traits
TaDep1-B1b 94 47.1 a 34.5–58.4 千粒重
1000-kernel weight (g) TaDep1-B1c 49 46.4 a 35.0–57.4
TaDep1-B1b 92 75.0 a 53.0–100.0 株高
Plant height (cm) TaDep1-B1c 46 73.0 a 51.0–98.0
TaDep1-B1b 115 9.2 a 7.1–12.9 穗长
Spike length (cm) TaDep1-B1c 59 9.5 a 7.5–12.7
TaDep1-B1b 115 18.8 a 14.6–24.4 小穗数
Spikelet number TaDep1-B1c 59 18.9 a 15.6–24.3
TaDep1-B1b 115 1.0 a 0.7–1.2 穗节间
Spikelet internode length (cm) TaDep1-B1c 59 1.0 a 0.8–1.2
产量性状数据后相同字母表示基因型间差异没有达到 5%显著水平。
The same letter following yield traits indicates no significant differences among genotypes at 0.05 probability level.
3 讨论
3.1 TaDep1全长基因序列克隆
中国春 TaDep1 基因 mRNA (FJ039902)序列已
知, 结合水稻 OsDep1 基因(FJ039904)序列全长、
cDNA 序列(FJ039905)设计扩增 TaDep1 基因全长的
引物[20]。普通小麦为异源六倍体, 基因组庞大, 通
用引物 PCR扩增产物序列分析尤其重要。对扩增出
的 3 条序列设计特异引物, 引物设计位点应在差异
比较大的区域 , 确保引物的特异性 , 并用中国春
缺-四体 N5A-T5B、N5B-T5D和 N5D-T5A定位, 最
终确定 TaDep1基因 gDNA序列(表 1和图 1)。
大麦 HvDep1 (FJ039903)编码氨基酸序列长度
为 295, 乌拉尔图小麦 TuDep1 (GQ324995)氨基酸序
列长度为 283[20], 中国春 TaDep1-A1a、TaDep1-B1a
和 TaDep1-D1a氨基酸序列长度分别为 305、295和
299。TaDep1-B1a与大麦 HvDep1氨基酸序列长度相
同, 与乌拉尔图小麦 TuDep1相差 12个氨基酸残基。
TaDep1-A1a、TaDep1-B1a 和 TaDep1-D1a 氨基酸序
列与大麦 HvDep1 氨基酸一致度分别为 92.1%、
596 作 物 学 报 第 39卷
93.3%和 94.0%; 与乌拉尔图小麦 TuDep1 氨基酸相
似度为 88.9%、89.9%和 90.6%, 表明进化过程中该
基因保守性较高, 并且在进化分化前已发生(图 2)。
水稻 OsDep1 基因氨基酸序列长度为 426 氨基酸残
基, 与 TaDep1-A1a、TaDep1-B1a 和 TaDep1-D1a 氨
基酸序列一致度为 51.3%、49.7%和 50.8%。
普通小麦 TaDep1-A1、TaDep1-B1、TaDep1-D1
与大麦 HvDep1、乌拉尔图小麦 TuDep1分别聚成分
支 Ι和 ΙΙ, 乌拉尔图小麦是普通小麦 AA基因组的供
体, 理论上应该跟普通小麦 A 基因组聚成一群, 聚
类结果表明大麦HvDep1和乌拉尔图小麦 TuDep1聚
成一群, 原因可能是由于聚类的 14 个氨基酸序列中,
11个为小麦等位基因 , 近源种序列较少。普通小麦
TaDep1-A1、TaDep1-B1和 TaDep1-D1等位基因之间
差异较小, 聚成一簇, TaDep1-A1群中 TaDep1-A1c、
TaDep1-A1d 和 TaDep1-A1e 聚成一簇, 氨基酸序列
相同。在 TaDep1-B1群中, TaDep1-B1c第 5外显子
有 30 bp 的 InDel, 与 TaDep1-B1a、TaDep1-B1b 和
TaDep1-B1d氨基酸序列差异较大, 自成一簇(图 2)。
3.2 TaDep1等位变异与功能标记验证
根据 TaDep1-A1和 TaDep1-B1等位变异开发的
3 对显性互补标记和 1 个共显性标记能够在不同等
位基因的材料中进行特异性扩增。显性互补标记是
根据等位变异 SNP设计的, PCR扩增时发生错配的
情况时常发生, 相对于共显性标记准确度有所降低,
需要重复扩增每个材料, 以得到稳定可靠的结果。
本实验中的共显性标记 dep19 在检测试验材料时一
直很稳定, 具有很好的特异性, 可用于普通小麦品
种 TaDep1-B1等位基因检测。
用 3 对显性互补标记和 1 个共显性标记对 406
份小麦品种进行检测 , 发现不同等位变异在千粒
重、株高、穗长、小穗数和穗节间差异不显著。根
据比较基因组学可知, 禾本科植物之间有很好的共
线性关系, 在水稻、玉米上有相应功能的基因在小
麦上也应具有相似的功能[14-15,24-26]。Su等[14]根据水
稻的粒宽相关基因 OsGW2 开发了 CAPS 标记 ,
TaGW2-6A主要影响小麦粒宽和粒重; Ma等[15]根据
与籽粒灌浆相关的基因 CWI 开发的标记证明 ,
TaCwi-A1位点影响小麦千粒重。这 2个与产量有关
的基因在水稻和小麦上有相似的功能。Huang 等[20]
利用转基因技术证实 TaDep1 影响小麦穗长和小穗
密度, 但本研究未能找到与 TaDep1相关的性状, 可
能是本试验材料皆为小麦改良品种, 由于长期育种
选择, 其穗型相似, 导致该基因的不同等位变异在
表型上差异不显著。在以后的研究中应选择不同国
家的小麦品种, 包括农家种和现代改良品种, 以进
一步验证等位基因与产量相关性状的关系。大麦
HvDep1、乌拉尔图小麦 TuDep1和小麦 TaDep1与水
稻 OsDep1 基因序列相比都有不同程度的缺失, 说
明在进化过程中有可能该基因的功能发生变化, 不
如水稻中的明显, 因此未找到与 TaDep1相关联的表
型性状。例如籽粒硬度基因 puroindoline在玉米和水
稻中缺乏, 但小麦、大麦、黑麦和燕麦族中广泛存
在[27], 该基因存在于一粒小麦、乌拉尔图小麦、粗
山羊草、拟斯卑尔脱山羊草和六倍体人工合成小麦
中 , 但是含有硬质胚乳的四倍体硬粒小麦缺失
puroindoline基因[28], 其主要原因是进化为四倍体的
过程中基因组内发生了大片段的缺失[29]。由此可见,
不同物种中在进化过程中, 直系同源基因缺失或功
能分化, 导致基因对表型作用的变化。
由于OsDep1基因第 5外显子缺失, 引起水稻穗
变短、直立、着粒密集等表型的改变, 说明 OsDep1
第 5外显子是比较重要的功能区域。TaDep1-B1c与
其他等位基因相比, 第 5 外显子上 30 bp 的 InDel,
即 10个氨基酸残基(185–194)的缺失, 并且 TaDep1-
B1c 基因型广泛存在于普通小麦品种中。TaDep1-
A1、TaDep1-D1与 TaDep1-B1的 cDNA序列相比, 第
1~4外显子长度没有差异, 差异出现在第 5外显子。
TaDep1-B1c第 5外显子上 30 bp的 InDel是否会影
响功能还有待进一步研究。
4 结论
利用同源克隆技术克隆了普通小麦第 5 同源群
染色体长臂上 TaDep1基因的全长, 包含 5个外显子
和 4个内含子, 与水稻 OsDep1基因结构相似。5A、
5B 和 5D 染色体的 TaDep1-A1、TaDep1-B1 和
TaDep1-D1 基因组 DNA 序列起始密码子至终止密
码子全长为 3141、3058 和 2973 bp, 编码序列长度
为 918、888和 900 bp, 编码 305、295 和 299 个氨
基酸残基。在普通小麦品种的 TaDep1-A1、
TaDep1-B1 和 TaDep1-D1 位点, 分别发现 5、4 和 2
个等位变异。根据 TaDep1-A1和 TaDep1-B1位点上
的 SNP和 InDel开发了 3对显性互补标记和 1个共
显性标记, 可以准确鉴定不同等位基因。根据等位
基因 TaDep1-B1c第 5外显子上 30 bp的 InDel, 开发
1个共显性分子标记 Dep19, 可以准确区分 TaDep1-
第 4期 刘亚男等: 普通小麦 TaDep1基因克隆与特异性标记开发 597
B1c 等位变异与其它 TaDep1-B1 等位变异。用这些
标记对 406 份小麦品种进行检测, 不同基因型的千
粒重、株高、穗长、小穗数和穗节间差异不显著。
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