全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 10741082 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20), 国家公益性行业(农业)科研专项(201503119)和福建省高等学校新世纪优秀
人才支持计划项目(JA14095)资助。
This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-20), the Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public
Interest (201503119), and the Program for New Century Excellent Talents in Fujian Province University (JA14095).
* 通讯作者(Corresponding author): 阙友雄, E-mail: queyouxiong@126.com **同等贡献(Contributed equally to this work)
第一作者联系方式: 苏炜华, E-mail: 410946470@qq.com; 刘峰, E-mail: 760733016@qq.com
Received(收稿日期): 2015-12-07; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160322.1601.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01074
甘蔗 Ca2+/H+反向运转体基因的克隆与表达分析
苏炜华 刘 峰 黄 珑 苏亚春 黄 宁 凌 辉 吴期滨
张 华 阙友雄
福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室 / 国家甘蔗产业技术研发中心, 福建福州 350002
摘 要: CAX (Ca2+/H+ antiporter)是植物细胞膜 Ca2+主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的 CAX1基因(GenBank 登
录号为 XM_002441593)为探针, 利用电子克隆并结合 RT-PCR 技术, 获得甘蔗 CAX1 基因的 1 条 cDNA 序列, 命名为
ScCAX1 (GenBank登录号为 KT799799)。生物信息学分析显示, ScCAX1基因全长 784 bp, 包含 1个 645 bp的开放阅读
框, 编码 1 个 214 个氨基酸的蛋白质。ScCAX1 蛋白被定位于叶绿体类囊体膜, 为稳定的疏水性蛋白, 不存在信号肽。
蛋白二级结构元件多为 α-螺旋, 具有 1个 Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量 PCR分析表明, 甘蔗 ScCAX1基因的表
达具有组织特异性, 在各组织中均表达, 但在茎中表达量最低, 叶中的表达量最高。在 PEG、NaCl、SA、ABA和 MeJA
胁迫过程中, ScCAX1基因的表达均受到调控。其中 ABA、SA和 PEG胁迫下表达量上调, 均在胁迫 24 h达到最大值。
SA胁迫 24 h的表达量为对照的 5.47倍, 而 ABA胁迫 24 h的表达量为对照的 3.5倍。NaCl胁迫 6 h的表达量达最大值,
为对照的 2.14倍。推测 ScCAX1基因能够响应逆境胁迫, 其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。
关键词: 甘蔗; CAX1基因; 电子克隆; 生物信息学; 实时荧光定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of a Ca2+/H+ Antiporter Gene from Sugarcane
SU Wei-Hua **, LIU Feng**, HUANG Long, SU Ya-Chun, HUANG Ning, LING Hui, WU Qi-Bin, ZHANG
Hua, and QUE You-Xiong*
Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture, Fujian Agriculture and Forestry University / Sugarcane
Research & Development Center, China Agricultural Technology System, Fuzhou 350002, China
Abstract: CAX (Ca2+/H+ antiporter) is a major category of Ca2+ active transport systems in plant cell membrane. In the present
study, using a CAX1 mRNA sequence from Sorghum bicolor (GenBank accession number: XM_002441593) as the probe, the
full-length cDNA sequence of sugarcane CAX1 gene was cloned by in silico cloning combined with RT-PCR amplification, and
named as ScCAX1 (GenBank accession number: KT799799). Bioinformatics analysis showed that ScCAX1 has a length of 784 bp
and contains a complete open reading frame with a length of 645 bp, which encodes a 214 amino acid residues of sugarcane
CAX1 protein. The ScCAX1 protein with stable acidity and hydrophobia was detected to be located in thylakoid membrane of
chloroplasts with no signal peptide. It belongs to a conserved Na_Ca_ex. The mainly secondary structure element of ScCAX1
protein is alpha helix. Real time quantitative PCR (RT-qPCR) analysis revealed that the expression of ScCAX1 was tissue-specific,
with constituent expression in different tissues of sugarcane. The highest expression was observed in leaf while the lowest in stem.
Besides, the expression of ScCAX1 gene could be regulated by treatments of PEG, NaCl, SA, ABA, and MeJA. The expression
level of this gene was up-regulated by ABA, SA and PEG, with the highest inducible expression level in treatment of 24 hours.
The expression level was 5.47 times higher than that of control under 24 hours stress of SA, and 3.5 times higher than that of con-
trol under 24 hours stress of ABA. Under 6 hours stress of NaCl, the gene had the highest inducible expression level, which was
2.14 times higher than that of control. This study suggested that ScCAX1 could response to stresses, and its expression may be
associated with salt resistance and osmotic tolerance in sugarcane.
第 7期 苏炜华等: 甘蔗 Ca2+/H+反向运转体基因的克隆与表达分析 1075


Keywords: Sugarcane; CAX1 gene; in silico cloning; Bioinformatics; Real-time quantitative PCR
Ca2+作为植物体必需的营养元素, 参与植物各阶段的
生长发育过程[1]。Ca2+亦是植物体中重要的信使, 它在响应
植物自身的发育信息和外部刺激中发挥着重要作用[2-4]。在
响应逆境胁迫方面, Ca2+通过维持质膜结构和功能的稳定,
提高植物的抗逆境能力[5]。当植物受到干旱、低温和盐胁
迫等外部刺激时, 细胞中 Ca2+浓度会经历短时间的快速
上升和长时间慢速上升 2个阶段[6-8], Ca2+浓度的升高作为
信号物质诱导响应基因的表达[7]。在植物体内众多的 Ca2+
转移系统中, Ca2+/H+反向转运体属于 Ca2+外向转运器的
一类, 它能够调节细胞中的 Ca2+浓度、调控植物营养和参
与信号传递[4,9]。
CAXs家族作为 CaCA (Ca2+/cation antiporter, Ca2+/阳
离子逆向转运体)交换体超家族的一部分, 其主要功能是
将阳离子转运出胞外以维持胞内合理的离子浓度 , 不仅
具有高效率、高通量和低亲和性的特征, 而且对很多金属
离子具有较高的转运能力, 但主要以 Ca2+为主[10-13]。植物
中关 于 Ca2+/H+反向转运体的研究 , 始于拟南芥
(Arabidopsis thaliana)中克隆得到 CAX1 (calcium ex-
changer 1)及其表达分析 [14]。目前 , 在拟南芥中已有
CAX1、CAX2、CAX3和 CAX4[11,15-16]被成功克隆, 预计还
有 8 个 Ca2+/H+反向转运体基因[17]。另外 CAX1 基因已在
水稻 (Oryza sativa)[18]、绿豆 (Vigna radiate)[19]、棉花
(Gossypium spp.)[20]等多个物种中被克隆和分析。CAX1基
因在植物的生长发育及适应环境变化方面具有重要的作
用。在调控植物营养和生长方面, 有报道称, 与对照组相
比, 拟南芥突变体 CAX1不仅抽薹时间推迟而且茎的分枝
数、总长度、侧根数目及长度均有不同程度减少[21]。另有
研究发现, N 端缺失的 CAX1(sCAX1)被导入烟草和番茄后,
植株体中 Ca2+含量升高, 植株发育受到阻碍, 离子敏感度增
加, 在对烟草施加外源Ca2+时, 烟草恢复正常生长[22]; 但是,
转基因番茄中幼嫩果实出现脐腐病 , 同时果实保鲜期延
长[23]。以上说明 CAX1可能将植物胞质内的 Ca2+转运至液
泡使得胞质 Ca2+浓度下降, 导致植物营养失衡, 番茄的脐
腐病也印证了该观点[22-23]。Ca2+在植物响应逆境信号过程
中起着信使的作用。Park等[23-24]将拟南芥中的 CAX1导入
胡萝卜和番茄中表达, 发现植株对 Ca2+积累能力增强。将
大豆的 GmCAX1 基因和莱茵衣藻的 CrCAX1 基因转入拟
南芥后, 由于 GmCAX1 和 CrCAX1 本身具有 Na+/H+的活
性, 且位于液泡膜上, 故可以将拟南芥胞质内多余的 Na+
转运到液泡[25-26], 进而增强转基因植株对盐胁迫的抗性。
在应答冷胁迫方面, 将拟南芥的 CAX1 基因转入烟草时,
发现烟草内[Ca2+]cyt(胞质 Ca2+浓度)的减少导致信号传导
受阻, 增强了植株对冷胁迫的敏感性[20,27]。但是, 目前尚
未见关于甘蔗 CAX1基因克隆和表达分析的报道。
目前, 我国甘蔗主产区主要为桂、滇、粤、琼的红壤
旱地, 那里风、寒、旱等极端气候频发, 对我国甘蔗生产
发展造成较大危害[28]。为了更好应对不良环境的影响, 利
用分子生物技术培育具有优良抗性甘蔗品种是有效的解
决方法之一 , 挖掘鉴定优良的基因资源是其中一项重要
任务。本研究立足于前人对其他物种 CAX1基因的研究进
展, 通过电子克隆、RT-PCR及实时荧光定量 PCR等技术
对甘蔗 CAX1基因进行克隆与表达分析, 以期进一步深入
理解 CAX1 基因在甘蔗中的表达功能和作用机制并为甘
蔗育种提供抗逆性基因资源。
1 材料与方法
1.1 植物材料及试剂
福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重
点实验室提供甘蔗材料, 品种为崖城 05-179。试剂主要有
PrimeScript RT-PCR Kit 反转录试剂盒(TaKaRa, 中国大
连)、TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、Gel
Extracti on Kit (Tiangen Biotech Co., 中国北京 )、
SYBRGreen PCR Master Mix Kit (Roche, USA)。
1.2 材料处理
参考黄珑等[29]的操作步骤。在保证样本均一性情况
下, 从田间采样, 将蔗株砍成单芽茎段, 于高温高压灭菌
营养土中催芽(16 h/8 h, 光/暗, 28℃), 种植。待蔗苗长出
4~6 叶时, 取长势一致的蔗苗进行组培, 将组培甘蔗幼苗
移出并在温室内开放水培一周。设置对照组和试验组, 生
物学重复为 3 次。以 0 h 未处理的蔗苗作为对照(表 1)。
以上所有甘蔗材料取样后被立即投入液氮并保存于–80℃
冰箱至 RNA提取。

表 1 实时荧光定量材料处理
Table 1 Material processing for Real-time PCR
取样时间 Sampling time (h) 处理条件
Treatment condition 取样点 1 Site 1 取样点 2 Site 2 取样点 3 Site 3
5 mmol L–1水杨酸 SA 6 12 24
100 μmol L–1茉莉酸甲酯MeJA 6 12 24
100 μmol L–1脱落酸 ABA 6 12 24
25.0% PEG 模拟干旱 Simulated drought 6 12 24
250 mmol L–1 NaCl 12 24 48

1076 作 物 学 报 第 42卷

1.3 电子克隆
以高粱 CAX1基因核酸序列 (GenBank登录号为
XM_002441593)为探针, 利用Blast工具在甘蔗EST数据库
中检索 , 筛选出与探针序列同源性较高的甘蔗EST序列
(表 2), 使用 在线 工具 CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/
cap3.php)对序列聚类、拼接、延伸, 得到新的重叠群, 持
续比对检索直至无新的EST可供拼接为止 , 从而获得
cDNA序列。使用ORF Finder在线软件(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找序列的开放阅读框 , 并对其分
析和翻译。

表 2 电子克隆中用到的甘蔗 EST序列
Table 2 Sugarcane ESTs used in silicon cloning
EST名称
ESTs name
GenBank登录号
GenBank accession number
EST1 CA269569
EST2 CA290478
EST3 CA074339
EST4 CA198455
EST5 CA233144
EST6 CA233226
EST7 GT873352

1.4 甘蔗 ScCAX1基因的 RT-PCR及测序
通过 TRIzol 法提取 NaCl 处理的甘蔗 YC05-179 蔗苗
的总 RNA, 然后使用 Prime-Script RT Reagent Kit反转录试
剂盒合成 cDNA 作为 PCR 模板。应用 Primer 5.0 软件对
ScCAX1 拼接序列进行特异性引物设计, 即 CAX1-1F 和
CAX-1R (表 3), PCR扩增体系总体积 25 L, 含 10Ex Taq
buffer 2.5 L、10 mmol L–1 dNTPs 2 L、20 mol L–1上下
游引物各 1.0 L、Ex Taq酶 0.125 L、cDNA模板 1.0 L、
ddH2O 17.375 L。PCR程序为 95℃预变性 4 min; 95℃变
性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 35个循环; 72℃延
伸 10 min。先将扩增产物纯化回收, 随后将回收产物连接
到 pMD-19T 载体并转化到大肠杆菌 DH5α 感受态细胞中,
于含有氨苄青霉素的 LB平板上进行阳性克隆筛选并挑取单
菌落鉴定, 而后送往上海生工生物工程技术服务有限公司
测序, 通过 DNAMAN软件比对测序结果与电子克隆序列。
1.5 甘蔗 ScCAX1基因序列的生物信息学分析
参考黄珑等[29], 应用在线工具 ExPASyProtparam tool
预测 ScCAX1基因编码的蛋白一级结构、亲疏水性; 对其
二级结构、亚细胞定位及功能预测和信号肽的预测则分别
采用 SOPMA[30]、SignalP 4.0 Server 软件和 Psort; 用
SWISSMODEL 在线预测工具预测分析蛋白三级结构; 通
过 NCBI中的 CDD (Conserved Domain Database)数据库预
测蛋白保守结构域; 用 Blastp 在线工具查找甘蔗 ScCAX1
同源氨基酸序列, 并使用 DNAMAN7.0 多重比对同源氨
基酸序列, 使用 MEGA5.1 软件 NJ (Neighbor-Joining)法
(BootStrap 1000)构建系统进化树。
1.6 甘蔗 ScCAX1基因表达的实时荧光定量 PCR分析
采用 TRIzol法提取样品 RNA, 包含 SA、MeJA、ABA、
PEG和NaCl胁迫处理材料及崖城 05-179的组织特异性材
料即根、茎、叶、皮、茎尖和芽组织材料。参照 Prime-Script
RT Reagent Kit操作说明书, 将 RNA反转录合成 cDNA得
到模板。基于 ScCAX1 基因序列进行定量引物设计, 即
qCAX1-2F和 qCAX1-2R (表 3), 内参基因为 CUL和 CAC,
内参基因的定量引物见表 3[31]。PCR 体系 (20 μL)含
SYBRGreen Primix Ex Taq (2×) 10 μL、10 μmol L–1上下游
引物各 0.8 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.4 μL。实时荧光定
量 PCR扩增程序为 50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s、
60℃ 1 min, 45个循环; 增加熔解曲线; 反应时设置 3次
技术重复。组织特异性表达分析中, 未使用参照样品, 仅
将 ScCAX1 基因在茎中的表达量定义为 1, 其他组织中该
基因的表达量与之相比。在 ABI PRISM7500 Real-time
PCR System 软件上对定量数据初步分析后 , 导致
Microsoft Excel工作表, 采用 2–ΔΔCt算法[32]分析实时荧光
定量 PCR试验结果, 计算 3次重复数据的标准误后绘图。
2 结果与分析
2.1 甘蔗 ScCAX1基因序列的获得
应用电子克隆技术获得甘蔗 Ca2+/H+反向运转体基因
CAX1 的 cDNA 全长序列, 并根据该序列设计 1 对特异性
引物, 经过 RT-PCR扩增获得约 784 bp的单一条带(图 1),
经过胶回收、连接转化、菌液 PCR 鉴定和测序。序列比
对表明, RT-PCR 扩增产物序列与电子克隆得到的序列同
源性高达 99.87%, 验证了电子克隆的正确性。将该基因
命名为 ScCAX1, 其 GenBank 登录号为 KT799799。该基
因的核酸序列及其推导的氨基酸序列如图 2。


表 3 ScCAX1基因克隆与表达所用引物
Table 3 Primers used in ScCAX1 gene cloning and expression analysis
引物
Primer
上游引物序列
Forward primer sequence (5–3)
下游引物序列
Reverse primer sequence (5–3)
退火温度
Tm (℃)
用途
Purpose
CAX1-1 TCCCGAGCATGTAGCATTGT CAGCATCTTCCCGCAGTCTA 55 Gene cloning
qCAX1-2 TAGTAACGGTCTTCACGCTCCA TCCATTTCCACGCTGTCTCAAA 61 Real-time-qPCR
CUL TGCTGAATGTGTTGAGCAGC TTGTCGCGCTCCAAGTAGTC 55 Reference genes
CAC ACAACGTCAGGCAAAGCAAA AGATCAACTCCACCTCTGCG 57 Reference genes

第 7期 苏炜华等: 甘蔗 Ca2+/H+反向运转体基因的克隆与表达分析 1077



图 1 甘蔗 ScCAX1基因的 RT-PCR扩增
Fig. 1 RT-PCR amplification of ScCAX1 gene in sugarcane
M: marker 2000 bp; 1: RT-PCR产物。
M: DNA marker 2000 bp; 1: RT-PCR products.

2.2 甘蔗 ScCAX1基因的生物信息学分析
2.2.1 甘蔗 ScCAX1 基因编码氨基酸的一级和二级结构
预测 甘蔗 ScCAX1 基因编码的蛋白一级结构预测显
示, 该蛋白分子式为 C1085H1689N259O301S9, 分子量为 23.4
kD, 编码了 214 个氨基酸。其中等电点(pI)为 4.71, 不稳
定系数为 23.70, 数值小于 40表明该蛋白稳定, 推测为稳
定的酸性蛋白质。二级结构预测显示, 甘蔗 ScCAX1蛋白
α-螺旋所占的比例最高, 为 47.20%, 延伸链所占比例最
低, 为 24.77%, 无规则卷曲结构占 22.90% (表 4)。
2.2.2 甘蔗 ScCAX1蛋白信号肽、疏水性/亲水性的预测和
分析 甘蔗 ScCAX1蛋白氨基酸残基的加权平均值较小,
为 0.314 (<0.5), 推测该蛋白不存在信号肽。即甘蔗ScCAX1
蛋白为非分泌蛋白, 在细胞质中合成后不能被转运。
从图 3 可以看出, 第 185 位具有最高分值, 为 3.533,
疏水性最强; 第 195 位具有最低分值, 为–2.733, 亲水性
最强, 绝大部分氨基酸都表现疏水性, 推测甘蔗 ScCAX1
蛋白是一种疏水蛋白。
2.2.3 甘蔗 ScCAX1 蛋白三级结构预测 用 SWISS-
MODEL工具, 以 SMTL id: 4k1c.1 Chain id: A为模板对
ScCAX1、水稻、粟和玉米的蛋白三级结构进行预测, 序
列同源性分别为 39%、39%、39%和 40%。如图 4所示, 甘
蔗 ScCAX1蛋白的三级空间结构与水稻、粟和玉米蛋白的
三级结构均以 α-螺旋为主。

图 2 同源克隆获得的甘蔗 ScCAX1基因的 cDNA序列及其推导的氨基酸序列(*终止密码子)
Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of sugarcane ScCAX1 gene obtained by homology cloning (* stop codon)
黑色框部分为特异性引物在基因序列中的位置。
The sequence fragment complementary to primer is highlighted in black box.

表 4 甘蔗 ScCAX1蛋白二级结构预测分析
Table 4 Secondary structure prediction of sugarcane ScCAX1 protein
二级结构类型
Secondary structure type
氨基酸残基数目(个)
Amino acid residue number (aa)
百分比
Percentage (%)
α-螺旋 Alpha-helix 101 47.20
延伸链 Extended strand 53 24.77
无规则卷曲 Random coil 49 22.90

1078 作 物 学 报 第 42卷


图 3 甘蔗 ScCAX1蛋白氨基酸疏水性/亲水性预测
Fig. 3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino
acid sequence of sugarcane ScCAX1 protein

2.2.4 甘蔗 ScCAX1蛋白的功能和亚细胞定位预测
该蛋白主要作为受体, 可能性为 2.81, 其次也可能是
转运子(2.19)和信号传感器(2.03)。甘蔗 ScCAX1蛋白可能
定位于叶绿体类囊体膜 ( 7 1 . 2 %)上 , 其次是细胞质膜
(60.0%), 再次是线粒体内膜(53.8%)。
2.2.5 甘蔗 ScCAX1 蛋白的保守结构域分析 如图 5
所示 , 甘蔗 ScCAX1 蛋白隶属的家族为 Na_Ca_ex
superfamily, 具有 Na+/Ca2+交换蛋白结构域, 即 Na_Ca_ex
(sodium/calcium exchanger protein)结构域。
2.2.6 甘蔗 ScCAX1 蛋白的氨基酸序列同源性分析和系
统进化树构建 甘蔗 ScCAX1蛋白的氨基酸通过 NCBI
中的Blastp程序对其进行同源性分析, 可知该蛋白与玉米
(Zea mays |ACF84781.1|)、粟(Setaria italica |XP004960984.1|)、
小麦 (Triticum urartu |EMS64041.1|)、山羊草 (Aeqilops
tauschii |EMT05522.1|) 、 二 穗 短 柄 草 (Brachypodium
distachyon |XP003581596.1|)、水稻 (O. sativa japonica
Group |NP001056506.1|)、油棕(Elaeis quineensis |XP01092
7362.1|)和海枣(Phoenix dactylifera |XP008793971.1|)蛋
白的氨基酸序列相似性分别为 93%、93%、88%、87%、
86%、79%、77%和 74%。氨基酸序列多重比对 (图 6)
表明 , 甘蔗 ScCAX1 蛋白与玉米和粟的氨基酸相似性
最高 , 为 93%, 而与小麦、山羊草、二穗短柄草等相似
性较低。

图 4 甘蔗、玉米、水稻和粟 CAX1蛋白三级结构预测
Fig. 4 Predicted third structure of CAX1 protein in Saccharum spp. hybrids, Zea mays, Oryza sativa, and Setaria italica

图 5 甘蔗 ScCAX1蛋白的保守结构域分析
Fig. 5 Conserved domain prediction of sugarcane ScCAX1 protein

进化树(图 7)表明, 同属的棕榈科、油棕和海枣位于
同一个分支; 而甘蔗 ScCAX1、粟、玉米、小麦、山羊草
和二穗短柄草同属于禾本科植物, 则为另一分支, 其中甘
蔗 ScCAX1和粟米亲缘关系最近。
2.3 甘蔗 ScCAX1基因的组织特异性表达分析
由图 8可知, 甘蔗 ScCAX1基因的表达具有组织特异
性。该基因在茎中表达量最低, 而在叶中表达量最高, 为
茎中的 6.46倍, 此外芽中的表达量为茎中的 3.5倍。
2.4 甘蔗 ScCAX1 基因在不同外源胁迫下的表达特性分
析
根据图 9, 在 MeJA胁迫下 ScCAX1基因的表达呈“先
抑后扬”的表达模式, MeJA胁迫 12 h后该基因的表达受
到抑制, 表达量下降为最低值, 为对照的 0.81倍, 而在胁
迫 24 h后表达量上调, 约为对照的 1.24倍。NaCl胁迫下
ScCAX1基因的表达则呈“扬—抑—扬”的表达模式, 在 6
h 表达量上调, 为对照的 2.14 倍; 但在 24 h 表达量最低,
仅为对照的 0.77, 而后在 48 h 表达量又有所上调。图 9
显示, 在 ABA、SA和 PEG胁迫下, ScCAX1基因的表达量
均不同程度上调。在 ABA 胁迫下, 与 6 h 相比, ScCAX1
基因的表达量在 12 h有所下调, 但在 24 h达到最高, 为对
照的 3.5 倍。而 SA 胁迫下, 该基因表达量呈随胁迫时间
增加而增加的趋势, 在胁迫 24 h后表达量最高, 为对照的
5.47倍。在 PEG胁迫诱导下, 该基因的表达量在 24 h最
高, 为对照的 1.97倍, 但在 6 h、12 h无明显变化。
第 7期 苏炜华等: 甘蔗 Ca2+/H+反向运转体基因的克隆与表达分析 1079



图 6 甘蔗 ScCAX1蛋白与其他植物种蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 6 Homology analysis of sequences from sugarcane ScCAX1 and those of other species

图 7 不同物种 CAX1蛋白的系统进化树
Fig. 7 Phylogenetic tree of CAX1 protein sequences from different species

1080 作 物 学 报 第 42卷


图 8 甘蔗 ScCAX1基因在不同组织中的表达
Fig. 8 Relative expression of ScCAX1 gene in different tissues of
sugarcane
误差线为每组处理的标准误差(n = 3)。
Error bars represent the standard error of each treating group (n = 3).
3 讨论
钙元素在植物体中具有重要的作用 , 在细胞中发挥
着第二信使的作用, 它不仅与植物的生长发育和光合产
物运输等有关, 还参与各种胁迫性防御反应[33-36]。在植物
中, Ca2+的转运很大程度上需依赖 Ca2+/H+反向转运体, 但
Ca2+/H+反向转运体基因在空间、功能等方面各不相同[33]。
本研究克隆获得 ScCAX1基因, 基因序列是可靠的。
该基因编码的蛋白为稳定酸性蛋白, 二级结构中 α-螺旋
所占比例最大, 该结果与郭园园等[37]关于烟草中 CAX2基
因的研究相一致。前人研究结果表明, 当氨基酸残基的加
权平均值小于 0.5时, 该蛋白不存在信号肽[38]。本研究中
ScCAX1 蛋白氨基酸残基的加权平均值为 0.314 (<0.5),
故推测该蛋白不存在信号肽。因为 ScCAX1 蛋白的
GRAVY值为 0.727, 当蛋白为疏水蛋白时, GRAVT数值大
于零, 可以判断整条多肽链疏水性较强[39]。在保守结构域
上, ScCAX1 具有 Na+/Ca2+交换蛋白结构域(Na_Ca_ex),
推测该蛋白属于整合膜蛋白, 可依据细胞质中 Na+浓度,
调控 Ca2+在细胞中的运动, 进而控制细胞内 Ca2+浓度[40]。
亚细胞定位预测结果显示, 该蛋白可能定位于叶绿体类囊
膜、细胞质膜或者线粒体膜。根据前人研究发现, CAXs 蛋
白可能定位于液泡膜、质膜、叶绿体类囊膜和线粒体膜[41-42],
如大豆 GmCAX1[25]定位于质膜, 而盐地碱芽 Put-CAX1则
定位于液泡膜[43], 故对甘蔗中 ScCAX1 蛋白的亚细胞定
位结果还需进一步实验验证。

图 9 甘蔗 ScCAX1 基因在不同外源胁迫下的表达
Fig. 9 ScCAX1 gene expression in sugarcane under different exogenous stresses
误差线为每组处理的标准误差(n = 3)。
Error bars represent the standard error of each treating group (n = 3).

实时荧光定量 PCR分析结果显示, ScCAX1基因表达
具有组织特异性, 在叶中的表达量最高, 茎中的表达量最
低。而盐地碱蓬 SsCAX1 主要在茎和叶片中表达, 根部表
达量非常低, 几乎检测不到[44]。因此, 不同植物中 CAX1
的组织特异表达模式是不同的 , 这与前人的研究结果一
致[45]。在非生物胁迫反应方面, 在 SA、ABA、PEG胁迫
下, 相对于对照, ScCAX1 基因表达量均有不同程度上调,
而MeJA胁迫下, 该基因的表达模式为“先抑后扬”。有报道
显示, Ca2+参与激活SA介导的防卫反应基因的表达[46-47], 推
测随着 SA 胁迫时间的延长 , Ca2+转运活跃从而导致
ScCAX1 基因表达量上升 , 这解释了为什么本研究中
ScCAX1基因表达量在SA胁迫下随时间的增加而增长。ABA
在植物应答非生物胁迫中发挥重要的信号转导作用[47], PEG
是理想的干旱胁迫模拟试剂[48]。干旱条件也能激发细胞
内多条信号转导途径 [49], 而 Ca2+具有信使的作用, 在响
应外界刺激等方面发挥着重要作用[2-4], 这也再次佐证了
甘蔗 ScCAX1基因与 Ca2+的转运有着较为密切的联系。本
研究中, 在 ABA和 PEG胁迫后的各时间点, ScCAX1基因
表达量均高于对照, 推测可能是 ABA、PEG 逆境胁迫引
起信号传导, 激发 Ca2+信号, 导致与 Ca2+转运密切相关的
第 7期 苏炜华等: 甘蔗 Ca2+/H+反向运转体基因的克隆与表达分析 1081


ScCAX1 基因表达量上升。对于 NaCl 胁迫下的“先扬后
抑再扬”的表达模式, 可能的原因是胁迫 6 h后传递了胁
迫信号, 诱导 ScCAX1 基因表达量升高。同时, 这可能正
是因为外源盐诱导导致植物体内出现离子平衡失调、膜脂
过氧化和代谢紊乱等问题[50], 使得胁迫 12 h 的表达量骤
降, 而胁迫 24 h表达量开始升高恢复正常。综上所述, 该
基因的表达受到外源干旱、盐胁迫等逆境条件的调控, 推
测该基因在甘蔗抗逆境方面发挥一定的作用。
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