全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 644−649 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目 (31171533, 31071402), 四川省科技支撑计划项目 (2012NZ0027), 山东省自然科学基金项目
(ZR2011CQ015)和山东省高等学校科技计划项目(J11LC22)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 邓晓建, E-mail: xjdeng2006@aliyun.com
第一作者联系方式: E-mail: Liyanqun63@163.com (李燕群); g-j-xu@163.com (高家旭) ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-08-02; Accepted(接受日期): 2013-12-12; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1610.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00644
水稻 ygl80黄绿叶突变体的遗传分析与目标基因精细定位
李燕群 1,** 高家旭 1,** 肖云华 1 李秀兰 2 蒲 翔 1 孙昌辉 1 王平荣 1
邓晓建 1,*
1四川农业大学水稻研究所, 四川成都 611130; 2曲阜师范大学生命科学学院, 山东曲阜 273165
摘 要: 通过化学诱变获得遗传稳定的水稻黄绿叶突变体 ygl80。与野生型亲本 10079相比, ygl80突变体在苗期和孕
穗期叶片叶绿素分别下降 76.64%和 54.59%, 类胡萝卜素含量分别下降 53.85%和 41.18%, 成熟期株高、每株有效穗
数、每穗着粒数、穗长和千粒重分别减少 14.8%、16.5%、21.3%、9.1%和 7.4%。遗传分析表明, ygl80的突变性状由
1 对隐性核基因控制。利用(ygl80/浙辐 802) F2作为定位群体, 将突变基因定位在第 5 染色体长臂 InDel 标记 C2 和
C3之间, 遗传距离分别为 0.24 cM 和 0.39 cM, 两标记之间的物理距离约为 90 kb, 此区间内包含 11个预测基因。基
因组序列分析发现, ygl80突变体在编码叶绿素合酶的 YGL1 (LOC_Os05g28200)基因编码区第 5027碱基处(位于第 14
外显子), 碱基 C突变为碱基 T, 使编码蛋白序列第 348位的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu)。该基因是已报道的水稻
ygl1黄绿叶突变基因的等位基因。ygl80突变体在整个生育期都表现为黄绿叶, 而 ygl1突变体在苗期叶片黄化, 中期
慢慢转绿, 后期叶色以及总叶绿素和类胡萝卜素的含量接近野生型, 这可能是 YGL1 基因编码的叶绿素合酶蛋白的
氨基酸不同突变位点造成的。
关键词: 水稻; 黄绿叶突变体; YGL1; 遗传分析; 精细定位
Genetic Analysis and Gene Fine Mapping of Yellow-Green Leaf Mutant ygl80
in Rice
LI Yan-Qun1,**, GAO Jia-Xu1,**, XIAO Yun-Hua1, LI Xiu-Lan2, PU Xiang1, SUN Chang-Hui1, WANG
Ping-Rong1, and DENG Xiao-Jian1,*
1 Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China; 2 College of Life Science, Qufu Normal University, Qufu
273165, China
Abstract: A yellow-green leaf mutant ygl80 was isolated by chemical mutagenesis. Compared with the wild-type parent 10079,
chlorophyll content of the ygl80 mutant decreased by 76.64% and 54.59%, and the carotenoid content decreased by 53.85% and
41.18% at the seedling and booting stages, respectively. In addition, plant height, number of productive panicles per plant, number
of spikelets per panicle, panicle length and 1000-grain weight reduced by 14.8%, 16.5%, 21.3%, 9.1%, and 7.4%, respectively, at
the maturity. Genetic analysis showed that the yellow-green leaf trait of the ygl80 mutant was controlled by one pair of recessive
nuclear genes. Genetic mapping of the mutant gene was conducted by using 627 yellow-green leaf individuals from the F2 map-
ping population of ygl80/Zhefu 802. Finally, the mutant gene was mapped between InDel markers C2 and C3 on the long arm of
chromosome 5, with genetic distances of 0.24 cM and 0.39 cM, respectively, and with physical distance of 90 kb, in this region
eleven predicted genes had been annotated. Sequencing analysis of these candidate genes between the mutant and its wild-type
parent revealed a single base change (C5027T) of YGL1 (LOC_Os05g28200) gene for chlorophyll synthase resulted in a missense
mutation (P348L) in the encoded product, suggesting that the ygl80 mutant gene is allelic to the ygl1 gene. The ygl80 mutant ex-
hibited yellow-green trait throughout the growing period. But the ygl1 mutant showed yellow-green trait at seedling stage, then
turned into green slowly, and its leaf color and chlorophyll and carotenoid contents almost closed to those of the wild-type parent
during the later stage of growth. Different phenotypes of the two mutants may be caused by different mutational sites of genomic
第 4期 李燕群等: 水稻 ygl80黄绿叶突变体的遗传分析与目标基因精细定位 645


sequence of YGL1 gene encoding chlorophyll synthase.
Keywords: Oryza sativa L.; Yellow-green leaf mutant; YGL1; Genetic analysis; Fine mapping
植物叶色是叶绿体中各种色素的综合表现, 正
常叶片中叶绿素占优势, 通常表现为绿色[1]。自然或
人为诱变导致叶绿素合成直接或间接相关的基因发
生突变, 造成叶绿素合成或降解受阻的一类突变体
被称为叶色突变体。大多数突变基因在苗期开始表
达, 通常表现黄化、白化、浅绿、条纹、斑点等症
状。在大麦[2]、小麦[3]、拟南芥[4]、水稻[5]、油菜[6]
等植物中均见到叶色突变, 其诱变频率较高且易于
鉴定。利用这类突变体, 可以帮助人们更好地了解
植物光合作用、叶绿素生物合成、光化学反应调节,
以及光合系统构建等相关机制。此外, 还可以考虑
将其作为标记性状应用于遗传育种。
水稻是世界重要的粮食作物之一, 也是单子叶
模式植物。至今, 水稻中已报道80多个与叶色突变相
关 的 基 因 (http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/
genes/traitGeneClasses.jsp)。叶色突变的机制主要包
括叶绿素生物合成途径相关基因的突变, 血红素生
物合成途径中的基因突变, 编码其他叶绿体蛋白的
基因突变, 与光合系统无直接关系的基因突变等。
从谷氨酰-tRNA 到叶绿素 a 和叶绿素 b 的整个生物
合成过程需要15步反应, 涉及15种酶, 在拟南芥中
已成功克隆了编码这15种酶的27个基因[7-8]。在水稻
中, 已克隆了编码参与叶绿素生物合成的9个基因,
即第 3染色体上编码 Mg2+-螯合酶 3个亚基的
OsChlH、OsChlD 和 OsChlI 基因[9-10]以及编码联乙
烯还原酶的 OsDVR 基因[11], 第4染色体上编码原叶
绿素酸酯氧化还原酶 A 的 OsPORA 基因[12], 第5染
色体上编码叶绿素合酶的 YGL1基因 [13], 第10染色
体上编码叶绿素酸酯 a加氧酶的OsCAO1和OsCAO2
基因 [14]以及编码原叶绿素酸酯氧化还原酶 B 的
OsPORB基因[12]。
本研究通过 EMS诱变获得 1份水稻黄绿叶突变
体 ygl80, 其整个生育期均表现为黄绿叶 , 利用
(ygl80/浙辐 802) F2群体实现了该黄绿叶突变基因的
分子标记定位。精细定位和测序结果表明, 编码叶
绿素合酶的 YGL1 (LOC_Os05g28200)基因在编码区
第 5027碱基处(位于第 14外显子), 碱基 C突变为碱
基 T, 使编码蛋白的氨基酸序列第 348 位的脯氨酸
(Pro)突变成亮氨酸(Leu), 推测该基因是造成 ygl80
黄绿叶突变性状的候选基因。
1 材料与方法
1.1 供试材料及田间试验
10079为来自于粳稻品种日本晴(Oryza sativa L.
subsp. japonica, cv. Nipponbare)的一个迟熟突变品
系, 由中国科学院遗传与发育生物学研究所储成才
研究员和方军博士提供。用化学诱变剂 EMS 处理
10079, 获得一份黄绿叶突变体 ygl80, 经过多代自
交, 突变体表型稳定遗传。将 ygl80分别与野生型亲
本 10079 和籼稻品种浙辐 802 杂交, 在四川成都分
别播种亲本、F1 和 F2, 从苗期开始观察叶色表现。
成熟期调查突变体 ygl80 和野生型亲本 10079 的株
高、有效穗、穗长、每穗着粒数、结实率、千粒重
等主要农艺性状, 每个样本 3次重复(小区), 调查样
本数 15株。
1.2 叶绿素含量测定
参照 Lichtenthaler[15]的方法, 在大田苗期和孕
穗期, 分别取 ygl80 突变体及其野生型亲本的上部
叶片, 每个材料重复 3次, 每个重复从同样的 5个植
株上混合取 0.2 g叶片, 剪碎浸泡在 15 mL的 80%丙
酮溶液中, 于 4℃避光浸提 48 h, 中间震荡数次, 最
后定容至 25 mL。用紫外分光光度计(UV-1700)测定
提取液在 663、646和 470 nm波长下的吸光值。叶
绿素 a 含量(mg g–1) = (12.21A663 − 2.81A646) V /
1000 W, 叶绿素 b 含量 (mg g–1) = (20.13A646 −
5.03A663) V/ 1000 W, 类胡萝卜素含量(mg g–1) =
(1000A470 − 3.27Ca − 104Cb) V / (229 × 1000 W), 式
中, V为叶绿素提取液总体积(mL), W为叶片鲜重(g),
Ca = 12.21A663 − 2.81A646, Cb = 20.13A646 − 5.03A663。
1.3 定位群体的构建和 DNA的提取
根据叶色调查与分析结果, 从 ygl80与浙辐 802
杂交所得 F2群体中, 选取 20株正常绿苗和 627株黄
苗构建成定位群体, 分单株提取总 DNA。从 F2植株
中随机选取 10 株正常单株和 10 株突变单株剪取等
量叶片 , 将正常绿苗和黄绿苗单株叶片分别混合 ,
构建正常基因池和突变基因池。用 McCouch等[16]的
方法提取水稻叶片中的 DNA。
1.4 分子标记分析和遗传连锁图谱的构建
参照 http://www.gramene.org/microsat的 SSR引
物标记, 并运用 Primer5.0 软件自行设计插入缺失
646 作 物 学 报 第 40卷

(InDel)标记。SSR 和 InDel 引物由北京六合华大基
因科技股份有限公司合成。参照 Panaud等[17]的 PCR
反应体系, 扩增产物经 3.0%~4.0%琼脂糖凝胶电泳
和溴化乙锭染色后, 用凝胶扫描成像系统记录电泳
分离结果。用 MapMaker3.0 软件进行遗传作图, 用
Kosambi 函数将重组率转化为遗传距离(cM), 构建
目标基因所在区域的分子标记连锁图谱。
1.5 候选基因的遴选与测序
利用水稻基因组注释数据库数据 (http://rice.
plantbiology.msu.edu/), 根据 ygl80 突变体的突变性
状, 以及分子标记与目标基因的遗传距离和物理距
离, 在突变基因精细定位的染色体区段上遴选 ygl80
突变体的候选基因。设计预测基因的引物序列, 分
别对野生型和突变体基因组中预测基因序列进行
扩增、测序和序列比对, 最终确定突变位点和候选
基因。
2 结果与分析
2.1 突变体的形态特征及主要农艺性状表现
ygl80 突变体生育期均为黄绿色, 明显区别于其
野生型亲本 10079 (图 1)。在成熟期, 与其野生型亲

图 1 突变体 ygl80(右)与其野生型亲本 10079(左)在苗期(A)及拔
节期(B)植株形态
Fig. 1 Plant phenotype of ygl80 (right) and its wild-type parent
10079 (left) at the seedling (A) and elongation (B) stages

本相比, ygl80突变体的株高、每株有效穗数、每穗着
粒数、穗长和千粒重分别减少 14.8%、16.5%、21.3%、
9.1%和 7.4%, 其他农艺性状差异不显著(表 1)。
2.2 突变体的光合色素含量
ygl80 在苗期和孕穗期的叶绿素 a 含量分别为
0.89 mg g–1和 0.81 mg g–1, 分别比野生型亲本降低
72.36%和 49.69%; 叶绿素 b含量分别为 0.07 mg g–1
和 0.13 mg g–1, 分别降低 92.13%和 71.74%; 类胡萝
卜素含量分别为 0.42 mg g–1和 0.30 mg g–1, 分别降
低 53.85%和 41.18% (表 2), 表明 ygl80 的突变性状
主要由光合色素含量下降引起。

表 1 突变体 ygl80与其野生型亲本 10079主要农艺性状的比较
Table 1 Comparison of major agronomic traits between the ygl80 mutant and its wild-type parent 10079
性状
Trait
10079 (CK) ygl80
比对照增减
Compared to CK (%)
抽穗期 Days to heading (d) 119.0±0.6 121.0±1.0 1.7
株高 Plant height (cm) 101.9±0.5 86.8±1.6 –14.8*
每株有效穗数 Number of productive panicles per plant 11.5±0.5 9.6±0.6 –16.5*
穗长 Panicle length (cm) 19.7±0.5 17.9±0.2 –9.1*
每穗着粒数 Number of spikelets per panicle 111.5±5.9 87.8±5.6 –21.3*
结实率 Seed setting rate (%) 91.9±1.9 89.0±1.3 –2.9
千粒重 1000-grain weight (g) 24.3±0.5 22.5±0.1 –7.4*
*在 0.05水平上差异显著。*Significantly different at 0.05 probability level.

表 2 苗期和孕穗期 ygl80突变体与其野生型亲本 10079叶片光合色素含量的比较
Table 2 Comparison of photosynthetic pigment contents between the ygl80 mutant and its wild-type parent 10079 during
seedling and booting stages
生育期
Growth stage
材料
Material
叶绿素
Chl (mg g–1)
叶绿素 a
Chl a (mg g–1)
叶绿素 b
Chl b (mg g–1)
叶绿素 a/b
Chl a/b
β-胡萝卜素
β-Car (mg g–1)
10079 (CK) 4.11±0.02 3.22±0.02 0.89±0.00 3.62±0.02 0.91±0.01
ygl80 0.96±0.00 0.89±0.00 0.07±0.00 12.71±0.18 0.42±0.00
苗期
Seedling stage
比对照增减 Compared to CK –76.64%** –72.36%** –92.13%** 9.09** –53.85 %**
10079 2.07±0.04 1.61±0.05 0.46±0.01 3.50±0.16 0.51±0.03
ygl80 0.94±0.04 0.81±0.03 0.13±0.01 6.23±0.83 0.30±0.02
孕穗期
Booting stage
比对照增减 Compared to CK –54.59%** –49.69%** –71.74 %** 2.73** –41.18%**
*在 0.05水平上差异显著。*Significantly different at 0.05 probability level.

第 4期 李燕群等: 水稻 ygl80黄绿叶突变体的遗传分析与目标基因精细定位 647


2.3 突变性状的遗传分析
将 ygl80分别与野生亲本 10079和籼稻品种浙辐
802杂交, F1植株均表现为正常绿叶, F2代群体中正
常绿苗与黄绿苗分离明显, 分离比例经卡方(χ2)测验
符合 3∶1 (表 3), 表明 ygl80的突变性状由 1对隐性
核基因控制。
2.4 突变基因的分子标记定位
以 ygl80与浙辐 802杂交 F2群体为定位群体, 用
350对较均匀分布于水稻 12条染色体上的 SSR引物
对亲本浙辐 802和 ygl80的 DNA片段进行扩增, 然
后用在两亲本间表现出多态的引物扩增正常绿苗和
黄绿苗植株近等基因池, 再用在池中检测到多态的
引物分别扩增 F2植株。结果发现, 位于水稻第 5 染
色体长臂的 SSR 标记 RM5140 和 RM430 与目标基
因存在连锁关系, 遗传距离分别为 8.4 cM和 11.9 cM
(图 2-A)。为了进一步定位目标基因, 根据粳稻日本
晴和籼稻 9311序列差异进一步设计多对 InDel标记
(表 4), 最终将 ygl80 定位在 InDel标记 C2 和 C3 之
间, 遗传距离分别为 0.24 cM和 0.39 cM (图 2-B), 物
理距离约为 90 kb (图 2-C)。

表 3 突变体 ygl80与正常绿色品系杂交 F2的叶色分离
Table 3 Segregation of leaf color in F2 population from the crosses between ygl80 mutant and green leaf varieties
杂交组合
Cross-combination
总株数
Total number of
plants
绿叶植株数
Number of green leaf
plants
黄绿叶植株数
No. of yellow-green
leaf plants
期望比
Expected ratio
χ2 P
ygl80/10079 478 351 127 3:1 0.547 0.25–0.50
ygl80/Zhefu802 2606 1979 627 3:1 1.179 0.25–0.50

表 4 本研究开发的多态性 InDel标记
Table 4 Developed polymorphic InDel markers in this study
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
所在 BAC
Originated BAC
C1 GTATCGTCATGCGTCAAC AGAGGCAGGAACCAACCC AC104706
C2 GCGGTTGAAGGCGTCGTA AGGGTGCTGAGTCACAATAGGT AC144742
C3 CCCAATGTCTGGTTCTTT CTCTGGCTTCTCCTTCTG AC136221
C4 TTTGGTGGGTAGGTGGTG AATAGAGGGTTCGGCATC AC136221

2.5 突变基因的候选基因分析与测序验证
在上述 90 kb 的定位区域内共有 11个预测基因,
其中包括编码叶绿素合酶的 YGL1 (LOC_Os05g28200)
基因(表 5)。根据 InDel标记 C2和 C3与 ygl80突变
基因的遗传距离(图 2-B), 从 ygl80 突变体及其野生
型亲本 10079中扩增出 YGL1基因。DNA测序结果
显示, ygl80突变体在 YGL1基因编码区第 5027碱基
处(位于第 14外显子), 碱基C突变为碱基T (图 2-D),
使编码蛋白的氨基酸序列第 348 位的脯氨酸(Pro)突
变成亮氨酸(Leu), 推测该基因是造成 ygl80 黄绿叶
突变性状的候选基因。
3 讨论
叶绿素由一个含 Mg 的卟啉环和一条长的碳侧
链(叶绿醇)组成, 以蛋白复合物的形式存在于叶绿
体内, 在光捕获和反应中心的能量转移中扮演着重
要角色[18-20]。高等植物的叶绿素分为两类。它们唯
一的区别在卟啉 D 环上, 叶绿素 a 是一个甲基而叶
绿素 b 是一个醛基[21]。通过叶绿素循环叶绿素 a 和
叶绿素 b可以相互转化, 一方面叶绿素酸酯 a由叶绿
素酸酯 a 加氧酶和叶绿素合酶依次催化形成叶绿素
b, 另一方面叶绿素 b 由叶绿素 b 还原酶和 7-羟甲基-
叶绿素 a 还原酶依次催化形成叶绿素 a [21-25]。在叶
绿素循环中, 叶绿素合酶可以利用叶绿素酸酯、牛

图 2 ygl80黄绿叶基因在水稻第 5染色体长臂上的分子连锁图
Fig. 2 Linkage map of the ygl80 yellow-green leaf gene on the
long arm of rice chromosome 5
648 作 物 学 报 第 40卷

表 5 水稻第 5染色体定位区间内基因及其推测功能
Table 5 Genes and their putative functions in the target interval
基因名称
Gene name
推测功能
Putative function
LOC_Os05g28170 Expressed protein
LOC_Os05g28180 AMP deaminase, putative, expressed
LOC_Os05g28190 RanBP1 domain containing protein, expressed
LOC_Os05g28200 Prenyltransferase, putative, expressed
LOC_Os05g28210 Small hydrophilic plant seed protein, putative, expressed
LOC_Os05g28220 Retrotransposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os05g28240 Retrotransposon protein, putative, unclassified
LOC_Os05g28250 Retrotransposon, putative, centromere-specific
LOC_Os05g28260 Expressed protein
LOC_Os05g28270 Transposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os05g28280 Peptidase, M24 family protein, putative, expressed

儿基牛儿基二磷酸或植基焦磷酸作为底物, 催化叶
绿素酸酯形成叶绿素 a或叶绿素 b, 但不能利用细菌
叶绿素酸酯作为底物, 这可能与叶绿素合酶独特的
基序同底物叶绿素酸酯的结合有关[13,26-27]。
在水稻、燕麦和拟南芥等高等植物中, 编码叶
绿素合酶的基因已被鉴定[13,28-29]。在水稻中, 编码叶
绿素合酶的 YGL1 基因被定位于第 5 染色体长臂上,
是一个单拷贝基因, 全长约 5.8 kb, 有 15 个外显子
和 14个内含子, cDNA全长 1672 bp, 编码由 376个
氨基酸组成的酶蛋白。YGL1基因相应的突变体 ygl1
是籼稻品种镇恢 249 的一个自然突变体, 苗期叶片
黄化, 中期慢慢转绿, 后期叶色以及叶绿素和类胡
萝卜素的含量接近野生型[13,30]。ygl1 的单碱基突变
发生在第 8外显子上, 由碱基 T突变为碱基 C, 造成
编码的氨基酸序列在 198 位上的脯氨酸(Pro)突变成
丝氨酸(Ser) [13,30]。本研究表明, 经 EMS化学诱变而
来的 ygl80 突变体在整个生长发育期均表现为黄绿
叶, 该突变体在编码叶绿素合酶的 YGL1 (LOC_Os05g
28200)基因的编码区第 5027碱基处(位于第 14外显
子), 碱基 C 突变为碱基 T, 使编码蛋白的氨基酸序
列第 348 位的脯氨酸(Pro)突变成亮氨酸(Leu), 故突
变基因是已报道的编码叶绿素合酶的 YGL1 基因的
等位基因。
通过比对水稻叶绿素合酶与不同物种叶绿素合
酶 AtCHLG、AsCHLG、SCHLG、RcbchG、RsbchG、
HmbchG和 CabchG的氨基酸序列, 发现第 348位的
脯氨酸位点在所有物种中是非常保守的, 而第 198位
的脯氨酸位点在水稻、燕麦和拟南芥等高等植物中是
保守的, 但对所有物种, 相比而言较为不保守[13]。因
此, ygl80突变体和 ygl1突变体表型的差异, 可能是
由于 YGL1 基因序列突变位点不同, 引起所编码的
叶绿素酶活性降低程度不同造成的。
4 结论
水稻黄绿叶 ygl80 突变体与野生型相比, 叶片
叶绿素含量下降, 株高、每株有效穗数、每穗着粒
数、穗长和千粒重减少。ygl80的突变性状由 1对隐
性核基因控制。该突变基因被定位在第 5 染色体长
臂上 90 kb 区间内, 是由编码叶绿素合酶的 YGL1
(LOC_Os05g28200)基因编码区第 5027 碱基突变而
来。该基因是已报道的水稻 ygl1黄绿叶突变基因的
等位基因, 不同的突变位点导致 ygl80 和 ygl1 存在
部分表型差异。ygl80的发现对丰富和深入理解水稻
叶色形成和调控的机制, 及丰富水稻特异种质资源
具有一定的意义。
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