全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (2) : 138～ 142
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
低温胁迫下枇杷幼叶细胞内 Ca2+ 水平及
细胞超微结构变化的研究Ξ
陈由强1　叶冰莹1　高一平2　陈文列3
(1 福建师范大学生物工程学院　福州　350007)
(2 福建省环境监测中心　福州　350007)　 (3 福建医科大学电镜室　福州　350001)
提　要　用焦锑酸钾沉淀的电镜细胞化学方法, 研究了低温胁迫下枇杷幼叶细胞内 Ca2+ 水
平变化。研究结果表明, 枇杷幼叶细胞未经低温处理时, Ca2+ 定位分布的沉淀颗粒大量出现
在细胞壁、细胞间隙、质膜和液泡; 叶绿体、细胞质和细胞核中也有一些 Ca2+ 沉淀颗粒分布。
枇杷幼叶经 44 h、4℃低温处理后, 在质膜和液泡膜上 Ca2+ 的沉淀增多, 细胞质和细胞核中的
Ca2+ 水平增加。不抗寒品种在低温胁迫条件下可见核孔开口较大, 有时可观察到核内容物外
漏。抗寒品种在低温胁迫条件下核孔未见明显开口, 叶绿体中类囊体不形成基粒, 少数片层结
合重叠后伸展在整个叶绿体中。而不抗寒品种类囊体则堆积形成明显的颗粒状基粒, 类囊体
片层数量较多。在 2 个叶绿体之间还常可见到线粒体紧夹其间, 但线粒体的内膜模糊不清。不
抗寒品种内质网和高尔基体也较多见, 内膜系统比较发达, 但低温胁迫条件下膜系统易受破
坏, 膜结构模糊不清。
关键词　枇杷, 低温胁迫, 钙细胞化学, 膜结构
CHANGES OF THE L EVEL OF Ca2+ IN CELL S OF LO -
QUAT L EAFL ETS UND ER LOW TEM PERATURE STRESS
Chen Youqiang1　Ye B ingying1　Gao Y ip ing2　Chen W en lie3
(1 B ioeng ineering Colleg e, F uj ian T eachers U n iversity　Fuzhou　350007)
(2 F uj ian E nv ironm en ta l M on itoring Cen tre　Fuzhou　350007)　 (3 F uj ian M ed ica l U n iversity　Fuzhou　350001)
Abstract 　T he changes of Ca2+ localizat ion in cells of loquat (E riobotry a jap on ica L indl. )
leaflets under ch illing stress w ere investigated w ith calcium antimonate p recip ita te2
electrom icro scop ic2cytochem ical m ethods. W hen loquat leaflets grew at the op tim um
temperatu re, it w as show n that the depo sits of calcium antimonate, being the indicato r fo r Ca2+
localizat ion, m ain ly concen tra ted w ith in the vacuo les and in tercellu lar spaces, and that there w as
also som e Ca2+ depo sits in p last id, m itochondria, cytop lasm and nucleus. T h is indicates that
under the no rm al condit ion, the vacuo les are the m ain poo l of Ca2+ in p lan t cells, and that thereΞ 收稿日: 1999210225, 修回日: 1999204219。第一作者: 男, 1956 年出生, 副教授 (博士)。现从事植物生理学和植物分子生物学研究。福建省教委科学研究基金资助项目 (编号: K95017)。
is qu ite an amount of Ca2+ in the in tercellu lar spaces. O n the con trary, the free Ca2+ in
cytop lasm and nucleus is very low under the no rm al condit ion. W hen the loquat leaflet w as
treated at the temperatu re of 4℃ fo r 44 hours, the level of Ca2+ in cytop lasm and nucleus
increased considerab ly. U nder the ch illing stress, there are a great amount of Ca2+ depo sits in
vacuo lar, ch lo rop last, p lasm a m em brane and vacuo le m em brane. T he m em brane of nucleus in the
co ld sensib le variety had been dam aged and som e nuclear substance let ou t. T here w ere on ly
strom a thylako ids in the cells of co ld resistan t variety, w h ile m any basal granu les in the co ld
sensib le variety. T he m em brane of ch lo rop lasts had been dam aged.
Key words 　 Calcium cytochem istry, Calcium m essenger, E riobotry a jap on ica , P lan t co ld2
resistance
Ca2+ 起着与环化腺苷酸 (cAM P) 相类似的作用, 是调节多种细胞功能的一种细胞内
第二信使〔1〕。Ca2+ 对作物不仅仅是一种大量元素, 更重要的是作为偶连胞外信号与胞内生
理生化反应的第二信使, 以及植物代谢和发育的主要调控者〔2, 3〕。近年来, 有关低温引起植
物细胞内Ca2+ 水平的变化已有一些研究〔4～ 6〕, 但大多集中在农作物, 如水稻、黄瓜等, 有关
果树等木本植物这方面的研究尚未见报道。枇杷是亚热带地区果树之一, 经济价值高, 但
在生产实践中常因低温引起冻害。本研究试图通过低温引起枇杷幼叶细胞内Ca2+ 水平变
化的细胞化学观察, 进一步阐明枇杷低温危害的机理, 为探索克服低温危害的新措施提供
理论指导。
1　材料与方法
111　材料及低温处理
采用枇杷 (E riobotry a jap on ica L indl. ) 抗寒品种长红和不抗寒品种解放钟为试验材
料, 由福建农科院果树研究所提供。取样时间为枇杷生长季节的 1997 年 5 月。将小枝水
培, 材料置 4℃冰箱中 44 h, 进行低温冷害处理。未经低温冷害处理的材料直接固定。
112　Ca2+ 的细胞化学方法
采用Bo rger〔7〕等的方法, 略有修改, 步骤简述如下。①取材: 将枇杷幼叶切成 0. 5 mm
×3 mm 的组织块。②初固定: 将切好的组织块迅速投入用 2% 的焦锑酸钾 (pH 7. 6, 用 100
mmo löL pH 7. 1 的磷酸缓冲液配制)配制的 3% 戊二醛固定液中, 4℃固定 4 h。③洗涤: 用
含 2% 焦锑酸钾的磷酸缓冲液 (pH 7. 6)洗涤 3 次, 每次约 0. 5 h。④后固定: 将洗涤过的材
料转移至用含 2% 焦锑酸钾的缓冲液 (pH 7. 6) 配制的 1 % 锇酸中, 4℃冰箱内固定过 4 h。
⑤洗涤: 先用重蒸水洗涤 4 次, 再用 (pH 10. 0)的重蒸水洗涤 2 次, 每次约 0. 5 h. 随后经系
列冷乙醇脱水, 丙酮过渡; 环氧树脂 618 包埋,L KB 25 型超薄切片机切片, 切片经醋酸双
氧铀染色; 在日立H u212A 型电子显微镜下观察照相。对照切片的处理是将在电镜下已确
定有焦锑酸钾沉淀的定位切片漂浮在 100 mmo löL 的 EGTA (pH 8. 0) 溶液中, 60℃处理
0. 5～ 1 h, 使Ca2+ 与 EGTA 螯合, 脱去原沉淀中的Ca2+ , 再置于电镜下观察照相。
2　观察结果
211　未经低温处理枇杷幼叶细胞内Ca2+ 的定位分布
电镜观察结果表明, 钙离子定位分布的焦锑酸钙沉淀颗粒大量出现在细胞内的液泡
931　第 2 期　　　　　　陈由强等: 低温胁迫下枇杷幼叶细胞内Ca2+ 水平及细胞超微结构变化的研究
中。无论是幼龄细胞中的小液泡, 或是成熟细胞中的大液泡, 均产生大量的焦锑酸钙沉淀
颗粒, 在细胞外的细胞间隙内出现大量的焦锑酸钙沉淀颗粒 (图版É : 1)。这种现象随机观
察到的机率很高, 几乎在所有选取的视野中都会观察到。在叶绿体和线粒体以及细胞质和
核基质中有时也会观察到一些焦锑酸钾沉淀 (图版É : 2)。一些研究指出, 内质网是一种
Ca2+ 库, 其中有较多 Ca2+ 的分布〔8〕, 但我们未找到内质网中有Ca2+ 存在的明显证据 (图
版É : 3)。
以上观察到的沉淀颗粒, 在切片经过 EGTA 处理后, 沉淀物即被消除, 在原有Ca2+
分布的部位上 (如液泡、细胞间隙等处) 表现出透明区域, 说明切片中的Ca2+ 定位反映是
真实的 (图版É : 4)。
212　低温胁迫下枇杷幼叶细胞中Ca2+ 分布的变化
枇杷幼叶经过 4℃低温处理 44 h, 其幼叶细胞内的Ca2+ 分布发生改变。图版É : 5 和
图版Ê : 6 是幼叶经冷处理 44 h 后幼叶组织切片照片, 它显示细胞超微结构形态仍保持
低温胁迫前的正常状态, 无明显的变化; 但在细胞质中的Ca2+ 沉淀增加, 显示细胞质游离
Ca2+ 水平的提高; 在液泡内看不到有大量的Ca2+ 分布。当枇杷幼叶经 44 h, 4℃冷处理后,
除在细胞质观察到Ca2+ 沉淀增加外, 钙库液泡中的许多Ca2+ 也分布在液泡膜的内侧, 液
泡中心部分的Ca2+ 分布似乎有减少的趋势, 有些颗粒趋向靠近液泡膜。在质膜和液泡膜
上Ca2+ 的沉淀也增多了。简而言之, 低温胁迫使Ca2+ 由液泡向胞质转移。而且, 使质膜和
液泡膜上所结合的Ca2+ 浓度增加。
213　枇杷不同抗寒品种幼叶细胞超微结构的变化
枇杷抗寒品种幼叶细胞叶绿体中类囊体不形成基粒, 少数片层结合重叠后伸展在整
个叶绿体中。2 个叶绿体之间极少见线粒体夹于其间。核孔未见明显开口。线粒体嵴清晰
(图版Ê : 7)。不抗寒品种类囊体则堆积形成明显的颗粒状基粒, 类囊体片层数量多。在 2
个叶绿体之间常可见线粒体紧夹其间 (图版Ê : 8) , 线粒体的内膜模糊不清。核孔可见较大
开口, 有时可观察到核内容物外漏 (图版Ê : 9) , 观察中发现内质网和高尔基体较多见 (图
版Ê : 10) , 内膜系统比较发达, 但低温胁迫条件下膜系统易受破坏, 膜结构模糊不清。
3　讨论
上述结果表明, 在正常情况下, 细胞内液泡中和细胞外的细胞间隙中Ca2+ 的水平很
高。Ca2+ 既是一种大量元素, 又是植物代谢和发育的主要调控者。目前, 已建立了较为完
整的植物细胞内Ca2+ 信使系统的概念〔1, 8, 9〕。当细胞受到低温胁迫刺激时, 从质外体经质
膜或从胞内贮Ca2+ 体流向胞液的Ca2+ 量增大, 使胞质中Ca2+ 浓度提高。Ca2+ 浓度变化可
将外界信息表达为生理生化过程, 完成信息传递。这样通过在胞质内的Ca2+ 浓度变化, 可
以把细胞外的信息传递到细胞内, 调节相应的生理过程, 这就是Ca2+ 信使功能作用模
式〔1, 2, 8, 9〕。已发现许多生理生化反应都受Ca2+ 的调控, 如光、激素、重力等原初信号调节的
生理反应都通过操纵胞内Ca2+ 水平而实现; 胞内Ca2+ 水平的改变能导致细胞代谢过程的
改变而引起生理反应〔10～ 14〕。因此, 在低温影响细胞的过程中, 测定胞质中Ca2+ 浓度的变
化是判断低温反应与信使介导关系的一个关键。胞壁是细胞最大的Ca2+ 库。植物体在低
温作用下的信息传递迄今知之不多。近年来, 关于低温和盐碱等逆境因子引起胞内Ca2+
041 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　　
水平的变化已有初步报道, 并引起逆境生理研究者的广泛注意〔4～ 6, 15～ 17〕。
我们的观察结果显示, 枇杷幼叶在低温胁迫下细胞质的Ca2+ 浓度显著增加, 这与王
红等对水稻的观察结果是一致的〔5〕。依据已有的有关Ca2+ 信使功能的知识, 胞内Ca2+ 水
平的提高, 会造成细胞骨架和膜结构的破坏。膜结构的变化也会使膜的透性发生变化, 最
终导致细胞内物质代谢的不平衡。此外, 细胞质内Ca2+ 水平过度增加还会扰乱以Ca2+ 、无
机磷为基础的能量代谢系统。由于Ca2+ 信使诱发的这一系列变化, 致使枇杷幼叶发生低
温伤害。目前, 外界信息如何引起胞内Ca2+ 浓度的变化已成为Ca2+ 信使系统研究中的热
点。外界信息可通过引起膜透性的变化而引起胞内Ca2+ 浓度的变化, 以及外界信号也可
通过开启或关闭膜上的Ca2+ 通道而引起胞内Ca2+ 浓度的改变。这些Ca2+ 通道可能是镶
嵌在膜脂双分子层中的蛋白质颗粒, 其开关受膜势及其蛋白质磷酸化的控制。我们研究结
果显示, 冷处理后在细胞质中观察到Ca2+ 沉淀增加, 液泡中的许多Ca2+ 分布在液泡膜的
内侧, 液泡中心部分的Ca2+ 分布减少。低温胁迫条件下在质膜和液泡膜上Ca2+ 的沉淀也
增多了, 这些结果说明, 枇杷幼叶细胞膜结合Ca2+ 与其抗寒性关系密切。此外, 枇杷抗寒
品种幼叶细胞叶绿体中类囊体不形成基粒, 少数片层结合重叠后伸展在整个叶绿体中。2
个叶绿体之间极少见线粒体夹于其间。核孔未见明显开口, 线粒体嵴清晰。不抗寒品种类
囊体则堆积形成明显的颗粒状基粒, 类囊体片层数量多。在 2 个叶绿体之间常可见线粒体
紧夹其间, 但线粒体的内膜模糊不清。内质网和高尔基体较多, 内膜系统比较发达。低温
胁迫条件下核孔可见较大开口, 有时可观察到核内容物外漏, 膜系统易受破坏, 膜结构模
糊不清。不抗寒品种低温胁迫条件下细胞的超微结构尚未出现其他明显破坏性变化, 这表
明低温胁迫条件下细胞内外Ca2+ 分布的变化较为敏感, 而细胞超微结构更为明显破坏性
变化一般都发生在寒害较为严重之时。
参　考　文　献
1　龚明, 李英, 曹宗巽. 植物体内的钙信使系统. 植物学通报, 1990, 7 (3) : 19～ 29
2　Kauss H. Som e aspects of calcium 2dependen t regu lation in p lan t m etabo lism. A nn R ev P lan t P hy siol, 1987, 38:
47～ 72
3　H ep ler P K,W ayne R O j. Calcium and p lan t developm ent. A nn R ev P lan t P hy siol, 1985, 36: 397～ 439
4　M ack lon A E S, Sin A. Co rtical cell fluxes and transpo rt to the stele ion excised roo t segm ents of A llium cep a L.
P lan ta, 1981, 152: 381～ 387
5　王红, 简令成, 张举仁. 低温胁迫下水稻幼叶细胞内Ca2+ 水平的变化. 植物学报, 1994, 36 (8) : 587～ 591
6　M ino rsky P V , Spansw ick R W. E lectrophysio logical evidence fo r a ro le fo r calcium in temperatu re sensing by
roo ts of cucum ber seedlings. P lan t Cell E nv iron, 1989, 12: 137～ 143
7　Bo rgers M , T hone F J M , Xhonneux B J M. L ocalization of calcium in red b lood cells. J H istochem Cy tochem ,
1982, 31: 1 109～ 1 116
8　Som ly A P. Cellu lar site of Ca2+ regu lation. N atu re, 1984, 309: 516～ 517
9　Rasm ussed H , Barrett P Q. Calcium m essenger system: an in tegrated view. P hy sl R ev , 1984, 64: 938～ 984
10　Poovaian B W , Reddy A S N , M cFadden J J. Calcium m essenger system : ro le of p ro tein pho spho rylation and
ino sito l b ispho spho lip ids. P hy siol P lan ta rum , 1987, 69: 569～ 573
11　毛节, 陈玉银, 缪颖. 甘蓝油菜雌蕊中花粉管生长途径的钙离子定位. 植物学报, 1992, 34: 233～ 236
12　何才平. 钙与植物的向性生长. 植物学通报, 1992, 9 (1) : 21～ 25
13　J ian L C, Sun L H , Dong H Z. P lan t Co ld H ardiness and F reezing Stress. V o l 2. N ew Yo rk: A cadem ic P ress, 1982.
141　第 2 期　　　　　　陈由强等: 低温胁迫下枇杷幼叶细胞内Ca2+ 水平及细胞超微结构变化的研究
243～ 259
14　W illiam son R E, A sh ley C C. F ree Ca2+ and cytop lasm ic stream ing in alga Chara. N atu re, 1982, 296: 647～ 651
15　L ynch J , Po lito V Sl, L auch li A. Salin ity stress increases cytop lasm Ca activity in m aize roo t p ro top lasts. P lan t
P hy siol, 1989, 90: 1 271～ 1 274
16　T sien R Y, Pozzan T , R ink T J. Calcium hom eo stasis in in tact lymphocytes: cytop lasm ic free calcium monito red
w ith a new. In tracellu larly trapped fluo rescen t indicato r. J Cell B iol, 1982, 94: 325～ 334
17　Saunders M J , H elper P K. L ocalization of m em brane2associated calcium fo llow ing cytok in in treatm en t in Funaria
using ch lo ro ttracycline. P lan ta, 1981, 152: 272～ 281
图版说明
CP. 细胞质; ER. 内质网; Is. 细胞间隙; M. 线粒体; N. 细胞核; F. 间质片层; Pm. 质膜; Vm. 液泡膜; V. 液泡; N e 核
膜; N p 核膜孔; Cw. 细胞壁; G. 高尔基体
图 版 É
1. 示细胞液泡及细胞间隙的焦锑酸钙沉淀 (×9 000) ; 2. 示细胞核. 线粒体, 核基质和叶绿体也出现一些焦锑酸钙沉
淀 (×13 000) ; 3. 示内质网膜看不到焦锑酸钙沉淀 (×21 000) ; 4. 示经EGTA 处理的对照切片. 在原来形成沉淀的
部位成为透明区域 (×7 000) ; 5. 示经 44 h、4℃低温处理的枇杷幼叶显示细胞质中和质膜上的钙沉淀物增加。细胞
壁、细胞间隙钙沉淀物减少 (×12 000)
图 版 Ê
6. 示经 44 h、4℃低温处理的枇杷幼叶液泡内钙沉淀物减少。质膜和液泡膜上的钙沉淀物增加 (×24 000) ; 7. 示枇杷抗
寒品种细胞全貌 (×9 000) ; 8. 示枇杷不抗寒品种细胞全貌 (×9 000) ; 9. 示枇杷不抗寒品种核膜开口 (×16 000) ;
10. 示枇杷不抗寒品种高尔基体 (×18 000)
Explanation of Pla tes
CP. P lasm alemm a; ER. Endop lasm ic reticu lum; Is. In tercellu lar space; M. M itochondria; N. N uclei; F. Strom a
thylako ids; V. V acuo le; N e. N uclear m em brane; N p. N uclear po re; Cw. Cell w all; G. Go lgi body; Vm. V acuo le
m em brane; Pm. p lasm a m em brane
P late É
1. T he calcium an timonate p recip itates visualized in in tercellu lar spaces and vacuo les (×9 000) ; 2. T he calcium
an timonate p recip itates visualized in, m itochondria, nuclear substance and ch lo rop last (× 13 000) ; 3. N o calcium
an timonate p recip itates on (×21 000) ; 4. Sections treated w ith EGTA , show ing electron ic transparen t areas at the
sam e sites w here the p recip itate located befo re the treatm en t (×7 000) ; 5. T he location of calcium p recip itates
increased in p lasm alemm a and p lasm a m em brane, and decreased in in tercellu lar spaces and on the cell w all , in the cells
of the seedlings treated at 4℃ fo r 44 h (×12 000)
P late Ê
6. T he location of calcium p recip itates decreased in vacuo les, in the cells of the seedlings treated at 4℃ fo r 44 h, and the
location of calcium p recip itates increased in vacuo le m em brane and p lasm a m em brane (×24 000) ; 7. T he cell ou tlook
of the co ld resistan t variety (×9 000) ; 8. T he cell ou tlook of the co ld sensib le variety (×9 000) ; 9. T he open ing on
nuclear m em brane and the leakage of nuclear substance in the co ld sensib le variety (×16 000) ; 10. T he Go lgi bodies in
he cell of co ld sensib le variety (×18 000)
241 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　　
陈由强等: 低温胁迫下枇杷幼叶细胞内Ca2+ 水平及细胞超微结构变化 图版É
Chen Youqiang et a l. : Changes of the level of Ca2+ in cells of loquat leaflets
under low temperatu re st ress P la te É
See exp lanat ion at the end of tex t
陈由强等: 图版Ê Chen Youqiang et a l. : P la te Ê
See exp lanat ion at the end of tex t