全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1766−1774 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2013CBA01401)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 李学勇, E-mail: lixueyong@caas.cn, Tel: 010-82107409; 张文会, E-mail: whzhang@lcu.edu.cn, Tel:
13563589359
第一作者联系方式: E-mail: 306295220@qq.com, Tel: 15011237729
Received(收稿日期): 2013-02-01; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-08-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130801.1725.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01766
水稻极矮突变体 s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究
李晨晨 1,2 侯 雷 1 尹 亮 3 赵金凤 2 袁守江 3 张文会 1,* 李学勇 2,*
1聊城大学生命科学学院, 山东聊城 252059; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北
京 100081; 3 山东省水稻研究所, 山东济南 250100
摘 要: 通过 EMS 诱变日本晴获得 1 个极端矮化突变体 s2-47, 其表型为极度矮化、叶色深绿、不能抽穗结实。对
水稻胚乳的 α-淀粉酶诱导实验表明, s2-47突变体与 GA的信号传导途径无关, 外源活性 GA3对水稻幼苗株高的促进
实验显示 s2-47 应与赤霉素的生物合成有关。利用 s2-47 和 Dular 构建 F2群体并精细定位表明, s2-47 的表型与水稻
OsCPS1基因紧密连锁, 其编码的柯巴焦磷酸合成酶是赤霉素生物合成途径的第一个关键酶。序列分析发现, s2-47突
变体的 OsCPS1基因编码区发生了单个碱基缺失导致移码突变。OsCPS1基因在植株地上部都有表达, 在节中表达最
高。OsCPS1基因的表达受外源 GA3抑制, 但在 s2-47突变体中表达上调。
关键词: 水稻; 矮秆突变体; 赤霉素; 基因定位; OsCPS1基因
Gibberellin Responsiveness and Gene Mapping of Rice Extreme Dwarf Mutant
s2-47
LI Chen-Chen1,2, HOU Lei1, YIN Liang3, ZHAO Jin-Feng2, YUAN Shou-Jiang3, ZHANG Wen-Hui1,*, and
LI Xue-Yong2,*
1 School of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resource and Genetic Improvement
/ Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 Shandong Rice Research Institute, Jinan 250100,
China
Abstract: We have isolated a dwarf mutant s2-47 from Nipponbare mutagenized by EMS, which is an extreme dwarf with dark
green leaves and without reproductive development. GA3 treatment of seedlings and α-amylase activity analysis in endosperm
showed that the mutated gene is involved in GA biosynthesis. Fine mapping showed that the mutant phenotype was tightly linked
with the OsCPS1 locus, which encodes the ent-copalyl diphosphate synthase, the first key enzyme in GA biosynthesis. Sequence
analysis showed that there is a single nucleotide deletion in the 6th exon of the OsCPS1 gene in the s2-47 mutant. OsCPS1 was
expressed in all the above-ground parts of plants with the highest expression in nodes. The OsCPS1 expression was
down-regulated by GA3 treatment but up-regulated in the s2-47 mutant.
Keywords: Rice; Dwarf mutant; Gibberellin; Gene mapping; OsCPS1
20世纪 60年代, 全世界范围内兴起了水稻生产
的“绿色革命”, 以水稻半矮秆基因 SD1 在水稻矮化
育种领域的应用为标志, 大大提高了水稻产量。鉴
于半矮秆基因 SD1 在 “绿色革命”中所起到的重要
作用, 对水稻矮生性状的遗传研究逐渐受到科研工
作者重视[1-8]。SD1编码 GA20氧化酶(GA20 ox2), 在
赤霉素合成中起关键作用 , 催化 GA53→GA44→
GA19→GA20三个反应[9]。D18编码的 GA 3β羟化
酶[10-11]也是赤霉素合成过程中的关键酶。在已报道
的突变体 s2-9和 s1-146a中, GA 3β羟化酶完全失去
催化活性, 不能合成具有生物活性的赤霉素, 突变
体植株表现严重矮化[11]。这种因为不能合成具有生
物活性的赤霉素而发生的突变 , 称为赤霉素缺陷
型。Ueguchi-Tanaka 等[12]在水稻中鉴定出第 1 个赤
第 10期 李晨晨等: 水稻极矮突变体 s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究 1767


霉素受体 GID1。GID1 作为一种可溶性受体介导赤
霉素信号传导, 在与活性的赤霉素结合、感知赤霉
素信号后, 将信号传递到 DELLA蛋白, 从而诱发一
系列下游反应[12-13]。突变体 gid1呈现赤霉素不敏感
的极端矮化表型, 而 GID1 过量表达则会导致赤霉
素超敏感的表型[14]。这种因为赤霉素的信号传导途
径受破坏而发生的突变, 称为赤霉素钝感型。上述
可见, 水稻的矮生性状与赤霉素有着密切的关系。
新的水稻矮生性基因的发掘、研究与应用对于水稻
高产遗传育种及植物激素的分子生物学机制研究具
有重要意义。
赤霉素是一类广泛存在于植物等生物中的二萜
类化合物, 作为一种重要的植物激素, 能调控植物
的多种生长发育过程, 如植物种子的萌发、茎的伸
长、叶片的生长、休眠芽的萌发以及植物的花和种
子的发育等[15]。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranyl-
geranyl diphosphate, GGDP)是一种含 20个碳原的双
萜类化合物,是赤霉素生物合成的前体[16], 经过两步
环化合成内根-贝壳杉烯(ent-kaurene)。第一步反应
是柯巴基焦磷酸合酶 (ent-copalyl diphosphate syn-
thase, CPS)催化 GGDP转变为二环中间产物内根-柯
巴基焦磷酸(ent-copalyl diphosphate, CDP), CPS是正
式进入赤霉素生物合成途径的第 1 个关键酶基因,
CPS 若完全突变, 植物不能产生赤霉素。第 2 步反
应是 CDP 在内根-贝壳杉烯合酶(ent-kaurene syn-
thase, KS)的作用下转变为内根-贝壳杉烯。这两步反
应都是在质体内完成的, 被认为是在总体水平上调
控赤霉素合成的关键位点[17]。
CPS 作为赤霉素合成途径的第 1 个关键基因,
其突变严重影响植物的发育。目前在拟南芥中发现
的 9个 ga1突变体都是 CPS基因不同程度的功能缺
失突变体 , 表现为植株矮化 , 雄性不育 , 严重的等
位突变体不能萌发[18-19]。玉米 an1突变体是 mu转座
子插入 CPS 基因内部造成的, 表现半矮化、节间缩
短、叶子宽而短、雄穗分枝减少、在雌穗上生长花
药等[20]。在豌豆 ls-1突变体中, CPS基因转录本不能
正常拼接, 导致植株矮化, 但花发育和花粉育性正
常[21]。在水稻中, 采用生物信息学方法预测了 4 个
OsCPS 基因 , 并采用反向遗传学手段筛选到
OsCPS1 基因的 2个突变体 oscps1-1和 oscps1-2, 表
现严重矮化, 没有花和种子的发育 [22], 但目前尚缺
乏对水稻 CPS基因及其突变体的详细研究。
本文报道了 1个水稻极端矮化突变体 s2-47, 对
其进行了表型分析, 赤霉素敏感性检测, 以及基因
定位克隆, 发现它是水稻OsCPS1基因的 1个新的等
位突变体。对其进化关系和表达模式的分析及其蛋
白结构域的预测, 加深了对 OsCPS1 基因在赤霉素
合成途径中重要功能的认识。
1 材料与方法
1.1 实验材料
以化学诱变剂甲基磺酸乙酯 (ethyl methylsul-
fonate, EMS)诱变粳稻品种日本晴, M1代按单株收种,
M2代每个株系种植 1行, 大约 20株。在 M2代发现
1个株系分离出 5株极端矮化突变体, 命名为 s2-47,
野生型与突变体符合 3∶1 的分离比例, 说明 s2-47
为单基因隐性突变。该矮化突变体不能抽穗结实 ,
只能通过同 1 个株系中的表型正常的杂合个体繁殖
和保存。使用杂合体与籼稻品种 Dular杂交, F1单株
自交获得 F2群体, 分离产生的极端矮化个体作为基
因定位群体。
1.2 实验方法
1.2.1 GA 处理水稻幼苗 参考王慧等[23]的方
法, 野生型日本晴和 s2-47 杂合体在出芽后于 28℃
光照培养箱内水培 1 周。分别对日本晴和分离出的
极矮个体用 10 mg L−1的外源赤霉素(GA3)溶液处理,
同时设未处理对照。处理 3 d、5 d和 7 d后观察表
型并测量株高。
1.2.2 α-淀粉酶活性测定 采用 Lanahan 等[24]的
碘熏蒸法测定水稻籽粒糊粉层的 α-淀粉酶活性。制
备固体淀粉培养平板, 基本成分为 0.2%马铃薯淀粉
(SIGMA, S4251-100)、2%琼脂、10 mmol L−1 NaAc
和 2 mmol L−1 CaCl2, pH 5.3, 另加 50 μg mL−1氨苄青
霉素用于抑制杂菌生长。用于诱导 α-淀粉酶活性的
平板中再加入 1 μmol L−1 GA3。将日本晴及 s2-47杂
合体种子去壳后用 30%的次氯酸钠表面灭菌 30 min,
并横切种子成两半。种子有胚的一半萌发成苗, 根
据表型是否极端矮化判断该粒种子是否为 s2-47 纯
合突变体。无胚的一半垂直放在淀粉平板上, 30℃黑
暗条件下培养 4 d。用碘(SCR, 10011517)蒸汽熏蒸培
养皿, 使淀粉平板染色。能分泌淀粉酶的种子, 其周
围淀粉被分解, 呈无色透明, 不能分泌淀粉酶的种
子, 其周围呈蓝紫色。
1.2.3 赤霉素含量测定 取三叶期的野生型与突
变体 s2-47地上部分各 0.25 g, 加 0.01 mol L−1 PBS
缓冲液 1 mL, 研磨成匀浆, 8000转 min−1离心 10 min,
1768 作 物 学 报 第 39卷


表 1 本研究所用的引物
Table 1 Primers used in this study
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5–3)
反向引物
Reverse primer (5–3)
C2-3 ATAGGGTGGGTGTGCTGAAC GCACAAAACTGCAGGTCTCC
S2-4-1 GCTCCATCGCTCAAGACAA TTTACTTTCGCGTGGTTTCC
C2-7 GAACCAGTCCGCTCTCTGAC TACGCGTCGTGTATCGTAGC
S2-10-1 CCGACCTAATTTACCGTGGTC TCCACACTGATCCCGTTATT
C2-H5 CTGGAGCAGCTTTCAAGAAG AATGATTCCATGCCTGTCCG
C2-H3 GTGAATACGCACGTACAAACG TAAACATGACCGATCACCGC
C2-H14 ATCGCCGAATTCTGTCCTAG TCCGGTTTGTATAGTTGGGG
C2-H29 GCATGTTGATGATTTGTTCATG TGGGAGTACAGCAAGGAGAA
C2-H10 CCCACTCATATTCTCTCTCTT TGCCACGTCGTGCCAAAAAA
OsCPS1 RT-PCR ACGAATTGAGGAGGCAGCATCTATG GAGCAAGTTCTTGCATACCCAACTC
Actin RT-PCR TCCATCTTGGCATCTCTCAG GGTACCCTCATCAGGCATCT
OsCPS1 S1 GCTGTATATACGTCGGTGATAG TGTTTACATAGGTAAGAGGCGG
OsCPS1 S2 GTCGAAGGATTCTGATCAACTG TGCCGTTCAGTTTTCGTCCAAT
OsCPS1 S3 CCACAACAATCTTGCATTGTGTG ACATTAACTAGCACATCTTCCTC
OsCPS1 S4 TAGCAAAAGAAATGCATGGTTG TGAGCAAAGTGTTGAGTATCGC
OsCPS1 S5 GTTCTCTCAATTGAGAGGTTCA TCAGATTCAGAAACTGAAGCCC
OsCPS1 S6 GCAGTCTGTGAGATAGACAGTT CCCAGGATATGTGATTTCATCTG
OsCPS1 S7 GCTGATCTCAGATCATGTGATG ATAGAGGCTGCTCCACATGAAA
OsCPS1 S8 GGATGCCAATTGTGAATAACGC CTCTAGTCAACAGACTATGTAAT
OsCPS1 S9 TTTGTTGTCTCAAGAGACACCG GGGTTTGTCCTAAGTCAAAGCT

收集上清液。按照植物赤霉素 ELISA检测试剂盒(北
京鑫方程生物技术有限公司)说明书测定总 GA 含
量。所用抗体为 anti-Gibberellins antibody (Bio-
compare, 货号 ABIN707516), 野生型与突变体
s2-47 各做 5次重复。用赤霉素标准品的浓度与 OD
值计算出标准曲线的直线回归方程式 , 将样品的
OD 值代入方程式, 计算出供试样品的赤霉素浓度,
再乘以稀释倍数, 即为样品的实际浓度。
1.2.4 基因初步定位 采用 CTAB 法提取水稻全
基因组 DNA[25]。所用的标记为本实验室根据籼、粳
稻序列之间插入或缺失差异设计的 170 个 InDel 标
记。采用集团分离分析法(BSA)[26]初步筛选可能连锁
的标记, 再根据 F2 极矮个体的基因型判断是否连
锁。使用的 PCR扩增体系含 10×PCR Reaction buffer
1 µL、引物(10 µmol L−1) 1 µL、模板 DNA 1 µL、dNTP
(2.5 mmol L−1) 0.1 µL、TIANGEN Taq DNA聚合酶(5
U µL−1) 0.1 µL, 补超纯水至 10 µL。PCR扩增条件
为 94℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 57℃退火 30 s,
72℃延伸 30 s, 循环数为 35, 72℃延伸 5 min。8%
聚丙烯酰胺凝胶电泳 250 V 1 h, 硝酸银染色后照相
分析。
1.2.5 基因精细定位 利用本实验室已测序的籼
稻品种 Dular 全基因组序列 (待发表 )与 NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上提供的粳稻品种日
本晴基因组序列比对, 选取在初步定位区间内插入
或缺失 10~30 bp 的多态性区域, 设计扩增产物为
200 bp左右的 InDel标记引物(表 1)。扩大基因定位
群体, 进一步缩小定位区间。
1.2.6 候选基因分析 通过美国密西根州立大学
水稻基因组注释网站 (http://rice.plantbiology.msu.
edu/), 查阅位于精细定位区间内的所有编码框
(ORF), 并分析可能的候选基因。使用高保真 DNA
聚合酶 PrimeSTAR (TaKaRa) PCR 扩增候选基因
的基因组 DNA 片段, 将 PCR 产物直接测序, 测序
引物序列见表 1。使用 DNAStar 软件比对分析测序
结果。
1.2.7 RNA 的提取及半定量检测 使用 RNA 提
取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)提取水稻
不同组织的 RNA, 反转录获得 cDNA。以 Actin基因
为内参, 调节模板 cDNA的用量, 再扩增 OsCPS1基
因, 引物序列见表 1。PCR体系含 10×Reaction buffer
1 µL, 引物(10 µmol L−1) 1 µL, 模板 cDNA (日本晴,
第 10期 李晨晨等: 水稻极矮突变体 s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究 1769


1 µL; s2-47, 1 µL), dNTP (2.5 mmol L−1) 0.1 µL,
TIANGEN Taq DNA聚合酶(5 U µL−1) 0.1 µL, 补超
纯水至 10 µL。PCR扩增条件为 94℃预变性 5 min, 94
℃变性 30 s, 57℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 循环数为
35, 72℃延伸 5 min。
2 结果与分析
2.1 田间性状调查分析
s2-47 突变体在苗期就表现出非常明显的矮化,
叶片短宽并且颜色深绿(图 1-A)。在三叶期, 突变体
的第 3 片叶长 2.5 cm 左右, 为野生型的 17.9% (图
1-D), 而叶宽是野生型的 1.6 倍(图 1-E)。在野生型
日本晴生长到抽穗期时, s2-47 表现出极端矮化(图
1-B), 株高只有 10 cm 左右, 仅为野生型的 12.5%
(图 1-F)。此外, s2-47突变体不能抽穗结实(图 1-C),
只能通过杂合体繁殖和保存种子。
2.2 s2-47突变体幼苗对赤霉素处理的响应
为了明确 s2-47 的表型是否与赤霉素的合成或
信号传导途径有关, 对幼苗进行 GA 处理。处理前,
s2-47 突变体与日本晴的株高差异明显(图 2-A)。用
10 mg L−1的外源赤霉素(GA3)处理 7 d后, 不仅日本
晴相对于未处理植株的株高明显增加(图 2-B), s2-47
突变体的株高也显著增加(图 2-C), 株高约为对照组
的 3倍(图 2-D)。虽然 GA3处理后 s2-47的株高未达
到日本晴的高度, 但其增长曲线与日本晴是平行的
(图 2-D)。该结果表明 s2-47突变体可以感受并正常
传导GA信号, 推测其矮化表型可能与GA的合成途
径缺陷有关。


图 1 s2-47突变体与野生型日本晴的表型
Fig. 1 Phenotypes of the s2-47 mutant and WT Nipponbare
A: 苗期, 左为日本晴, 右为 s2-47; B: 抽穗期, 左为日本晴, 右为 s2-47; C: 抽穗期的 s2-47突变体, 显示不能抽穗; D: 苗期第 3片叶
长; E: 苗期第 3片叶宽; F: 抽穗期株高数据(10株平均值±标准误差)。
A: Phenotype at the seedling stage. Left: Nipponbare; Right: s2-47. B: Phenotype at the heading stage. Left: Nipponbare; Right: s2-47.
C: Phenotype of the s2-47 mutant at the heading stage. D: Length of the third leaf at the seedling stage. E: Width of the third leaf at the seed-
ling stage. F: Plant height at the heading stage (mean ± SD, n=10).
1770 作 物 学 报 第 39卷



图 2 s2-47幼苗对 GA处理的响应
Fig. 2 Response of the s2-47 seedling to GA treatments
A: 处理前的日本晴(WT)和 s2-47(M); B: 日本晴经 GA3 (10 mg
L−1)处理 7 d (WT T)与未处理对照(WT CK); C: s2-47经 GA3处理
7 d (M T)与未处理(M CK)对照; D: 日本晴与 s2-47突变体幼苗
株高增长曲线。
A: Seedlings before GA treatment; B: Nipponbare treated with GA3
(10 mg L−1) for 7 d (WT T) and untreated control (WT CK); C: The
s2-47 mutant treated with GA3 for 7 d (M T) and untreated control
(M CK); D: Plant height increase kinetics of Nipponbare and the
s2-47 mutant.

2.3 s2-47 突变体籽粒 α-淀粉酶对赤霉素处理的
响应
为了进一步证明 s2-47 突变体的突变基因参与
GA 的生物合成而非信号传导途径, 做了 GA3 对水
稻籽粒糊粉层 α-淀粉酶的诱导实验。结果显示, 在
GA3 处理下, s2-47 突变体的响应与野生型相同, 均
能诱导 α-淀粉酶的表达, 降解籽粒周围的淀粉, 从
而在碘蒸汽熏蒸时不变蓝色(图 3-A), 这说明 s2-47
突变体对 GA响应不受影响。
通过上述幼苗和籽粒糊粉层对 GA 敏感度实验
推测 s2-47 突变体的矮化表型应与 GA 的合成有关,
因此进一步测定了幼苗内源总 GA 含量。结果表明,
s2-47突变体中总 GA含量显著低于野生型(P≤0.01)
(图 3-B)。
2.4 s2-47突变基因定位
2.4.1 初步定位 为了定位 s2-47 突变体的矮化
突变基因 , 首先采用集团分离分析法(BSA)对均匀
分布于水稻 12条染色体上的 170个 InDel标记初步
筛选。在第 2 染色体上共筛选出 4 个可能与 s2-47
矮化表型连锁的 InDel标记, 即 C2-3、S2-4-1、C2-7
和 S2-10-1 (表 1)。然后用这 4 个标记检测 36 株 F2
代群体中的矮化突变单株, 得到这些标记与突变基
因之间的遗传距离分别为 18.1、9.72、6.67和 28.3 cM,
突变基因被初步定位于 S2-4-1和 C2-7之间(图 4)。
2.4.2 精细定位 为精细定位该极端矮化基因 ,
将定位群体扩大到 1250株 F2代矮化单株, 使用两侧
的标记 S2-4-1和 C2-7分别检测到 120个和 83个重
组事件。根据粳稻品种日本晴和籼稻品种 Dular 基
因组序列之间的差异, 在 S2-4-1至 C2-7的区间内设
计了 5对 InDel标记, 即 C2-H5、C2-H3、C2-H14、
C2-H29和 C2-H10 (表 1), 分别检测到 28、2、3、31


图 3 α-淀粉酶诱导响应实验及幼苗总 GA含量测定
Fig. 3 GA induction of α-amylase and quantitative measurement of GA concentration in s2-47 and WT
A: α-淀粉酶诱导响应实验。GA+: 添加了 1 µmol L−1 GA3; GA−: 未添加 GA3。B: 日本晴与 s2-47突变体幼苗总 GA含量(5次重复平
均值±标准误差), ** 表示突变体 s2-47与野生型的差异极显著(P≤0.01)。
A: GA induction of α –amylase in s2-47 and WT. GA+: with GA3 (1 µmol L−1) treatment; GA−: without GA3 treatment; B: Total GA content of
the wild type and s2-47 seedlings (mean ± SD, n = 5). Asterisks indicate significant difference at P≤0.01 compared with the wild type by t-test.
第 10期 李晨晨等: 水稻极矮突变体 s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究 1771


和 62个重组事件。最终将导致 s2-47矮化的基因精
细定位在 C2-H3和 C2-H14之间, 这 2个标记分别在
BAC 克隆 AP006160 和 AP004872 上, 物理距离为
123 kb (图 4)。
2.5 s2-47精细定位区间内候选基因分析
使用 Rice Genome Annotation Project (水稻基因
组注释系统)网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)预
测该定位区间内的基因, 共得到 4 个开放读码框(图
4 和表 2)。其中 LOC_Os02g17780 编码柯巴基焦磷
酸合成酶(copalyl diphosphate synthase) OsCPS1, 是
赤霉素生物合成途径的第 1 个关键酶。鉴于此, 将
LOC_Os02g17780 (OsCPS1)确定为候选基因。
2.6 候选基因序列分析
水稻 OsCPS1 基因由 15 个外显子和 14 个内含
子组成, 基因组 DNA全长为 9.671 kb, 编码区长度
为 2.604 kb, 编码的柯巴基焦磷酸合成酶由 867个氨
基酸组成(图 5)。将 s2-47 突变体中的 OsCPS1 基因
组 DNA 进行 PCR 扩增和测序, 分成 S1 至 S9 共 9
个片段 (表 1)。测序结果显示 s2-47 突变体中的
OsCPS1基因, 从 ATG开始计数第 5922位的碱基 G
缺失, 该碱基缺失发生在第 6 个外显子上(图 5-A),
位于编码区的第 941 位, 导致从第 313 个氨基酸后
发生移码突变, 并出现提前终止密码子, 使该突变
基因编码的蛋白质缺失 554个氨基酸。
OsCPS1 蛋白 N 端 1~35 个氨基酸为叶绿体转
运肽(cTP) (图 5-B), 说明 CPS1 定位于叶绿体中,
这与 CPS 在质体内发挥作用的报道是一致的[16]。
在第 314 至 519 氨基酸, 第 562 至 821 氨基酸之间
有 Terpene_synth 和 Terpene_synth_C 两个保守的功
能结构域,在 s2-47 突变体中这 2 个功能结构域完全
缺失(图 5-B)。
2.7 OsCPS1基因的进化分析
在水稻基因组中还有 3 个 OsCPS1 的同源基因
即 OsCPS2、OsCPS3和 OsCPS4, 在氨基酸水平上与
OsCPS1 的同源性分别为 50%、55%和 54%。由于
s2-47 突变体的营养生长和生殖生长都表现严重缺
陷, 推测只有 OsCPS1 参与赤霉素合成途径, 其余 3
个基因可能具有其他功能。已有文献报道 OsCPS2


图 4 s2-47突变体基因精细定位
Fig. 4 Fine mapping of the s2-47 mutated gene

表 2 定位区间内基因功能注释
Table 2 Genes annotated in mapping region
基因座位
Locus ID
基因功能注释
Gene function annotation
位置
Location
LOC_Os02g17700 Pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase domain containing protein Chr.2: 10 207 339−10 212 956
LOC_Os02g17710 Receptor-like protein kinase 5 precursor Chr.2: 10 213 062−10 216 364
LOC_Os02g17760 Cytochrome P450 Chr.2: 10 261 986−10 268 672
LOC_Os02g17780 Copalyl diphosphate synthase Chr.2: 10 737 718−10 283 727
1772 作 物 学 报 第 39卷



图 5 OsCPS1基因及其编码蛋白的结构和 3个等位突变体的突变位点
Fig. 5 Structure of the OsCPS1 gene and encoded protein and mutation sites of three allelic mutants
A: OsCPS1的基因结构和 3个等位突变体的突变位点; B: OsCPS1的蛋白结构域和 3个等位突变体中的突变位点。
A: Structure of the OsCPS1 gene and mutation sites of three allelic mutants; B: Domains of the OsCPS1 protein and mutation sites of three
allelic mutants.

和 OsCPS4 参与从牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranyl-
geranyl diphosphate)合成植保素(phytoalexin)的途径[29]。
柯巴基焦磷酸合成酶基因 CPS在不同植物中普
遍存在。使用 MEGA4 软件 [27], 通过 Neighbor-
joining 方法[28]获得了 CPS 基因的进化树(图 6)。水
稻 OsCPS1 与玉米 An1 亲缘关系最近, 所在的进化
分支中还包括 OsCPS3和 OsCPS4。拟南芥 GA1、豌
豆 LS 与其他几个双子叶植物的 CPS 基因聚在另一
个进化分支上, 而水稻 OsCPS2 则单独在一个进化
分支上。


图 6 OsCPS1及其同源基因的进化关系
Fig. 6 Phylogenetic relationships between OsCPS1 and homologous genes
OsCPS2、OsCPS3、OsCPS4、LeCPS、ZmCPS/AN1、AtCPS/GA1、CmCPS1、CmCPS2、SdCPS、LsCPS、PsCPS/LS和 SrCPS分别为
水稻、番茄、玉米、拟南芥、笋瓜、野甘草、莴苣、豌豆、甜叶菊中 OsCPS1的同源基因。序列号分别为 AP005114、AP005767、AL662933、
AB015675、L37750、U11034、AF049905、AF049906、AB046689、AB031204、U63652和 AF034545。
OsCPS2, OsCPS3, OsCPS4, LeCPS, ZmCPS/AN1, AtCPS/GA1, CmCPS1, CmCPS2, SdCPS, LsCPS, PsCPS/LS, and SrCPS are homologous
genes of OsCPS1 from Oryza sativa, Lycopersicon esculentum, Zea mays, Arabidopsis thaliana, Cucurbita maxima, Scoparia dulcis, Lactuca
sativa, and Pisum sativum, Stevia rebaudiana. Accession numbers are AP005114, AP005767, AL662933, AB015675, L37750, U11034,
AF049905, AF049906, AB046689, AB031204, U63652, and AF034545, respectively.
第 10期 李晨晨等: 水稻极矮突变体 s2-47对赤霉素的响应及基因定位研究 1773


2.8 OsCPS1 基因的组织表达模式及对 GA 的
响应
采用半定量RT-PCR检测了OsCPS1基因在水稻
根、节间、节、叶片、叶鞘、幼穗、成熟穗等器官
中的表达情况。OsCPS1在根中的表达量极低, 但在
地上部分各个器官都有表达, 尤其在节和幼穗中的
表达量较高(图 7-A)。这与赤霉素主要在植物生长旺
盛的部位合成一致。
经过外源 GA3 (浓度为 1×10−4 mol L−1)处理的野
生型中 OsCPS1 的表达量降低(图 7-B), 而在 s2-47
突变体中 OsCPS1 的表达却升高 (图 7-C)。说明
OsCPS1的表达受体内 GA含量的反馈调节。


图 7 半定量 RT-PCR检测 OsCPS1基因表达模式
Fig. 7 Semi-quantitative RT-PCR analysis of the expression pattern of OsCPS1
A: OsCPS1在各器官中的表达模式。1: 根; 2: 节间; 3: 叶片; 4: 叶鞘; 5: 幼穗; 6: 节; 7: 成熟穗。B: 经过外源 GA3 (1×10-4 mol L−1)
处理 10 d的 OsCPS1的表达。C: OsCPS1在野生型与突变体 s2-47中的表达。
A: expression pattern of OsCPS1 in various organs (1: roots; 2: stems; 3: leaf blades; 4: leaf sheaths; 5: immature panicles; 6: node; 7: panicles at
flowering time); B: expression of OsCPS1 after GA (1×10−4 mol L−1, 10 d) treatment; C: expression of OsCPS1 in wild type and mutant.

3 讨论
赤霉素对植物生长发育具有十分重要的调节作
用。根据矮化植株对赤霉素响应的不同, 可将其划
分为赤霉素缺陷型和赤霉素钝感型。本研究中 ,
s2-47突变体幼苗的 GA处理和 α-淀粉酶的诱导实验
均表明该突变体为赤霉素缺陷型, 即 s2-47 自身不
能合成有生物活性的 GA 或合成量极低, 但其信号
传导途径正常, 在添加外源活性 GA3 的情况下, 株
高显著增加。
目前已经鉴定了 2个OsCPS1的等位突变体, 即
oscps1-1和 oscps1-2, 表现严重矮化、不开花、不结
实, 在突变体内未检测到内根-贝壳杉烯和有生物活
性的 GA1 [22]。本研究报道的 s2-47株高仅为野生型
的 12.5%, 不能抽穗结实, 这与 oscps1-1和 oscps1-2
的表型相似。突变体 oscps1-1 和 oscps1-2 的突变位
点都位于 OsCPS1 基因的第 7 个外显子上, 其中
oscps1-1 有 1 个 Tos17 转座子插入, oscps1-2 缺失 9
个碱基, 而 s2-47 在第 6 外显子上缺失 1 个碱基(图
5-A)。如图 5-B所示, OsCPS1蛋白有 Terpene_synth
和 Terpene_synth_C两个功能结构域, 它们与萜烯合
成酶活性有关。在这 3 个等位突变体中, 这 2 个功
能结构域均完全缺失, 使其编码的萜烯合成酶完全
失去催化活性, 不能合成具有生物活性的 GA, 因此
表现严重矮化及不抽穗结实的表型。
目前已报道了一些水稻赤霉素合成途径的突变
体, 但表型没有像 s2-47这样严重。本实验室曾报道
2 个水稻 D18 基因功能完全缺失突变体 s1-146a 和
s2-9, 其株高大约 20 cm, 比 s2-47高, 而且能够正常
抽穗结实[11]。用于水稻矮化育种的矮秆资源 sd1 是
绿色革命基因 SD1 的功能完全缺失突变体, 其株高
为野生型的 60%~70%, 育性和结实正常[9]。这种表
型的差异可能与这 3 个基因在赤霉素合成途径中的
位置有关。D18基因编码的 OsGA3ox2和 SD1基因
编码的 OsGA20ox2位于赤霉素合成途径的下游, 而
CPS 编码的柯巴基焦磷酸合酶位于赤霉素合成的起
始位置[22], 推测位于赤霉素合成途径上游的基因突
变后引起的表型更矮化。
1774 作 物 学 报 第 39卷


已有愈来愈多的实验证据表明 GA 生物合成受
到具有生物活性 GAs水平的负反馈调节。本研究中,
用外源 GA3处理野生型植株, OsCPS1基因的表达量
降低了; 而在突变体 s2-47 中, OsCPS1 的突变导致
GA 合成量降低 , 受到低含量 GA 的反馈调节 ,
OsCPS1的表达量又升高了。这些数据进一步证实了
内源 GA含量对 GA生物合成的反馈调节。
4 结论
通过 EMS 诱变日本晴获得 1 个矮秆突变体
s2-47, 其表型为极端矮化、叶色深绿、不能抽穗结
实、且对赤霉素敏感。s2-47是 OsCPS1基因 1个新
的等位突变体。OsCPS1基因编码的柯巴基焦磷酸合
酶是赤霉素生物合成途径中的第一个关键酶, 其表
达受到体内 GA 含量的反馈调节。该结果为深入了
解该基因的功能提供了新的遗传资源材料。
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