全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 706713 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由引进国际先进农业科学技术计划 (948计划 )项目 [2011-G(3)4]和科技部小麦玉米高效分子标记体系的研发和应用项目
(2013DFG30530)资助。
This study was supported by the Program of Introducing International Super Agricultural Science and Technology [2011-G(3)4] and Ministry
of Science and Technology (2013DFG30530).
* 通讯作者(Corresponding author): 何中虎, E-mail: zhhecaas@163.com
第一作者联系方式: E-mail: lwshuang2012@163.com
Received(收稿日期): 2015-09-07; Accepted(接受日期): 2016-03-02; Published online(网络出版日期): 2016-03-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160311.1605.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00706
普通小麦类胡萝卜素组分的超高效液相色谱分离方法
李文爽 1 夏先春 1 何中虎 1,2,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 国家小麦改良中心, 北京 100081; 2CIMMYT中国办事处, 北京 100081
摘 要: 类胡萝卜素是影响小麦面粉及面制品颜色和营养品质的重要因素。本研究以中麦 175 (软质麦)和中优 206
(硬质麦 )的面粉为试验材料 , 旨在优化小麦类胡萝卜素提取方法 , 建立超高效液相色谱 (ultra performance liquid
chromatography, UPLC)测定其组分的技术体系。研究表明, 用含 0.1% BHT的正己烷∶丙酮(80∶20, v/v)混合液作为
提取液, 结合恒温振荡法(300转 min–1, 35℃, 振荡 1 h)的提取效果最好。以 YMC C30胡萝卜素分析专用色谱柱(高
100 mm, 直径 4.6 mm, 粒径 3 µm)洗脱, 乙腈∶甲醇∶水∶三乙胺(81∶14∶5∶0.05, v/v/v/v)为流动相 A, 甲醇∶乙
酸乙酯∶三乙胺(68∶32∶0.05, v/v/v)为流动相 B, 流速 0.4 mL min–1, 柱温 35℃, 分离时间 25 min; 以二极管阵列检
测器(photodiode array, PDA)在 450 nm波长下, 能有效检测叶黄素、玉米黄质和 β-胡萝卜素 3种组分。该技术体系可
作为普通小麦类胡萝卜素组分及营养品质研究的有效方法。
关键词: 普通小麦; 类胡萝卜素组分; 超高效液相色谱
Establishment of Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) Protocol
for Analyzing Carotenoids in Common Wheat
LI Wen-Shuang1, XIA Xian-Chun1, and HE Zhong-Hu1,2,*
1Institute of Crop Science / National Wheat Improvement Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Beijing 100081, China;
2CIMMYT-China Office, c/o CAAS, Beijing 100081, China
Abstract: Carotenoids is an important criterion in the assessment of color and nutritional qualities of end-use products in common
wheat. In this study, grain powders of Zhongmai 175 (soft wheat) and Zhongyou 206 (hard wheat) were used as samples to de-
velop an optimal procedure for extraction and separation of carotenoids compositions extracted from flours using ultra perform-
ance liquid chromatography (UPLC). The most effective extraction of carotenoids extraction was obtained using the solvent sys-
tem of N-hexane; acetone of 80:20 (v/v, 0.1% BHT w/v) under the oscillation condition of 300 r min–1, 35ºC, and 1 h. The separa-
tion was conducted using YMC C30 Carotenoid column (100.0 mm × 4.6 mm, 3 µm) with photodiode array (PDA) detector, and
the column was thermostated at 35°C. Under a gradient system consisting of acetonitrile:methanol:water:triethylamine
(81:14:5:0.05, v/v/v/v) (A) and methanol: ethylacetate:triethylamine (68:32:0.05, v/v/v) (B) at a constant flow rate of 0.4 mL
min–1, the carotenoids of common wheat flour samples can be well separated in less than 25 min. Carotenoids were detected at
450 nm. All the present results provided useful information for carotenoids compositions and quality improvement.
Keywords: Triticum aestivum L.; Carotenodis compositions; UPLC
类胡萝卜素是呈红色、黄色和橙色的一类碳氢
化合物及其氧化衍生物, 属脂溶性色素, 其结构由 8
个类异戊二烯单位通过首尾连接而成, 包括 700 多
个家族成员。类胡萝卜素在人类营养和健康方面有
重要作用, 一些类胡萝卜素是维生素 A 的前体物
质。维生素 A 又称视黄醇, 是脂溶性维生素, 其动
第 5期 李文爽等: 普通小麦类胡萝卜素组分的超高效液相色谱分离方法 707


物性来源的称维生素 A, 而植物性来源的称维生素
A 原, 即类胡萝卜素, 人体摄入后可以转化成有生
理活性的维生素 A。维生素 A有很多重要生理功能,
能维持正常视觉功能, 预防老年性黄斑变性和夜盲
症的发生, 维持骨骼正常生长发育以及抑制肿瘤生
长。维生素 A 缺乏症在第三世界国家非常严重, 导
致死亡率上升[1]。同时, 所有类胡萝卜素都具有抗氧
化能力, 可以降低慢性病发生, 增强免疫[2-3]。人类和
动物自身不能合成类胡萝卜素, 必须从外界摄取[4-5]。
近年来, 谷物籽粒中的类胡萝卜素组分及其含量研
究受到越来越多的关注 [6], 已克隆了一些与类胡萝
卜素生物合成相关的基因 [7-10], 并定位了与类胡萝
卜素含量相关的 QTL [11-12]。大部分研究集中在类胡
萝卜素含量较高的玉米, 主要做法是通过遗传育种
方法提高类胡萝卜素的含量或改变籽粒中不同类胡
萝卜素组分的比例。通过转入与胡萝卜素合成相关
的基因, 已获得外表为金黄色的转基因大米, 被称为
“黄金大米”, 可帮助人体增加维生素 A的吸收[13-15]。
普通小麦是世界性的重要谷物, 约占全球作物
种植面积的 17%, 为人类提供了约 20%的能量和蛋
白 [16]。我国是全球小麦生产和消费量最大的国家 ,
常年种植面积约为 2400 万公顷, 总产量约为 1.2 亿
吨[17]。随着经济发展、生活质量提高, 面粉及面制
品的营养和外观品质越来越受到重视, 并已成为小
麦品质改良的重要方向[18-19]。黄色素是小麦籽粒中
最主要的天然色素, 其含量高低是评价面粉色泽的
重要指标, 与面粉及面团黄度的相关系数高达 0.8~
0.9 [20]。类胡萝卜素是黄色素的主要成分, 影响面粉
颜色和营养品质。虽已对黄色素含量进行 QTL定位,
并发掘验证了相关功能标记[21-22], 但国内有关小麦
类胡萝卜素组分及其含量的研究尚未见报道。
测定植物类胡萝卜素的常用方法有分光光度法
和高效液相色谱法(high performance liquid chroma-
tography, HPLC), 其中, 分光光度法易操作且对类
胡萝卜素提取纯度要求不高, 但该方法只能测定类
胡萝卜素总量, 不能检测各组分的含量; 高效液相
色谱法可用于多种类胡萝卜素组分的分离, 但分离
非极性的类胡萝卜素(如 β-胡萝卜素)时, 分析时间
过长, 并且尚未建立测定普通小麦类胡萝卜素的通
用方法[23-24]。随着色谱学的发展, 超高效液相色谱
法(ultra performance liquid chromatography, UPLC)
应运而生, UPLC是在 HPLC理论与原理的基础上形
成的, UPLC 所配套的分析柱, 使用的填料更小, 整
个 UPLC 系统体积降低, 从而提高了色谱峰容量、
灵敏度及分析通量。Hung等[25]利用 UPLC检测了硬
粒小麦类胡萝卜素组分, 但仅获得了叶黄素和 β-胡
萝卜素含量, 没有检测到玉米黄质含量, 而有关普通
小麦类胡萝卜素组分含量的 UPLC分析尚未见报道。
针对上述问题, 本研究旨在建立灵敏、快速的
普通小麦类胡萝卜素组分定量分析的 UPLC 方法,
为类胡萝卜素的遗传改良及相关研究提供表型测定
方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料及磨粉方法
中麦 175 (软质麦)和中优 206 (硬质麦)用于体系
建立, 2011—2012年度种植于北京。20份冬小麦品
种用于 UPLC 与 HPLC 方法比较, 其中北部冬麦区
品种 6个, 包括晋麦 61、晋麦 67、京冬 8号、CA9719、
CA9722 和京 9428; 黄淮麦区品种 12 个, 包括晋麦
45、烟农 18、烟优 361、鲁麦 23、高优 503、豫麦
50、85中 33、兰考 24、豫麦 49、豫麦 63、皖麦 19
和皖麦 38; 长江中下游麦区品种 2 个, 包括徐州 25
和扬麦 158。这 20份品种于 2011—2012年度分别种
植于北京、河南安阳和安徽濉溪, 没有发生穗发芽,
收获后将籽粒自然晒干, 低温贮藏。
用 Perten Instruments North America公司(Reno,
NV, Sweden)生产的 4100 型单籽粒谷物特性测试仪
(Single Kernel Characterization System, SKCS)测定
籽粒硬度和水分含量。用 Brabender Quandrmat
Junior (Brabender Inc., Duisberg, Germany)磨 , 按
AACC 26-50 (1995)方法润麦和制粉。为避免色素被
一些酶类氧化, 将面粉储存于 18℃暗光环境。
1.2 类胡萝卜素组分及混合样品制备
谷物中类胡萝卜素主要有玉米黄质、叶黄素、α-
胡萝卜素和 β-胡萝卜素[26]。叶黄素(纯度≥90%)、玉
米黄质(纯度≥95%)和 β-胡萝卜素(纯度≥95%)标样
购自 Sigma 公司, α-胡萝卜素(纯度≥97%)标样购自
CaroteNature公司。
叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和 β-胡萝卜素
的固体标准样品先用四氢呋喃彻底溶解, 再用甲醇
稀释获得 0.1 mg mL–1叶黄素、0.1 mg mL–1玉米黄
质、0.1 mg mL–1 α-胡萝卜素和 0.05 mg mL–1 β-胡萝
卜素标准溶液, 叶黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素和 β-
胡萝卜素按体积比为 8∶2∶4∶6 配置成混合标准
样品。利用 HPLC 和 UPLC 对 4 种单组分标样和混
708 作 物 学 报 第 42卷


合标样进行分析, 根据单组分标准样品的保留时间,
确定混合标样中各组分。将配好的混合标准样品用
甲醇稀释为原浓度的 1/2、1/4、1/8、1/10, 制作标准
曲线, 峰面积为纵坐标, 样品浓度为横坐标。
1.3 试验样品提取方法
从提取类胡萝卜素的常用溶剂中选取 5 种混合
溶剂, 其成分组成和比例(v/v)分别是正己烷∶丙酮
(80∶20)、丙酮∶甲醇(70∶30)、丙酮∶石油醚(50∶
50)、甲醇∶四氢呋喃 (50∶50)和甲醇∶二氯甲烷
(45∶55)。混合溶剂中加入 0.1%的抗氧化剂――丁
羟甲苯(butylated hydroxytoluene, BHT)。
用超声波法提取时, 先准确称取 8.0 g面粉, 置
于三角瓶中, 加入 40 mL 样品提取液, 漩涡振荡 2
min, 然后放入KQ-500DB数控超声清洗器中, 在 20
℃、100 Hz条件下超声提取 1 h。然后, 将上清液转
移到 50 mL塑料离心管中, 23 500 × g离心 15 min;
上清液过 0.45 μm的油性滤膜后转入液相小瓶中。
用恒温振荡法提取时, 先称取 8.00 g小麦面粉,
加入 40 mL 样品提取液, 漩涡振荡 2 min, 再于 35
℃恒温振荡器中 300转 min–1振荡 1 h; 然后将上清
液转移到 50 mL塑料离心管中, 23 500 × g条件下离
心 15 min; 将上清液转移到 100 mL 烧杯中 , 用
TTL-DCII 型氮吹仪(北京同泰联公司)将溶剂吹干,
所得残渣即为类胡萝卜素。再用 1.5 mL含 0.1% BHT
的甲醇∶乙酸乙酯(68∶32, v/v)溶解, 置于 2 mL棕
色离心管中 , 在分析使用之前置于20℃条件下保
存, 经 4℃条件下 15 000 × g离心 20 min后, 取上清
液过 0.22 μm 油性滤膜至进样小瓶中, 进样量为 8
μL。所有提取样品需在 24 h内完成分析。
1.4 洗脱条件及类胡萝卜素组分含量计算
1.4.1 HPLC 法 流动相 A 为乙腈∶甲醇∶三乙
胺(85∶15∶0.05, v/v/v), 流动相 B为甲醇∶乙酸乙
酯∶三乙胺(68∶32∶0.05, v/v/v), 配制的流动相应
以 0.45 μm 油性滤膜过滤, 流动相使用前超声脱气
20 min。洗脱梯度为 0 min时 100%流动相 A, 5 min
时 100%流动相 A, 45 min时 0%流动相 A, 55 min时
100%流动相 A。胡萝卜素分析专用色谱柱 YMC C30
(4.6 mm × 250.0 mm, 粒径 5 μm), 流速为 1.0 mL
min–1, 检测波长 450 nm。HPLC色谱系统为 Waters
2695, 利用工作站软件 Millennium 32, 根据标准样
品的保留时间判断样品中类胡萝卜素的组分。
1.4.2 UPLC 法 流动相 A 为乙腈∶甲醇∶水∶
三乙胺=81∶14∶5∶0.05 (v/v/v/v), 流动相 B 为甲
醇∶乙酸乙酯∶三乙胺 = 68∶32∶0.05 (v/v/v), 配
制的流动相应以 0.22 μm 油性滤膜过滤, 流动相在
使用前超声脱气 20 min。洗脱梯度为 0 min时 100%
流动相 A, 0.3 min时 100%流动相 A, 12 min时 0%流
动相 A, 20 min时 0%流动相 A, 22 min时 100%流动
相 A, 25 min时 100%流动相 A。YMC C30胡萝卜素
分析专用色谱柱(高 100 mm, 直径 4.6 mm, 粒径 3
μm), 流速为 0.4 mL min1, PDA检测波长 450 nm。
UPLC色谱系统为 Waters Acquity系统, 利用工作站
软件 Empower Pro (version 2.0), 根据标准样品的保
留时间判断样品中类胡萝卜素的组分, 并采用不同
浓度的混合标准样品与对应的峰面积值间的关系制
作标准曲线(R2 > 0.9990), 采用自动积分获取样品的
峰面积, 再根据标准曲线计算样品相关组分含量。
1.5 统计分析
用 Statistical Analysis System (SAS9.1)进行基本
统计量分析和差异显著性比较。
2 结果与分析
2.1 提取液选择
选择 5种类胡萝卜素提取溶液 (均含 0.1%的
BHT), 分别提取中麦175和中优206面粉样本的类胡
萝卜素, 用叶黄素含量来判断提取效果。结果表明,
正己烷∶丙酮(80∶20, v/v)的提取效果最好, 而另4
种提取方法没有显著差异。因此, 本试验选用正己
烷∶丙酮(80∶20, v/v)作为小麦类胡萝卜素的提取
溶剂(表1)。
2.2 提取方法选择
比较超声和恒温振荡两种常用方法的提取效果,
可以看出 , 两种对中麦175面粉中叶黄素提取量的
影响差异不显著 , 而对中优206面粉叶黄素提取量
有显著影响(P<0.05); 从提取量看, 恒温振荡法在2
个品种提取到的叶黄素含量均高于超声法。同时 ,
恒温振荡法对温度控制较稳定, 而超声法中水温会
逐渐升高, 降低了样品间提取条件的重复性。因此,
本文最终选用恒温振荡法作为小麦类胡萝卜素的提
取方法(表2)。
2.3 保留时间确定
根据类胡萝卜素 4种组分(叶黄素、玉米黄质、
α-胡萝卜素和 β-胡萝卜素)单个标准样品的保留时间
确定混合标准样品的保留时间, 如图 1 所示, 各组
分的保留时间可明显区分, 其中叶黄素的保留时间
为 12.173 min, 玉米黄质为 13.203 min, α-胡萝卜素
第 5期 李文爽等: 普通小麦类胡萝卜素组分的超高效液相色谱分离方法 709


表 1 不同提取液提取小麦样品叶黄素含量比较
Table 1 Lutein contents in samples using different solvents
溶剂成分
Solvent component
比例
Ratio (v/v)
中麦 175
Zhongma 175
中优 206
Zhongyou 206
正己烷∶丙酮 n-Hexane:acetone 80:20 61.6±1.5 a 75.3±1.9 a
丙酮∶甲醇 Acetone:methanol 70:30 60.2±2.2 a 76.7±1.9 a
丙酮∶石油醚 Acetone:petroleum ether 50:50 57.8±3.3 a 71.2±4.1 a
甲醇∶四氢呋喃 Methanol:tetrahydrofuran 50:50 56.8±1.2 a 70.9±4.1 a
甲醇∶二氯甲烷 Methanol:dichloromethane 45:55 32.5±2.1 b 40.6±8.3 b
数据 2次重复的平均值±标准差, 以 100 g面粉中叶黄素的质量(g)为单位。标准差后不同小写字母表示不同提取液间有显著差
异(P < 0.05)。
Data (g in 100 g flour) are the means ± SD of two replicates. Different letters after SD indicate significant difference among solvents
(P < 0.05).

表 2 不同提取方法提取小麦样品叶黄素含量比较
Table 2 Lutein contents in samples using different methods
方法
Method
参数
Parameter
中麦 175
Zhongmai 175
中优 206
Zhongyou 206
超声法 Sonication 100 Hz, 1 h, 20℃ 48.6±0.6 a 70.0±0.9 b
恒温振荡法 Oscillation 300 r min–1, 1 h, 35℃ 55.4±4.2 a 77.2±1.6 a
数据 2次重复的平均值±标准差, 以 100 g面粉中叶黄素的质量(g)为单位。标准差后不同小写字母表示两种方法之间有显著差
异(P < 0.05)。
Data (g in 100 g flour) are the means ± SD of two replicates. Different letters followed SD indicate significant difference between
methods (P < 0.05).

图 1 样品中叶黄素(a)、玉米黄质(b)、α-胡萝卜素(c)和 β-胡萝卜素(d)的 UPLC峰形图
Fig. 1 UPLC chromatograms of lutein (a), zeaxanthin (b), α-carotene (c), and β-carotene (d)
A: 标准样品; B: 小麦样品。A: mixed standard; B: bread wheat.

为 18.472 min, β-胡萝卜素为 20.836 min。在检测 4
种组分时, 没有检测到 α-胡萝卜素, 玉米黄质和 β-
胡萝卜素分离出的峰形小且响应值较低。
2.4 UPLC分析方法重复性验证
对制作标准曲线的 5 种不同浓度的标准样品连
续进样进行测定, 检测到的峰形从左到右依次为叶
黄素、玉米黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素(图 2)。
可以看出, 类胡萝卜素的 4 种组分在 UPLC 洗脱梯
度下保留时间重复性相对稳定。加样回收率, 叶黄
素为 92.3%, 玉米黄质为 94.8%, β-胡萝卜素为
51.0%, 3种组分总量为 85.9%。为了便于观察提取及
分离量化的稳定性, 在多样品分析中需增加对照样
品, 每 20个样品增加一个对照。根据对照样品中测
定的类胡萝卜素各组分峰形图的保留时间及含量的
分析, 判断系统的稳定性及检测的准确性, 从而保
证所有样品测定结果的一致性。
2.5 UPLC与 HPLC法比较
选取晋麦 61等 20份小麦品种, 分别利用 UPLC
710 作 物 学 报 第 42卷


体系与 HPLC 体系测定其面粉叶黄素含量, 两种方
法的决定系数为0.96 (图3), 说明本研究建立的
UPLC方法用于小麦类胡萝卜素组分含量测定可行。
HPLC 体系对玉米黄质和 β-胡萝卜素无法进行定量
分析, 而 UPLC 体系则可以将这两种组分分离并定
量。因此, UPLC方法具有分析通量高、检测灵敏度
高的特点, 与 HPLC 相比, 还提高了叶黄素与玉米
黄质的分离度。
3 讨论
3.1 类胡萝卜素提取方法优化
普通小麦类胡萝卜素各组分定量研究尚无统一
提取方法 , 以水饱和正丁醇提取法较为常用 [28-29],
但所使用的有机溶剂——水饱和正丁醇与 UPLC 体
系中使用的流动相不兼容, 且该溶剂黏度大, 氮气
吹干过程时间很长, 因此, 本研究建立了能够适应
UPLC 检测体系并能大批量提取小麦类胡萝卜素的
方法。Burkhardt和 Böhm [30]曾使用甲醇和四氢呋喃
混合液提取硬粒小麦类胡萝卜素, 但我们发现该方
法的提取效果不及丙酮与甲醇混合液和正己烷与丙
酮混合液。Oliver 等[31]还使用过皂化方法进行提取
类胡萝卜素, 但提取时间长, 且可能破坏类胡萝卜
素的结构。Hung 和 Hatcher[25]用水饱和正丁醇作为
提取溶剂 , 需在黑暗环境下过夜提取 ; 与之相比 ,

图 2 连续 5次进标准样品峰形图
Fig. 2 Consecutive UPLC separations of carotenoids standards in calibration curves with optimized conditions
A: 堆栈图; B:叠加图。
A: consecutive runs of five carotenoids standards; B: overlapping of five carotenoids standards in consecutive runs.
第 5期 李文爽等: 普通小麦类胡萝卜素组分的超高效液相色谱分离方法 711



图 3 UPLC体系与 HPLC体系提取类胡萝卜素相关性分析
Fig. 3 Correlation between lutein contents in wheat flour
extracts from UPLC and HPLC systems

本研究的提取过程更短、效率较高、重复性好, 两
次提取相关性为 0.99, 因此认为, 该方法可用于提
取普通小麦类胡萝卜素。
3.2 UPLC体系建立
利用 HPLC 体系测定小麦籽粒中类胡萝卜素含
量, 单个样品所用时间约为 60 min [30, 32-34], UPLC体
系测定类胡萝卜素的分离度、测定速度和灵敏度更
高, 本文中的 UPLC测定体系检测时间仅为 25 min。
HPLC体系进样量为 50 μL, 而 UPLC仅为 8 μL, 用
量减少约 80%。同时 HPLC 法每针进样所需流动相
总用量约为 60 mL, 而 UPLC法仅需约 10 mL, 约为
HPLC 法的 1/6。通过计算加样回收率, 该体系对叶
黄素和玉米黄质的回收率较高, 达到 90%以上, 但
对于 β-胡萝卜素回收率相对较低, 这是由于 β-胡萝
卜素极不稳定, 在样品处理和分离过程中都会有一
定损失。
色谱柱是液相色谱分离分析的关键硬件[35], 本
研究选用YMC C30胡萝卜素分析专用色谱柱, 与传
统的 C18 色谱柱比, 它提供了足够的相位厚度, 可
增强与长链分子之间的相互作用, 利于分离双键键
合系统的异构体。叶黄素与玉米黄质为同分异构体,
区别仅在一个双键位置的不同, 因此使用 YMC C30
胡萝卜素分析色谱柱能将两者很好分离。
本研究中, UPLC法使用是高 100 mm、直径 4.6
mm、粒径 3 μm的色谱柱, 一般认为粒径低于 2 μm
的小颗粒作为固定相, 可以增加色谱柱的效能, 提
高分离度。但小颗粒不仅要求系统能承受高于目前
极限压力(6000 psi/400 bar), 更小的死体积, 并且能
适应只有几秒峰宽的高速检测器。目前尚无用于检
测类胡萝卜素的固定相粒径更小的色谱柱, 我们曾
使用现有的小颗粒填充的 UPLC 色谱柱(ACQUITY
UPLC BEH C18 2.1 mm × 100.0 mm, 粒径 1.7 μm),
但并不能很好分离叶黄素和玉米黄质两种组分, 且
β-胡萝卜素出峰时间比较靠后, 所以最终选用了粒
径为 3 μm的 YMC C30胡萝卜素专用分析色谱柱。
在本试验中, 实际小麦样品 β-胡萝卜素保留时间较
之标准样品有些提前, 不过在误差范围内, 这是由
于有机溶剂直接提取得到的类胡萝卜素中会有杂质
影响。随着技术的发展以及 UPLC 使用的普及, 若
未来能设计一款专门测定类胡萝卜素的固定相粒径
小于 2 μm的色谱柱, 可更有效分析研究植物中类胡
萝卜素。
流动相可影响相关组分的分离效果, UPLC体系
的流动相与 HPLC 体系流动相组分相同, 只是在流
动相 A 中加入 5%纯水, 目的是在超高压的环境下,
减少流动相的黏度。Hung和 Hatcher [25]利用 UPLC
方法测定硬粒小麦类胡萝卜素, 洗脱时间为 6 min,
但只检测到叶黄素与 β-胡萝卜素, 且根据Kean等[36]
的研究推测色谱图中的玉米黄质色谱峰, 并没有利
用标准样品或是质谱检测到玉米黄质。本研究可以
将 4种组分分离, 但多次进样之后, β-胡萝卜素的保
留时间会延后, 这是由于类胡萝卜素的提取过程相
对简单, 而 UPLC 对样品的前处理要求较高, 会因
一些杂质残留而使出峰时间延后。经过多次试验 ,
最终选定 25 min的洗脱时间, 保证在最短的时间内
更稳定地测定类胡萝卜素组分。
4 结论
以类胡萝卜素组分的 HPLC 测定方法为基础,
通过技术条件改进和参数优化, 建立了 UPLC 测定
技术体系。该体系以含有 0.1% BHT的正己烷:丙酮
(80∶20, v/v)混合溶液作为提取液 , 利用恒温振荡
法(300转 min–1, 35℃, 振荡 1 h)提取面粉中的类胡
萝卜素, 采用胡萝卜素分析专用色谱柱 YMC C30
(4.6 mm  100.0 mm, 粒径 3 µm); 流动相 A为乙
腈∶甲醇∶水∶三乙胺(81∶14∶5∶0.05, v/v/v/v);
流动相 B为甲醇∶乙酸乙酯∶三乙胺(68∶32∶0.05,
v/v/v), PDA检测波长 450 nm, 流速 0.4 mL min–1。
流动相洗脱梯度为 0 min时 100%流动相 A, 0.3 min
时 100%流动相 A, 12 min时 0%流动相 A, 20 min时
0%流动相 A, 22 min 时 100%流动相 A, 25 min 时
100%流动相 A。

致谢: 江苏省农业科学院农业生物技术研究所张平
平副研究员对本文提出了宝贵修改建议。
712 作 物 学 报 第 42卷

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