全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(7): 1190−1196 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由吉林省重点科技攻关项目(20140204008NY)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 马建, E-mail: majian19790106@163.com; 刘文国, E-mail: liuwenguo168@163.com
第一作者联系方式: E-mail: wangypbio@163.com
Received(收稿日期): 2014-01-26; Accepted(接受日期): 2014-04-16; Published online(网络出版日期): 2014-05-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140516.1004.029.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01190
土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究
王云鹏 1,2 马景勇 1 马 瑞 2 马 建 1,* 刘文国 1,2,*
1吉林农业大学农学院, 吉林长春 130118; 2吉林省农业科学院, 吉林长春 130033
摘 要: EPSPS (5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶, EC 2.5.1.19)是植物芳香族氨基酸和植物次生代谢产物生物合成中莽
草酸途径的关键酶; 同时也是广谱性除草剂草甘膦的作用目标。本实验通过对草甘膦污染土壤宏基因组文库的建立
及筛选, 成功克隆了一个新的草甘膦抗性的 EPSPS基因(命名为 soilEPSPS)。序列分析表明, soilEPSPS基因全长 1404 bp,
其编码的 467 个氨基酸中未涉及已公布专利中保护的氨基酸序列。原核功能验证表明, 该基因对草甘膦的耐受能力
优于 EPSPS CP4基因。将该基因与水稻 Rubisco SSU引导肽相融合构建由 actin启动子驱动的植物表达载体, 用农杆
菌介导法实现了水稻的遗传转化。抗性再生植株的 PCR 和 Southern 杂交结果表明所获得的 26 株再生植株均为转基
因阳性植株, 其中共有 3个单拷贝转化事件。草甘膦抗性鉴定证明纯合体 T2代植株能够耐受高达 500 mmol L–1的草
甘膦。本研究为转基因抗除草剂水稻新品种的培育奠定了基础。
关键词: 宏基因组; 水稻; 农杆菌; 遗传转化
Cloning of New Herbicide Resistant Gene in Soil Metagenomics and Genera-
tion of Transgenic Rice Plants
WANG Yun-Peng1,2, MA Jing-Yong1, MA Rui2, MA Jian 1,*, and LIU Wen-Guo1,2,*
1Faculty of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China
Abstract: The EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EC 2.5.1.19) is considered as one of the crucial enzymes in
the shikimate pathway for the biosynthesis of essential aromatic amino acids and secondary metabolites in plant. It is also proved
as a specific target of broad spectrum herbicide glyphosate. In this research, a new glyphosate resistant EPSPS gene named
soilEPSPS was isolated by screening the metagenomic library. The sequence analysis suggested that soilEPSPS consists of 1404 bp
and encodes a polypeptide of 467 amino acids that are not involved in the amino acid sequence protected by the published patent-
sions. The result of prokaryotic expression confirmed that soilEPSPS had a better ability of glyphosate resistance than EPSPS CP4
gene. Fusing the gene and the Rubisco SSU signal peptide constructed the plant expressing vector with the actin promoter driven,
and transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. PCR and Southern analyses showed that a total of 26 trans-
genic plants were obtained and three of them were single copy insertion events. Resistant experiment showed that the homozy-
gous T2 plants in these events could tolerate the spray of 500 mmol L–1 glyphosate solution. This study laid a foundation for
breeding transgenic herbicide resistant rice varieties.
Keywords: Metagenomics; Rice; Agrobacterium tumefaciens; Genetic transformation
提高农作物对除草剂耐受性的研究历来是通过
遗传工程改良农作物的重要研究内容[1]。通过田间
喷洒除草剂及提高农作物对除草剂的耐受限度能够
十分有效地提高大规模农场化的田间除草。目前使
用的除草剂按其作用性质分为灭生性除草剂和选择
性除草剂, 而按其在植物体内的转移方式又可分为
触杀型、内吸传导型、内吸传导触杀综合型。草甘
膦[N-(磷酞基甲基)甘氨酸, glyphosate], 是孟山都公
司开发的一种内吸传导型广谱灭生性除草剂 [2], 自
20世纪70年代开始使用至今已成为世界上使用面积
最广的除草剂[3-5]。
占自然界微生物中90%以上的微生物无法人工
第 7期 王云鹏等: 土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究 1191


培养[6-7], 而宏基因组学[8]以某一环境中的微生物群
体为研究对象, 不依赖基因序列信息, 筛选到的基
因与数据库中已知的基因往往具有较低同源度; 同
时由于一般采用极端环境来源的宏基因组DNA构建
文库和具有极强的目的性进行筛选的条件, 因此所
获得基因的性状较其他手段获得的更好。例如, 刘玉
焕等[9]从来自中国吐鲁番盆地土壤宏基因组文库中
成功筛选到一个同时具备耐高温(最适温度为78℃)
和耐葡萄糖, 并具有较高酶活性的β-半乳糖苷酶基
因。Culligan等[10]从人结肠微生物宏基因组文库中筛
选获得3个耐盐基因 , 并通过实验证实所获得的基
因具有极强的耐盐力。
本研究通过对不同来源的土壤宏基因组文库的
筛选, 获得了携带草甘膦抗性基因的大肠杆菌, 经
序列分析后构建含有抗草甘膦基因的植物表达载体
并通过农杆菌介导法转化水稻, 再经过对获得抗草
甘膦转基因水稻的不同转化事件的分子鉴定以及对
后代草甘膦的抗性分析, 获得目标性状与农艺性状
俱佳的抗草甘膦转基因水稻新种质资源, 为进一步
创建抗除草剂转基因水稻新品种提供了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
水稻(Oryza sativa subsp. japonica)品种吉农大 878
和大肠杆菌Mach1、质粒 pEAZY-syth、质粒 pUC19、
质粒 pAG35、农杆菌 EHA105均为本实验室保存。
T4 DNA连接酶、fast pfu酶均购自北京全式金
生物技术有限公司, PCR回收试剂盒、胶回收试剂盒
均购自生工生物工程(上海)有限公司, M9 培养基、
草甘膦粉末购自北京鼎国生物公司。
1.2 抗草甘膦 EPSPS基因的获得
依照赵裕栋等[11]的方法提取土壤总DNA, 并通
过琼脂糖凝胶电泳去除腐殖酸等杂质。将限制性内
切酶BamH I稀释至0.01 U µL–1后, 进行不完全酶切,
依次在反应15、30、45、60、75和90 min加热终止
反应, 直接使用PCR回收试剂盒回收酶切反应产物,
连接到经相同酶切的载体 pUC19上 , 在含有 100
mmol L–1草甘膦的M9培养基上筛选。经过37℃培养
48 h后, 挑取具有草甘膦抗性单菌落, 交由生工生
物工程 (上海 )有限公司测序 , 并用DNAMAN、
DNASIS、blast等软件对其进行序列分析, 寻找与草
甘膦抗性相关的开放式阅读框。
1.3 EPSPS基因的原核表达与分析
根据测序分析结果设计引物Primer1、Primer2,
通过PCR扩增获得片段中的soilEPSPS基因, 引物序
列为:
Primer1: 5-acgtATGCATaTGGCCACCCCACCG
ACAAC-3
Primer2: 5-acgtCTCGAGCACTGATCTATAGAA
ATAAC-3
下画线部分为限制性内切酶位点; 小写部分为
保护性碱基; 方框内为碱基突变, 即将 GTG 转变为
ATG。
PCR程序为94℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 58.5℃
30 s, 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃延伸10 min。用PCR
回收试剂盒回收PCR产物, 经Nsi I、Xho I酶切后, 连
入相同酶切的载体pEAZY-syth中 , 命名为pSYTH-
soilEPSPS。
将含有载体pEAZY-syth、pSYTH-CP4和pSYTH-
soilEPSPS的大肠杆菌Mach1细胞在液体LB培养基
中培养至OD值0.8后按照1∶200分别接种于含有0、
100、200、300、400和500 mmol L–1草甘膦的M9液
体培养基, 培养12 h后测定其OD值。
1.4 植物表达载体的构建
利用Nsi I、Xho I, 将pSYTH-soilEPSPS上的
soilEPSPS基因切下, 连接到用Nsi I、Xho I酶切的
pAG35大片段上。经测序验证正确, 命名为pAE35,
以冻融法转化农杆菌EHA105。
1.5 转化与筛选
根据薛勇彪等[12]的方法, 利用农杆菌法转化水
稻愈伤组织, 并在含 0.5%草甘膦的继代培养基上继
代 2 周, 将经筛选后增殖的抗性愈伤组织转移到含
2%草甘膦的预分化培养基和分化培养基中分化培
养, 将抗性再生植株转移到含 0.5%草甘膦的生根培
养基上继续培养, 同时对其进行 PCR 和 Southern 杂
交检测, 将经检测为单拷贝的阳性植株培养至 10 cm
高, 移栽至大盆, 在温室条件下继续培养直至结实。
1.6 T0代转基因植株的分子检测
采用 CTAB法提取抗性再生水稻植株的总 DNA
进行 PCR 检测 , 设计 soilEPSPS 基因检测引物
Primer3 (5-GGAGTGACGTTGGGGCATC-3)和 Primer4
(5-ACTCGTGTGACGGCAGGAC-3), 目 的 片 段
746 bp。PCR程序为 94℃预变性 5 min; 94℃ 30 s,
58℃ 30 s, 72℃ 2 min, 30 个循环; 72℃延伸 10 min。
选取来自不同抗性愈伤组织且 PCR检测为阳性
的植株, 提取基因组 DNA用 Hind III、EcoR I酶切
后电泳, 并利用 20 × SSC转移至尼龙膜上, 以引物
Primer3、Primer4 扩增植物表达载体 pAE35 的 PCR
1192 作 物 学 报 第 40卷


产物为探针, 按照 Roche 公司的 DIG High Primer
Labeling and Detection Starter Kit I说明书固定、标
记和杂交。
1.7 T1 代转基因植株的遗传分析与纯合体转基
因植株的获得
将经过检测为阳性且单拷贝的 T0代转基因株系
种子种植于 10 cm × 10 cm的营养钵中, 待株高达到
10 cm左右, 喷洒 200 mmol L–1的草甘膦溶液进行草
甘膦抗性鉴定并统计分离比例。从鉴定为抗性的不
同转化事件的 T1植株中随机取 10 株继续培养并收
获种子, 各接种 100粒于含有 200 mmol L–1草甘膦
的 MS培养基上, 观察是否出现分离。
1.8 T1、T2代转基因植株的分子鉴定
用 TransZol Up Plus RNA Kit分别提取 3个不同
转基因水稻株系的 T1、T2 代植株的总 RNA, 并用
TransScript One-Step RT-PCR SuperMix进行 RT-PCR
检测, 以 Primer3、Primer4为引物检测目的基因; 以
水稻内源 actin 基因为内参 , 设计引物 Primer5
(5 -CCTGAGAAACGGCTACCAT-3 )、Primer6
(5-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3)扩增该内源基因,
分析不同转化事件后代植株中 soilEPSPS 基因的转
录水平。分别提取 3 个不同转基因水稻株系的 T1、
T2代植株的总 DNA, 按照 1.6描述方法进行 Southern
杂交分析。
1.9 T2代转基因植株的草甘膦抗性鉴定
分别取野生型植株和 3个单拷贝转基因事件的
T1代种子各 10枚播种于 6 cm × 6 cm营养钵中, 共
计 5 组, 每组 3 个重复。待植株生长至 10 cm 高时
分别喷洒 200、300、400、500和 600 mmol L–1的草
甘膦溶液, 2周后观察结果。
2 结果与分析
2.1 片段的克隆与序列分析
比较经筛选获得的抗草甘膦阳性克隆菌落, 选直
径最大的测序, 分析插入序列。序列分析结果表明, 该
段序列共计 4.86 kb, 包含 5个大于 500 bp的开放式阅
读框, 经 Blast分析发现, 其中一个 1404 bp的基因(图
1-A)为EPSPS家族成员, 该基因以GTG为起始密码子,
其密码子上游存在一个典型的 SD 序列。尽管该基因
编码蛋白与EPSPS CP4蛋白序列之间有 68.7%同源性,
但其不含有已经公布的专利[2,13-16]中保护的氨基酸序
列或结构域, 将该基因命名为 soilEPSPS。

图 1 soilEPSPS基因的序列分析
Fig. 1 Sequence analysis of soilEPSPS gene
A: soilEPSPS基因序列。大写碱基表示编码区; 小写碱基表示非编码区域; 方框内为 SD序列; 黑体为起始密码子与终止密码子;
B: 遗传进化分析。
A: sequence of soilEPSPS. Capitals indicate the coding region; lowercases indicate the non-coding region; The SD sequence is framed;
bold font indicate initiation codon and termination codon; B: phylogenetic analysis.
第 7期 王云鹏等: 土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究 1193


与已发表其他 EPSPS 家族成员对比发现, 其与
II型的 EPSPS基因 EPSPS CP4同源性最高, 达 57%
的基因; 而与玉米、大豆等来源的 I 型的 EPSPS 基
因同源性低于 31%。由于 I型和 II型 EPSPS家族来
源于不同的 EPSPS 基因, 不同家族间基因同源性低
于 50%, 因此推断, 克隆的 soilEPSPS 基因属于 II
型 EPSPS 家族。系统进化分析(图 1-B)进一步证明
了该基因为 Class II型的 EPSPS基因。
2.2 EPSPS基因的功能验证
如图 2-C所示, 在含有 200 mmol L–1草甘膦的
M9固体培养基上, 携带 3种不同载体的大肠杆菌生
长状况表明, soilEPSPS基因和 EPSPS CP4基因能够
提高宿主细胞的草甘膦抗性。图 2-B显示, 当草甘膦
浓度大于 200 mmol L–1时, 携带 pSYTH-soilEPSPS的
大肠杆菌菌液OD值明显高于携带 pSYTH-CP4的大
肠杆菌菌液 OD 值, 表明在原核启动子 Prrn 驱动下
的 soilEPSPS基因较 EPSPS CP4基因能够赋予其宿
主细胞更高浓度草甘膦的抗性。
2.3 pAE35植物表达载体的构建
如图 3-A所示, 通过亚克隆将 soilEPSPS基因替
换 pAG35 上的 smGFP 基因 , 由 actin 启动子驱动
并与水稻叶绿体定位引导肽 Rubisco SSU 融合表
达以确保 soilEPSPS 基因编码的蛋白能够进入水
稻叶绿体中执行功能。用 Nsi I、Xho I 酶切鉴定释
放出长约 1.4 kb 的片段(图 3-B), 测序结果进一步
证实插入序列方向正确、无变异 , 将该重组载体命
名为 pAE35。
2.4 抗性植株的获得
如图 4-A 所示, 经过 2 周筛选共获得 7 块抗性
愈伤组织, 将其置含 2%草甘膦的分化培养基上, 共
获得 26 株草甘膦抗性水稻再生植株(图 4-B, C), 将
其移至生根培养基上同时剪取叶片进行分子鉴定
(图 4-E), 移栽阳性单拷贝转化植株, 并在温室中培
养(图 4-D)。
2.5 T0代转基因植株的分子检测
经 PCR鉴定所有抗性植株均为转基因阳性植株,
由于同一块抗性愈伤组织分化出的再生植株可能为
同一转化事件, 因此选择不同来源的 7 株水稻再生
植株进行 Southern 分析, 结果如图 4-E 所示, 编号
03、06、07的 3个转基因株系为单拷贝转化事件。

图 2 利用原核表达验证 soilEPSPS基因的功能
Fig. 2 Prokaryotic expression of soilEPSPS in E. coli
A: 原核表达载体 pEASY-syth、pSYTH-soilEPSPS、pSYTH-CP4的结构; B: 携带 pEASY-syth、pSYTH-soilEPSPS、pSYTH-CP4的大
肠杆菌在含有不同浓度草甘膦培养基中培养 12 h后的 OD值; C: 携带 pEASY-syth、pSYTH-soilEPSPS、pSYTH-CP4的大肠杆菌在含
200 mmol L–1草甘膦平板上生长情况。
A: structure of prokaryotic expression vector pEASY-syth, pSYTH-soilEPSPS and pSYTH-CP4; B: OD values of E. coli with pEASY-syth,
pSYTH-soilEPSPS and pSYTH-CP4 cultured after 12 h in the media containing different concentrations of glyphosate; C: growth of E. coli
carrying pEASY-syth, pSYTH-soilEPSPS, and pSYTH-CP4 cultured on the M9 medium containing 200 mmol L–1 glyphosate.
1194 作 物 学 报 第 40卷



图 3 植物表达载体的构建
Fig. 3 Construction of plant expression vector
A: 植物表达载体 pAE35的 T-DNA结构; B: pAE35的酶切鉴定。
M: DNA分子量标准 200 bp ladder; 1~2: Xho I & Nsi I酶切
pAE35。
A: structure of T-DNA region of plant expression vector pAE35; B: iden-
tification of pAE35 digested by endonucleases of Xho I & Nsi I. M:
marker of 200 bp DNA ladder; lane 1–2: the fragments after disgestion.
2.6 T1 代转基因植株的遗传分析与纯合体转基
因植株的获得
如表 1 所示, 3 个不同的 T0代水稻转基因株系
T1 代的分离均符合孟德尔等位基因遗传规律, 即符
合 3∶1 的分离比。随机取 10 株 T1收获种子, 播种
于含 200 mmol L–1的草甘膦 MS 培养基上, 保存其
后代不发生性状分离的植株种子 , 即转 soilEPSPS
基因纯合植株种子。

表 1 T1转基因植株后代的分离比
Table 1 Segregation ratio of T1 transgenic plants
株系
Line
阳性株数
Positive plants
阴性株数
Negative plants
卡方值(分离比)
χ2(ratio)
03 65 22 0.0077 (3:1)
06 87 28 0.0522 (3:1)
07 25 8 0.0202 (3:1)
2
0.05χ 3.84=

图 4 水稻抗性植株的获得及分子检测
Fig. 4 Regenerated resistant plants and their identification through Southern blotting assay
A~D: 水稻转基因植株的获得; E: Southern杂交。
A–D: obtainment of regenerated resistant plants; E: Southern blot assay.

2.7 T1、T2代转基因植株的分子鉴定
RT-PCR结果表明 , soilEPSPS基因在 3个转基
因株系的后代中均能够正常转录 , 其中编号为 06
的转基因株系的转录水平明显高于其他 2个株系(图
5-A)。Southern 杂交结果表明, soilEPSPS基因在染
色体上的整合能够在其后代稳定遗传(图 5-B)。
2.8 T2代转基因植株的草甘膦抗性鉴定
经过不同浓度的草甘膦溶液喷洒 2周后观察, 当
草甘膦浓度达到 200 mmol L–1时, 野生型植株已经彻
底死亡, 而 3 个不同株系的 T2代转基因水稻植株在
500 mmol L–1草甘膦溶液喷洒后仍能正常生长(图 6),
说明该株系可以耐受 500 mmol L–1草甘膦。
第 7期 王云鹏等: 土壤宏基因组中抗草甘膦新基因的克隆与转化水稻的研究 1195



图 5 纯合植株的分子检测
Fig. 5 Detection of Homozygote transformants
A: RT-PCR检测; B: T1、T2代植株 Southern杂交。
A: RT-PCR detection; B: Southern blot of the plants in T1 and T2 generation.


图 6 转基因水稻的草甘膦抗性鉴定
Fig. 6 Resistance verification of transgenic rice by spraying
glyphosate
A: 喷施草甘膦之前; B: 喷施草甘膦 14 d后。
A: Plants pre-spraying glyphosate; B: Plants at 14 d after spraying
glyphosate.

3 讨论
自 20 世纪 80 年代孟山都公司将农杆菌来源的
EPSPS CP4 基因应用于农作物转基因研究[17]至今,
其转基因农作物已经占据全世界近百万公顷土地[18-19]。
获得具有自主知识产权的抗草甘膦 EPSPS基因对我
国开展抗草甘膦转基因农作物的研发与市场推广具
有十分重要的意义。本研究中克隆的 soilEPSPS 基
因不含有已公布专利中涉及到的特殊氨基酸位点 ,
同时原核功能验证表明其较 EPSPS CP4 基因能够
为宿主细胞提供更强的草甘膦耐受能力 , 是进行
转基因研究开发自主知识产权转基因农作物的重
要基因。
赵海铭等[20]将外源 EPSPS 基因与高粱 EPSPS
基因的叶绿体转运肽相连, 能够取得良好的草甘膦
抗性, 当缺失叶绿体转运肽时, 尽管转基因植株中
EPSPS CP4 基因能够以较高水平表达, 但转基因植
株并不具备草甘膦抗性。本研究中 , 将克隆到的
soilEPSPS基因与水稻 Rubisco SSU引导肽连接, 使
其表达产物定位到水稻质体确保转基因水稻获得更
高的草甘膦耐受性。Daniell等[21]将矮牵牛的 EPSPS
基因稳定整合到烟草的叶绿体中表达, 在赋予烟草
草甘膦抗性的同时防止外源基因通过花粉传播造
成环境问题。我们计划是将 soilEPSPS 基因转化到
水稻叶绿体中 , 并比较细胞核表达该基因编码的
EPSPS 蛋白转移至叶绿体中和该基因直接在叶绿
体内表达对水稻抗草甘膦能力的差异, 进一步探究
转基因水稻抗草甘膦的不同策略。
4 结论
分离得到土壤宏基因组来源的 EPSPS 基因, 证
实该基因对草甘膦具有较好的耐受性。通过农杆菌
侵染的方法将携带该基因的植物表达载体 pAE35导
入水稻基因组后能够极大地提高其对草甘膦的耐受
能力。成功获得了 3 个具有较强草甘膦抗性并能够
稳定遗传的水稻转化事件, 为转基因抗除草剂水稻
新品种的培育奠定了基础。
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