全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 928−934 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30970222)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08005-024B)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding authors): 亓宝秀, E-mail: qbx126@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8246205; 李新征, E-mail: lxz@sdau.edu.cn, Tel:
0538-8246205
第一作者联系方式: E-mail: liujiang2582006@126.com ∗∗同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-09-07; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130219.1020.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00928
球等鞭金藻 Δ5去饱和酶基因 IgD5在拟南芥中的功能鉴定
刘 江** 孙全喜** 李新征* 亓宝秀*
作物生物学国家重点实验室 / 山东农业大学生命科学学院, 山东泰安 271018
摘 要: 从球等鞭金藻中克隆到一个 Δ5去饱和酶基因, 命名为 IgD5。系统发育树分析表明, 该基因编码产物与来源
于巴夫藻 Pavlova salina的 Δ5去饱和酶亲缘关系最近。此前通过酿酒酵母表达系统, 证明 IgD5对 ω6脂肪酸具有 Δ5
去饱和酶活性, 但并未鉴定 IgD5 对 ω3 脂肪酸的催化活性。我们将 IgD5 转化能够内源合成二高-γ-亚麻酸(DGLA,
20:3Δ8,11,14)和二十碳四烯酸(ETA, 20:4Δ8,11,14,17)的已携带 2个基因的拟南芥(简称 TMA2), 通过 PCR及 RT-PCR筛选
阳性植株, 提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸, 用气相色谱分析法检测到花生四烯酸(AA, 20:4Δ5,8,11,14)和二十碳五
烯酸(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17), 含量分别达 7.44%和 2.07%, 转化效率分别为 68%和 60%, 证明 IgD5在转基因植物中具有
Δ5去饱和酶的活性, 对 ω3/ω6脂肪酸没有明显偏好性, 并且催化活性远高于其在酵母中的活性。在转 IgD5的 TMA2
中除了 AA 和 EPA, 没有检测到其他新脂肪酸, 表明 IgD5 底物专一性很强, 是一个可用于植物转基因替代生产鱼油
的良好基因。
关键词: 球等鞭金藻; Δ5去饱和酶; 花生四烯酸; 二十碳五烯酸; ω3脂肪酸; 拟南芥
Functional Characterization of Isochrysis galbana Δ5 Desaturase Gene IgD5 in
Arabidopsis thaliana
LIU Jiang**, SUN Quan-Xi**, LI Xin-Zheng*, and QI Bao-Xiu*
State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: We have isolated a Δ5 desaturase gene from the alga Isochrysis galbana, namely IgD5. Phylogenetic analysis showed
that it shared the highest homology with a functionally characterized Δ5 desaturase from Pavlova salina. Previously, we demon-
strated that IgD5 has activity towards the omega-6 fatty acid substrate by heterologous expression of IgD5 in Saccharomyces cer-
evisiae. However, whether IgD5 also has activity towards the potential omega-3 fatty acid substrate has not been verified. In this
study, we transformed IgD5 into a double transgenic Arabidopsis thaliana (TMA2) that can already synthesize
di-homo-γ-linolenic acid (DGLA, 20:3Δ8,11,14) and eicosatetraenoic acid (ETA, 20:4Δ8,11,14,17). Triple transgenic plants were iden-
tified by PCR and RT-PCR. The total fatty acids composition of the transgenic lines was determined by gas chromatography.
Novel fatty acids, arachidonic acid (AA, 20:4Δ5, 8,11,14) and eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17) were detected and ac-
counted for 7.44% and 2.07% of total fatty acids, with a conversion rate of 68% and 60%, respectively, which are much higher
than those in yeast. In addition, IgD5 did not show a preference for either ω3 or ω6 substrate. Furthermore, IgD5 has strong sub-
strate specificity as no fatty acid products were detected except for AA and EPA. These new findings further confirmed that IgD5
is an excellent gene for the production of fish oil in plants due to its high enzyme activity coupled with substrate specificity.
Keywords: Isochrysis galbana; Δ5 desaturase; Arachidonic acid; Eicosapentaenoic acid; ω3 fatty acids; Arabidopsis thaliana
超长链多不饱和脂肪酸(very long chain poly unsatu-
rated fatty acids, VLCPUFAs)是指含 3个或 3个以上双键
且碳链长度大于 18个碳原子的直链脂肪酸[1]。VLCPUFAs
可分为两类, 其中一类为 ω6 脂肪酸, 如二高-γ-亚麻酸
(DGLA, 20:3Δ8,11,14)和花生四烯酸(AA, 20:4Δ5, 8,11,14); 另
一类是 ω3脂肪酸, 如二十碳五烯酸(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17)
和二十二碳六烯酸(DHA, 22:6Δ4,7,10,13,16,19), 两者区别在
于距离甲基端最近的第 1 个不饱和键的位置。前者为 6,
后者为 3。
EPA和 DHA是人及哺乳动物母乳的必要成分, 具有
第 5期 刘 江等: 球等鞭金藻 Δ5去饱和酶基因 IgD5在拟南芥中的功能鉴定 929


重要的生理功能。研究表明, EPA对心血管的疏导清理有
重要作用 , 有效防止多种心血管疾病和炎症的发生 , 增
强人体免疫力[2-3]; 而 DHA是大脑皮层形成、发育及发挥
功能不可或缺的物质基础 [4]。高等植物中不能合成这类
VLCPUFAs, 目前 EPA和 DHA补食的主要来源是海洋野
生鱼油, 然而近几年来由于过度捕捞造成海洋野生鱼类
资源日益枯竭, 使得鱼油产量已不能满足人们日益增长
的需要, 而且海洋污染导致毒性化合物在鱼油中大量积
累, 使得鱼油质量下降[5-6], 已不适合孕妇和幼儿补食。所
以寻找一条更为持续、稳定、安全的 EPA和 DHA替代生
产来源成为当务之急[7-8]。
在过去 20年中, 参与 VLCPUFAs合成的主要基因已
陆续从哺乳动物、真菌、低等植物和水生生物[9-12]中克隆
到, 这些基因主要分为两类, 一类编码的产物是“前端”去
饱和酶, 存在于内质网中, 其 N 末端含有细胞色素 b5 结
构域 , 该结构域参与去饱和反应中的电子传递; 另一类
编码的产物是链延长酶 , 也存在于内质网中 , 可以将脂
肪酸链延长 2个碳原子。
2004 年, Qi 等[13]从球等鞭金藻中克隆到第 1 个 Δ9
链延长酶, 并且将其与 Δ8 去饱和酶基因和 Δ5 去饱和酶
基因一起转化模式植物拟南芥, 在转化的叶片中检测到
AA和 EPA, 首次验证了 Δ6传统途径外 Δ8替代途径的存
在, 同时证明利用植物内源脂肪酸合成 VLCPUFAS 是可
行的。随后人们已陆续在亚麻、大豆和油菜中合成 EPA 和
DHA, 到目前为止, 在大豆中 EPA 最高产量已达到 19.6%,
DHA 达到 2%[14]。但是转基因植物中 EPA 和 DHA 产量低
仍是限制其商业化生产的重要因素, 继续克隆活性更高的
酶基因将是提高转基因鱼油产量的有效方法之一。
2012年, 我们从球等鞭金藻中克隆到Δ5去饱和酶基
因, 命名为 IgD5, 通过酵母表达鉴定, 表明 IgD5能将 ω6
脂肪酸 DGLA 转化为 AA, 其转化效率最高达到 40.6%,
是迄今为止从海洋微藻中克隆到的活性最高的 Δ5去饱和
酶[15]; 但由于市场缺乏 ω3脂肪酸 ETA, 并没有测定 IgD5
催化 ETA生成 EPA的活性。很多研究结果表明, 来源于
不同物种的前端去饱和酶在酵母中进行异源表达时, 对
ω3/ω6 底物有偏好性 [16-18]。因此 , 源于球等鞭金藻
(Isochrysis galbana)的 IgD5是否具有底物偏好性, 其在植
物中的催化活性如何 , 有必要进一步鉴定 , 这都是转基
因替代生产鱼油所关心的。本研究在此基础上, 构建了
IgD5植物表达载体, 转化本实验室已拥有的转 Δ9链延长
酶和 Δ8 去饱和酶双基因拟南芥 TMA2[13]。由于 TMA2
能内源产生 DGLA和 ETA, 因此我们鉴定了其对 ω3脂肪
酸底物的催化活性 , 并对其酶活特性进行了鉴定评价 ,
丰富了在油料作物中转基因生产鱼油的可用基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
大肠杆菌 XL10 (Stratagene)、植物表达载体 pCambia
1300EC (CAMBIA)、农杆菌菌株 GV3101、带有 IgD5基
因的酵母表达载体 pYES2-IgD5、转 Δ9 链延长酶基因和
Δ8去饱和酶基因的拟南芥 TMA2 (生态型 Col4)为本实验
室保存[13]; 克隆载体 pMD18-T simple、Taq酶、限制性内
切酶、T4连接酶等均购自 TaKaRa公司。
1.2 拟南芥表达载体的构建以及农杆菌介导的遗传转化
用限制性内切酶 Kpn I 消化植物表达载体 pCam-
bia1300EC (改良的 pCambia1300, 其 T-DNA上带有烟草
花叶病毒 CaMV35S 启动子及胭脂碱合成酶的 nos 终止子),
并用去磷酸化酶 CIAP去磷酸化; 同时用 Kpn I酶切酵母
表达载体 pYES2-IgD5 上球等鞭金藻 Δ5 去饱和酶基因
IgD5 片段; 将酶切产物用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将
线性化载体 pCambia1300EC 与 IgD5 片段按摩尔比 1∶
3~1∶9用T4连接酶连接, 然后转化大肠杆菌XL10, 筛选
正向连接的阳性克隆, 提取质粒, 经酶切及测序验证后,
转化农杆菌 GV3101, 然后利用花序侵染法转化拟南芥
[19]。
1.3 转基因拟南芥的筛选与鉴定
收集农杆菌侵染后的拟南芥 T0代种子, 无菌条件下
用 70%酒精处理 1 min, 2.6%的次氯酸钠处理 10 min, 再
用无菌水冲洗 4~5次, 播种于含潮霉素 10 μg mL–1的 GM
培养基上。4℃黑暗放置 1~2 d后, 转至光周期 16 h/8 h (光
照/黑暗)条件下培养, 待 T1 代潮霉素抗性的拟南芥幼苗
长出 2片子叶后, 移栽于基质中。分别用 SDS法和 TRIzol
法提取其基因组 DNA 和 RNA, 利用 IgD5 基因特异引物
5-ATGGTGGCAGGCAAATCAGG-3和 5-CTAGTGCGT
GTGCTCGTGGT-3进行 PCR 检测, 5-GCGTACAACAA
CTTTCACGT-3和 5-ACTGCCAGCCGAAAGAGACG-3
进行 RT-PCR检测。
1.4 脂肪酸提取及气相色谱分析
取转化的拟南芥叶片 0.5 g, 烘干并加液氮研磨后,
置 3 mL的玻璃瓶中, 添加 1 mL甲基化溶液(含甲醇 85%,
2,2-二甲氧丙烷 5%, 盐酸 10%), 85℃甲基化反应 1 h; 冷
却后, 添加 1%氯化钠 1 mL, 正己烷 0.5 mL, 漩涡振荡,
然后室温放置 10 min 或更长时间; 离心取上清液, 用日
本岛津 2010气相色谱仪进行气相色谱分析。
2 结果与分析
2.1 IgD5的克隆与系统进化树分析
经生物信息学分析 , 发现其具备“Front-end”去饱和
酶的 4 个保守区 HPGG、HxxxH、HxxHH 以及 LNx-
QIEHHLFP[15]。利用 MEGA5.05 软件对 IgD5 和其他 14
个已知功能的 Δ5去饱和酶进行系统进化树分析(图 1), 发
现 IgD5与 Pavlova salina和 Thraustochytrium sp.中的 Δ5
去饱和酶亲缘关系最近, 而 Pavlova salina中的 Δ5去饱和
酶可以将 ω3 脂肪酸 ETA 转化为 EPA, 转化率为 11.3%;
因此推测 IgD5也可能具有将 ETA转化为 EPA的活性。
930 作 物 学 报 第 39卷


图 1 IgD5与其他 14个 Δ5去饱和酶的邻接法系统进化树分析
Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of IgD5 and 14 functionally characterized delta-5 fatty acid desaturases from other species
GenBank编号分别是: CAD53323.1 (Δ5, Phytophthora megasperma), AAL13311.1 (Δ5, Pythium irregulare), BAA37090.1 (Δ5, Dictyostelium dis-
coideum), AAC72755.1 (Δ5, Mortierella alpina), CAQ30478(Δ5, Mantoniella squamata), CAL57370.1 (Δ5, Ostreococcus tauri), AAT85663.1 (Δ5,
Marchantia polymorpha), CS020055.1 (Δ5, Physcomitrella patens), AAL92562.1 (Δ5, Phaeodactylum tricornutum), DQ995517.1 (Δ5, Pavlova salina),
AAM09687.1 (Δ5, Thraustochytrium sp.), AAD13294.1 (Δ5, Caenorhabditis elegans), AAF70457.1 (Δ5, Homo sapiens), AAH26831.1 (Δ5, Mus
musculus).

2.2 植物表达载体 pCambia1300-IgD5的构建
选择拟南芥 TMA2 作为材料, 通过转基因技术, 在
TMA2 中表达鉴定 IgD5 对 ω3 脂肪酸底物的催化活性。
用限制性内切酶 Kpn I 消化 pYES2-IgD5 载体上 IgD5
cDNA 片段, 重组到植物表达载体 pCambia1300EC 多克
隆位点中的 Kpn I 位点上 (图 2)。菌落 PCR 筛选与
CaMV35S正向连接的克隆, 获得带有 IgD5去饱和酶基因
的植物表达载体 pCambia1300-IgD5。用限制性内切酶 Kpn
I进一步酶切检测, 发现能够切下 1.3 kb的 IgD5条带(图
3), 表明 pCambia1300-IgD5质粒上带有 IgD5基因。
2.3 IgD5的转化及转基因植株的筛选与鉴定
利用花序侵染法, 将 IgD5 转化到拟南芥 TMA2 中,
收获的部分种子经过潮霉素筛选得到 5株 T1代转基因株

图 2 拟南芥 pCambia1300-IgD5 载体的构建
Fig. 2 Construction of the vector pCambia1300-IgD5

系, SDS 法提取转基因株系叶片基因组 DNA, 以 TMA2
叶片基因组 DNA 作对照, 利用 IgD5 基因特异引物进行
PCR检测, 在转基因株系中均可扩增到 1.3 kb的条带, 而
TMA2 中没有(图 4), 因此初步确定上述 5 个转基因株系
为阳性株系。为了进一步验证 IgD5是否在拟南芥中表达,
用 Trizol 法分别提取野生型与转基因 T1 代拟南芥叶片
RNA, RT-PCR检测结果表明 IgD5在转基因拟南芥中已经
成功表达(图 5)。


图 3 pCambia1300-IgD5的 Kpn I酶切电泳图
Fig 3 Kpn I restriction digestion electrophoregram of the
recombinant plasmid pCambia 1300-IgD5
1: Kpn I酶切的 Pcambia 1300-IgD5载体; M: DNA分子量。
1: Kpn I Digestion of pCambia 1300-IgD5 vector; M: DNA marker.
第 5期 刘 江等: 球等鞭金藻 Δ5去饱和酶基因 IgD5在拟南芥中的功能鉴定 931



图 4 转基因拟南芥(T1)的 PCR检测
Fig. 4 Detection of transgenic lines (T1) by PCR
以 T1代转基因植株和 TMA2植株的叶片基因组为模板进行基因组
PCR检测。1~5: 不同的转基因株系;
WT: TMA2 拟南芥为阴性对照; M: DNA分子量。
Genomic DNA as templates for PCR analysis was extracted from leaves
of T1 transgenic lines and TMA2 plants. 1–5: transgenic lines;
WT: TMA2 plants as negative control; M: DNA marker.

图 5 转基因拟南芥(T1)的 RT-PCR检测
Fig. 5 Detection of transgenic lines (T1) by RT-PCR
转基因拟南芥的 RT-PCR分析, 分别从 T1代转基因植株及 TMA2植
株中提取总 RNA反转录作为 PCR分析的模板。
1~5: 不同的转基因株系; WT: TMA2拟南芥为阴性对照。
RT-PCR analysis of IgD5 expression in transgenic plants. Total RNA
was isolated from T1 transgenic and TMA2 plants.
1–5: transgenic lines; WT: TMA2 plants as negative control.
2.4 转基因拟南芥叶片脂肪酸成分分析
分别选取 TMA2和转基因拟南芥 T1代叶片, 提取总
脂肪酸, 用气相色谱分析检测。在 5 株转基因拟南芥 T1
代叶片中检测到 AA 和 EPA, 平均含量占到总脂肪酸的
7.44%和 2.07% (表 1)。IgD5转化 DGLA和 ETA生成 AA
和 EPA的转化率分别为 68%和 60% (转化率=产物/(产物+
底物)×100), 转化率都很高且相近, 表明 IgD5 对 ω3/ω6
脂肪酸底物没有偏好性。此外, 在转基因拟南芥 T1代中,
除 AA和 EPA外, 没有检测到其他新脂肪酸, 并且表型没
有改变。
2.5 IgD5与其他 Δ5去饱和酶的活性比较
通过生物信息学分析比较 IgD5 与其他 14 个已知功能
的 Δ5 去饱和酶的活性 , 发现 IgD5 的活性仅次于线虫
Caenorhabditis elegans的 Δ5去饱和酶(表 2), 但不同来源的
去饱和酶作用底物有所不同 , 动物中的去饱和酶以酰基
-CoA 中的脂肪酸为底物, 植物和微生物中的去饱和酶以磷
脂特别是磷脂酰胆碱(PC)中的脂肪酸为底物[21], 而球等鞭
金藻属于藻类植物, 因此 IgD5更适用于 VLCPUFAs在植物
中的生产。以前的研究结果表明, 很多已经验证功能的 Δ5
去饱和酶除了能够将DGLA和 ETA分别转化为AA和 EPA,
还可以将 EDA和 ETrA分别转化二十碳三烯酸(20:3Δ5,11,14)
和二十碳四烯酸(20:4Δ5,11,14,17), 并且少数 Δ5 去饱和酶也能
以 18:1Δ11为底物进行转化(表 2), 而在转有 IgD5 的拟南芥
中, 并没有检测到上述副产物, 表明 IgD5专一性更强, 具有
更高的应用价值。

表 1 转基因拟南芥叶片脂肪酸组成分析
Table 1 Total fatty acid composition of leaves from transgenic A. thaliana
植物源 Plant source 植物源 Plant source 脂肪酸
Fatty acid (mol % of total) TMA2 TMA2+IgD5
脂肪酸
Fatty acid (mol % of total) TMA2 TMA2+IgD5
16:0 19.91 25.00±3.30 20:2(n-6) 2.54 4.29±0.60
16:1 1.41 1.94±0.30 20:3(n-3) 3.90 4.61±0.60
16:3 7.37 5.32±0.80 20:3(n-6) 10.40 3.49±0.50
18:0 1.82 2.62±0.30 20:4(n-3) 3.65 1.40±0.30
18:1 4.53 5.61±0.60 20:4(n-6)AA — 7.44±1.00
18:2(n-6) 9.97 12.14±1.40 20:5(n-3)EPA — 2.07±0.40
18:3(n-3) 34.48 23.87±3.20
TMA2是转球等鞭金藻 Δ9链延长酶和眼虫 Δ8去饱和酶 2基因的拟南芥; TMA2+IgD5是转球等鞭金藻 IgD5基因的 TMA2拟南芥, 对 5
株拟南芥莲座叶检测, 每个值表示平均值±方差。
The TMA2 plants contain a Δ9-elongase gene from Isochrysis galbana and a Δ8-desaturase gene from Euglena gracilis, while the TMA2+IgD5
plants were produced by transforming the TMA2 plants with the Δ5-desaturase gene IgD5 from Isochrysis galbana. Leaves from rosette stage plants
was analyzed, and each value represents the mean ± standard error from five transgenic plants.

3 讨论
海洋微藻球等鞭金藻富含 DHA, 其含量可以达到
12%, 推测其长链多不饱和脂肪酸合成途径中的相关去
饱和酶和链延长酶活性应较高 , 是一个克隆此类酶基
因的理想材料。2002年 Qi等 [22]从球等鞭金藻克隆到 Δ9
链延长酶基因, 在酵母中的催化活性达到 45%; 2004 年
Suzette等 [23]从中克隆到 Δ4去饱和酶基因 , 在酵母中的
催化活性为 28%; 2012年我们从球等鞭金藻中克隆到一
个 Δ5 去饱和酶基因, 命名为 IgD5, 酵母表达鉴定表明
IgD5 具有将 ω6 脂肪酸 DGLA 转化为 AA 的 Δ5 去饱和
酶活性 , 催化活性最高达到 40.3%。这些基因的克隆 ,
表明球等鞭金藻确实是克隆该类高活性相关酶基因的
良好材料。
932 作 物 学 报 第 39卷

表 2 IgD5与其他 Δ5去饱和酶在酵母中的活性比较
Table 2 Comparison of activities between IgD5 and other Δ5 desaturase genes in yeast
底物转化率 Substrate conversion rate (%) 基因
Gene
物种
Species 20:2Δ[11,14] 20:3Δ[11,14,17] 20:3Δ[8,11,14] 20:4Δ[8,11,14,15] 18:1Δ[11]
专一性
Specificity
参考文献
Reference
CED5 C.E.(a) — — 15.0 — — 未测 No test Zheng et al. [26]
FAT-4 C.E.(b) 27.0 26.0 55.0 — 5.0 低 Low Watts et al. [35]
MsΔ5 M.S. 1.0 1.0 9.5 8.2 — 低 Low Hoffmann et al. [30]
MpDES5 M.P. — — 6.3 23.1 — 未测 No test Kajikawa et al. [31]
M.A5 M.A. — — 21.3 — — 未测 No test Michaelson et al. [12]
PiDes5 P.I. — 10.0 16.4 17.1 — 低 Low Iskandarov et al. [32]
PtD5 P.T. 11.8 10.8 24.7 — 2.0 低 Low Dormergue et al. [28]
PsD5Des P.S. — — — 11.3 — 未测 No test Zhou et al. [20]
PPDES5 P.P. 13.5 14.5 14.7 — — 低 Low Kaewsuwan et al. [11]
PmFAD5 P.M. nd nd 15.0 21.0 — 高 High Hornung et al. [33]
PiD5 P.IR. 19.5 15.6 32.0 — 12.1 低 Low Hong et al. [34]
TpdesO T.P. 4.7 8.4 16.0 19.0 — 低 Low Tonon et al. [24]
IgD5 I.G. nd nd 40.6 — — 高 High Sun et al. [15]
C.E.: Caenorhabditis elegans; M.S.: Mantoniella squamata; M.P.: Marchantia polymorpha; M.A.: Mortierella alpine; P.I.: Parietochloris incise;
P.T.: Phaeodactylum tricornutum; P.S.: Pavlova salina; P.P.: Physcomitrella patens; P.M.: Phytophthora megasperma; P.IR.: Pythium irregular; T.P.:
Thalassiosira pseudonana; I.G.: Isochrysis galbana; nd: not detected.

系统进化树分析结果表明 IgD5与 Pavlova salina中
的 Δ5 去饱和酶同源性最高。很多研究结果表明, 来源于
不同物种的这类前端去饱和酶在酵母中异源表达时, 对
ω3/ω6 脂肪酸底物有偏好性 , 例如近些年陆续从
Mantoniella squamata、Micromonas pusilla、Ostreococcus
lucimarinus、Thalassiosira pseudonana和 Primula中克隆
到的 Δ6去饱和酶都被证明对外源 ω3脂肪酸 ALA有偏好
性[16-18,24-25], 从鱼中克隆的所有 Δ6 去饱和酶也被证明对
ω3 脂肪酸 ALA 有偏好性 [26]; 然而来源于 Leishmania
major和 Thalassiosira pseudonana的 Δ5去饱和酶却并没
有对 ω3/ω6 底物表现出偏好性[27,24], 因此 IgD5 对 ω3/ω6
脂肪酸底物的催化活性有无偏好性有必要验证。
本研究表明, IgD5对 ω6脂肪酸 DGLA和 ω3脂肪酸
ETA 的转化效率相近, 没有表现出对 ω6 与 ω3 不同脂肪
酸底物明显的偏好性。由于很多去饱和酶对 ω6脂肪酸有
偏好性, 从而导致 AA的产量很高, 需要转入 Δ17去饱和
酶来降低 AA的含量提高 EPA产量, 因此对 ω6没有偏好
性的 IgD5更有利于转基因植物鱼油中 EPA含量的提高。
迄今为止, 所有克隆鉴定的 Δ5去饱和酶活性比较分
析表明, IgD5的活性仅次于 Caenorhabditis elegans的 Δ5
去饱和酶[12-14,28-35], 达到 40.3%(表 2), 并且在转基因拟南
芥中, IgD5的活性高于其在酵母中的活性。研究表明, 许
多已知的 Δ5 去饱和酶对脂肪酸底物的专一性不强, 会产
生 20:3Δ5,11,14和 20:4Δ5,11,14,17等非特异性脂肪酸, 这些脂
肪酸在天然鱼油中是不含有的, 而本研究中, 在转 IgD5
基因的拟南芥 TMA2 中除了检测到 AA 和 EPA 外, 并没
有检测到像上面所描述的一些非特异性脂肪酸, 也没有检
测到其他新的脂肪酸, 这与在酵母中的表达结果一致[15],
表明 IgD5具有很强的底物专一性(表 2)。
由于 Δ5 去饱和酶催化的是 EPA Δ6 和 Δ8 两条合成
途径中都必经的最后一步反应, 因此选择高催化活性、强
底物专一性并且对 ω3/ω6 脂肪酸底物没有催化偏好性的
IgD5, 对无论采用哪条途径在转基因植物中合成 EPA 都
具有很高的应用价值。所以 IgD5是转基因植物鱼油生产
过程中一个可供选择的理想基因资源。
References
[1] Napier J A, Sayanova O. The production of very-long-chain
PUFA biosynthesis in transgenic plants: towards a sustainable
source of fish oils. Proc Nutr Soc, 2005, 64: 87–93
[2] Funk C D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eico-
sanoid biology. Science, 2001, 294: 1871–1875
[3] Simopoulos A P. Omega-3 fatty acids in inflammation and auto-
immune diseases. J Am Coll Nutr, 2002, 21: 495–505
[4] Uauy R, Hoffman D R, Peirano P, Birch D G, Birch E E. Essen-
tial fatty acids in visual and brain development. Lipids, 2001, 36:
885–895
[5] Heinz E. First breakthroughs in sustainable production of “oce-
anic fatty acids.” Eur J Lipid Sci Technol, 2006, 108: 1–3
[6] Yokoo E M, Valente J G, Grattan L, Schmidt S L, Platt I, Silbergeld E K.
Low level methylmercury exposure affects neuropsychological function
in adults. Environ Health: A Global Access Sci Sour, 2003, 2: 8
[7] Domergue F, Abbadi A, Heinz E. Relief for fish stocks: oceanic
fatty acids in transgenic oilseeds. Trends Plant Sci, 2005, 10:
112–116
第 5期 刘 江等: 球等鞭金藻 Δ5去饱和酶基因 IgD5在拟南芥中的功能鉴定 933


[8] Kinney A J. Metabolic engineering in plants for human health
and nutrition. Curr Opin Plant Biol, 2006, 17: 130–38
[9] Hamada F, Otani M, Kim S H, Uchida H, Kajikawa M. Accumu-
lation of γ-linolenic acid by overexpression of a liverwort Δ6 de-
saturase gene in transgenic rice. Plant Cell Physiol, 2006,
47(suppl-l): 195
[10] Michaelson L V, Napier J A, Lewis M, Griffiths G, Lazarus C M,
Stobart A K. Functional identification of a fatty acid Δ5 desatu-
rase gene from Caenorhabditis elegans. FEBS Lett, 1998, 439:
215–218
[11] Kaewsuwan S, Cahoon E B, Perroud P F, Wiwat C, Panvisavas N,
Quatrano R S. Identification and functional characterization of
the moss Physcomitrella patens delta5-desaturase gene involved
in arachidonic and eicosapentaenoic acid biosynthesis. J Biol
Chem, 2006, 281: 21988–21997
[12] Michaelson L V, Lazarus C M, Griffiths G, Napier J A, Stobart A
K. Isolation of a Δ5-fatty acid desaturase gene from Mortierella
alpina. J Biol Chem, 1998, 273: 19055–19059
[13] Qi B X, Fraser T, Mugford S, Dobson G, Sayanova O, Butler J,
Napier J A, Stobart A K, Lazarus M C. Production of very long
chain polyunsaturated omega-3 and omega-6 fatty acids in plants.
Nat Biotechnol, 2004, 22: 739–745
[14] Kinney A J, Cahoon E B, Damude H G, Hitz W D, Kolar C W,
Liu Z B. Production of very long chain polyunsaturated fatty ac-
ids in oilseed plants. WO 2004/071467 A2, 2004
[15] Sun Q-X(孙全喜), Li X-Y(李雪滢), Zheng D-S(郑德松), Liu
J(刘江), Li X-Z(李新征), Qi B-X(亓宝秀). Isolation and func-
tional analysis of a Δ5 desaturase from Isochrysis galbana. Acta
Hyd Sin (水生生物学报), 2012, 36(3): 412–419 (in Chinese with
English abstract)
[16] Hoffmann M, Wagner M, Abbadi A, Fulda M, Feussner I. Meta-
bolic engineering of ω3-very long chain polyunsaturated fatty
acid production by an exclusively acyl-CoA-dependent pathway.
J Biol Chem , 2008, 283: 22352–22362
[17] Petrie J R, Shrestha P, Mansour M P, Nichols P D, Liu Q, Singh S
P. Metabolic engineering of omega-3 long-chain polyunsaturated
fatty acids in plants using an acyl-CoA Δ6-desaturase with
ω3-preference from the marine microalga Micromonas pusilla.
Met Eng, 2010, 12: 233–240
[18] Petrie J R, Liu Q, Mackenzie A M, Shrestha P, Mansour M P,
Robert S S, Frampton D F, Blackburn S I, Nichols P D, Singh S P.
Isolation and characterisation of a high-efficiency desaturase and
elongases from microalgae for transgenic LC-PUFA production.
Mar Biotechnol, 2010 12: 233–240
[19] Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agro-
bacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J, 1998, 16: 735–743
[20] Zhou X R, Robert S S, Petrie J R, Frampton D M F, Mansour M P,
Blackburn S I, Nichols P D, Green A G, Singh S P. Isolation and
characterization of genes from the marine microalga Pavlova sa-
lina encoding three front-end desaturases involved in docosa-
hexaenoic acid biosynthesis. Phytochemistry, 2007, 68: 785–96
[21] Venegas-Calerón M, Sayanova O, Napier J A. An alternative to
fish oils: metabolic engineering of oil-seed crops to produce
omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids. Prog Lipid Res,
2010, 49: 108–119
[22] Qi B, Beaudoin F, FraseR T, Stobart A K, Napier J A, Lazarus C
M. Identification of a cDNA encoding a novel C18-delta(9)
polyunsaturated fatty acid-specific elongating activity from the
docosahexaenoic acid (DHA)-producing microalga, Isochrysis
galbana. FEBS Lett, 2002, 510: 159–165
[23] Pereira S L, Leonard A E, Huang Y S, Chuang L T, Mukerji P.
Identification of two novel microalgal enzymes involved in the
conversion of the omega3-fatty acid, eicosapentaenoic acid, into
docosahexaenoic acid. Biochem J, 2004, 384(Pt 2): 357–366
[24] Tonon T, Sayanova O, Michaelson L V, Qing R, Harvey D, Lar-
son T R, Li Y, Napier J A, Graham I A. Fatty acid desaturases
from the microalga Thalassiosira pseudonana. FEBS J, 2005,
272: 3401–3412
[25] Sayanova O, Beaudoin F, Michaelson V L, Shewry R P, Napier J
A. Identification of Primula fatty acid Δ6-desaturases with n-3
substrate preference. FEBS Lett, 2003, 542: 100–104
[26] Zheng X Z, Ding Z K, Xu Y Q, Monroig O, Morais S, Tocher D
R. Physiological roles of fatty acyl desaturases and elongases in
marine fish: Characterisation of cDNA of fatty acyl Δ6 desaturase
and elovl5 elongase of cobia (Rachycentron canadum). Aquacul-
ture, 2009, 290: 122–131
[27] Tripodi K E J, Buttigliero L V, Altabe S G, Uttaro A D. Func-
tional characterization of front-end desaturases from trypanoso-
matids depicts the first polyunsaturated fatty acid biosynthetic
pathway from a parasitic protozoan. FEBS J, 2006, 273: 271–280
[28] Dormergue F, Lercgl J, Zahringer U, Heinz E. Cloning and func-
tional characterization of Phaeodactylum tricornutum front-end
desaturases involved in eicosapentaenoic acid biosynthesis. Eur J
Biochem, 2002, 269, 4105–4113
[29] Cho H P, Nakamura M, Clarke S D. Cloning, expression, and
fatty acid regulation of the human Δ5 desaturase. J Biol Chem,
1999, 274: 37335–37339
[30] Hoffmann M, Wagner M, Abbadi A, Fulda M, Feussner I. Meta-
bolic engineering of ω3-very long chain polyunsaturated fatty
934 作 物 学 报 第 39卷

acid production by an exclusively acyl-CoA-dependent pathway.
J Biol Chem, 2008, 283: 22352–22362
[31] Kajikawa M, Yamato K T, Kohzu Y, Nojiri M, Sakuradani E,
Shimizu S, Sakai Y, Fukuzawa H, Ohyama K. Isolation and
characterization of Δ6-desaturase, an ELO-like enzyme and
Δ5-desaturase from the liverwort Marchantia polymorpha and
production of arachidonic and eicosapentaenoic acids in the me-
thylotrophic yeast Pichia pastoris. Plant Mol Biol, 2004, 54:
335–352
[32] Iskandarov U, Goldberg J L, Cohen Z. Identification and Char-
acterization of Δ12, Δ6, and Δ5 Desaturases from the Green Mi-
croalga Parietochloris incisa. Lipids, 2010, 45: 519–530
[33] Hornung E, Korfei M, Pernstich C, Struss A, Kindl H, Fulda M,
Feussner I. Specific formation of arachidonic acid and ei-
cosapentaenoic acid by a front-end Δ5-desaturase from Phy-
tophthora megasperma. Biochim Biophys Acta, 2005, 1686:
181–189
[34] Hong H, Datla N, MacKenzie S L, Qiu X. Isolation and charac-
terization of a delta5 FA desaturase from Pythium irregulare by
heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and oilseed
crops. Lipids, 2002, 37: 863–868
[35] Watts J L, Browse J. Isolation and characterization of a delta
5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Arch Bio-
chem Biophys, 1999, 362: 175–182