全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(3): 415−423 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971546)和山东省自然科学基金项目(ZR2009DM013)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 单雷, E-mail: shlei1025@sina.com, Tel: 0531-83179435
第一作者联系方式: E-mail: zhoulixia206@126.com
Received(收稿日期): 2010-08-02; Accepted(接受日期): 2010-12-03.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00415
花生 AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性
周丽侠 1,3 唐桂英 1,2 陈 高 1,3 毕玉平 1,2,3 单 雷 1,2,*
1 山东省农业科学院高新技术研究中心 / 山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室, 山东济南 250100; 2 农业部黄淮海作物
遗传改良与生物技术重点实验室, 山东济南 250100; 3 山东师范大学生命科学学院, 山东济南 250014
摘 要: 高油酸低亚油酸的花生油稳定性好、营养价值高, 培育高油酸/亚油酸比值(O/L)的花生品种一直是花生育种
的重要目标。为深入了解控制花生 O/L 比值的遗传基础, 提高花生品质育种效率, 对鲁花 14 等 13 个花生品种 Δ12
脂肪酸脱氢酶 AhFAD2 基因的编码区进行了序列分析。结果表明, 该基因在 13 个花生品种中皆存在 3 类转录本, 即
AhFAD2A、AhFAD2B 和假基因。台山珍珠、台山三粒肉、江田种、Chico、05-21063、白沙 1016 的基因型是
OL1OL1OL2OL2; 临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花 14、花育 19、花育 23的基因型是 ol1ol1OL2OL2; 鲁花 11的基
因型可能存在 OL1ol1杂合等位位点。在个别品种中 AhFAD2A基因的若干位置存在多态性; AhFAD2B基因相对保守,
所测 13 个花生品种的核苷酸序列基本相同。结合 13 个花生栽培品种籽粒中 O/L 比值测定的结果, 初步探讨了基因
多态性与 O/L比值之间的关系, 同时对假基因可能存在的功能进行了讨论。
关键词: 花生; Δ12脂肪酸脱氢酶基因; 基因多态性; O/L比值; 假基因
Correlation between AhFAD2 Polymorphism and Oleic Acid/Linoleic Acid Ra-
tio in Peanut Seeds
ZHOU Li-Xia1,3, TANG Gui-Ying1,2, CHEN Gao1,3, BI Yu-Ping1,2,3, and SHAN Lei1,2,*
1 Hi-Tech Research Centre, Shandong Academy of Agricultural Sciences and Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop, Animal and Poultry
of Shandong Province, Jinan 250100, China; 2 Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Huanghuaihai, Ministry of Agricul-
ture, Jinan 250100, China; 3 College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China
Abstract: Peanut oils containing high levels of oleic acid and low linoleic acid levels are strongly demanded. This would improve
oil stability and nutritional quality. Thus, breeding peanut variety with high oleic acid/linoleic acid (O/L) has become one of the
major goals in plant breeding. To investigate the genetic traits that control high oleate levels-phenotype and improve the pea-
nut-breeding efficiency, we sequenced ORF region of about 527 delta 12 fatty acid desaturase AhFAD2 cDNAs from 13 peanut
varieties. Our results showed that three types of mRNA transcripts AhFAD2A, AhFAD2B and pseudogene existed in all peanut
varieties. Genotypes of peanut varieties Taishan Pearl, Taishan Sanlirou, Jiangtian, Chico, 05-21063, Baisha 1016; and Lingui-
make, Feilongxiang, Goule, Luhua 14, Huayu 19, Huayu 23, and Luhua 11 were found to be OL1OL1OL2OL2, ol1ol1OL2OL2,
and OL1ol1OL2OL2, respectively. We also found that some SNP polymorphism sites existed in the AhFAD2A gene but not in all
peanut varieties, and AhFAD2B was relatively conserved in all 13 peanut varieties investigated. Combined with the measurement
of O/L ratio in various peanut varieties, the relationship between gene polymorphism and O/L ratio was primarily investigated.
Meanwhile, the potential function of pseudogene was also discussed.
Keywords: Arachis hypogaea L.; Δ12 fatty acid desaturase gene; Gene polymorphism; O/L ratio; Pseudogene
花生是世界四大油料作物之一, 在许多热带和
亚热带地区广泛种植。花生籽粒含油量约占种子干
重的 44.27%~53.86%[1]; 而其储藏油脂中 80%左右
为不饱和脂肪酸 (其中油酸 36%~67%, 亚油酸
15%~43%), 饱和脂肪酸仅占 20%左右(其中棕榈酸
6%~11%, 硬脂酸 2%~6%, 花生酸 5%~7%)[2-4]。
416 作 物 学 报 第 37卷

脂肪酸的组成是决定食用植物油质量的重要因
素, 高油酸低亚油酸的花生油稳定性好、营养价值
高, 是人们所喜爱的[5-6]。从油脂稳定性角度看, 亚
油酸是一种多不饱和脂肪酸, 它的油酰残基易于氧
化 , 严重影响油的贮存期 [7]; 而油酸的氧化稳定性
比亚油酸高 10 倍[8], 高油酸/亚油酸比值(O/L 比值)
的花生不易氧化和腐败, 货架期较长[9]。从对人体健
康角度考虑, 亚油酸的氧化产物具有导致动脉粥样
化的潜在危害, 同时还产生难闻的气味和腐败恶臭
的不适口感[10]。油酸有益于预防癌症, 维持有益胆
固醇高密度脂蛋白(HDL)水平, 增强胰岛素敏感性,
还可以改善一些炎症[11-14]。为了提高油脂的稳定性,
工业上常通过加氢提高油脂的饱和度, 这往往在碳
链中引入反式双键生成反式脂肪酸, 长期食用会危
害健康。因此, O/L比值是衡量花生品质性状的重要
指标[15], 提高花生籽粒的 O/L 比值是植物油脂遗传
改良的主要目标。
Δ12脂肪酸脱氢酶(delta 12 fatty acid desaturase,
Δ12FAD 或 FAD2)是控制籽粒油酸、亚油酸含量和
O/L比值的关键酶, 它催化油酸在碳 12位上脱氢生
成亚油酸。Δ12 脂肪酸脱氢酶酶活性丧失是产生高
O/L 比值花生的主要原因之一[15]。花生是异源四倍
体(2n=4x=40, AABB), FAD2由位于不同基因组上的
两个非等位基因 AhFAD2A 和 AhFAD2B 共同编码,
这两个基因的突变引起酶结构、酶活性或表达调控
的变化, 共同导致高油酸性状的产生[10,16]。
为了深入了解控制花生 O/L 比值的遗传基础,
提高花生育种的选育效率, 育种者针对一些高 O/L
比值的花生品种开发了 CAPS[17]、Real-time PCR[18]、
AS-PCR (Allele-Specific PCR)[19]等标记方法, 但这
些方法仅限于特定类型的突变体, 无法对丰富多样
的花生种质进行分析。本研究通过对参试栽培品种
AhFAD2 基因编码区的测序和多态性分析, 寻找与
O/L 比值性状关联的多态性位点, 试图建立基因多
态性与 O/L 比值性状之间的关系, 为花生 O/L 比值
性状的遗传改良提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 花生(Arachis hypogaea L.)品
种: 台山珍珠、台山三粒肉、临桂麻壳、飞龙乡、
江田种、勾了种、Chico、05-21063由中国农业科学
院油料作物研究所廖伯寿研究员提供; 鲁花 11、鲁
花 14、花育 19、花育 23、白沙 1016由山东省农科
院花生研究所提供。将当年从大田收获的花生种子
充分晾晒, 贮存于室温干燥处以备测定花生脂肪酸
组分。以当年收获的花生种子进行室内培苗, 12 d后,
分别取参试品种的幼叶 , 经液氮冷冻后储存于
–70℃冰箱以备提取 RNA。
1.1.2 菌株及质粒 大肠杆菌(Escherichia coil)
DH5α由本实验室保存。pEASY-T3克隆载体为北京
全式金生物技术有限公司产品。
1.1.3 试剂 2×TransHifi SuperMix II 购自北京
全式金生物技术有限公司; 琼脂糖凝胶 DNA 回收
试剂盒(普通离心柱型)、氨苄青霉素(Amp)购自北京
鼎国生物技术有限公司; DNase I、PrimeScript 1st
Strand cDNA Synthesis Kit由大连 TaKaRa生物技术
公司生产; PCR 扩增引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。
1.2 RNA提取和 cDNA合成
用本实验室改进的 CTAB法提取幼叶总 RNA。
为防止 RNA 酶污染, 研钵、研锤、药匙均以 180℃
烘烤 6 h, 所用塑料制品用 0.1%的 DEPC水浸泡, 于
室温下过夜后, 高温灭菌处理。具体步骤是: ①取
0.2 g花生叶片于液氮中研磨成粉末, 迅速转至 65℃
预热的含有 600 μL CTAB提取液(用前加 2% β-巯基
乙醇)的 1.5 mL离心管中, 立即剧烈涡旋振荡 30 s,
使其混匀。②65℃水浴 2~5 min, 期间剧烈涡旋振荡
3~5 次 , 稍微冷却后加入等体积的氯仿和异戊醇
(24 1)∶ 涡旋振荡 1 min, 混匀, 4℃, 13 000×g离心 15
min。③将上清液转移到另一新的 1.5 mL离心管中,
加入 3 μL的 DNase I, 37℃水浴 1 h。④再加入等体
积的氯仿和异戊醇(24∶1)涡旋振荡 1 min, 混匀 ,
4℃, 13 000×g离心 15 min。⑤将上清液转移到另一
新的 1.5 mL 离心管中, 加入 1/3 体积的 8 mol L−1
LiCl, 使其终浓度为 2 mol L−1, 4℃过夜沉淀。⑥ 4℃,
13 000×g离心 20 min, 弃上清液后, 分别用 400 μL
70%乙醇、100%无水乙醇洗沉淀, 吹干, 加 20 μL
DEPC-H2O 溶解 RNA, 然后通过琼脂糖凝胶电泳和
分光光度计检测 RNA 的质量和浓度, –70℃保存待
用。
以 5 μg RNA为模板、以 Oligo(dT)为引物, 按
照 TaKaRa PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis
Kit描述的方法, 合成 cDNA。
1.3 目的基因扩增
依据 NCBI 上登录的 AhFAD2 基因的核苷酸序
第 3期 周丽侠等: 花生 AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性 417


列设计并合成扩增该基因的特异引物 , FAD-F 为
5-ATGGGAGCTGGAGGGCGTGTCA-3和 FAD-R
为 5-TCAGAACTTGTTCTTGTACC-3。应用 20 μL
PCR 体系, 以幼叶 cDNA 为模板, 扩增该基因。反
应体系还包含 10 μL 2×TransHifi SuperMix II, 100
nmol L−1引物各 0.5 μL。反应条件为 94℃预变性 5
min; 94℃, 30 s; 52℃, 30 s; 72℃, 1 min, 反应 35个
循环; 72℃延伸 10 min; 4℃保存。
1.4 PCR产物的克隆、测序
从琼脂糖凝胶电泳胶上回收预期大小的 PCR条
带, 并连接于 pEASY-T3 克隆载体上。以连接产物
转化大肠杆菌 DH5α, 在含 Amp、IPTG 和 X-gal 的
LB平板上培养, 选择白色菌落提取质粒。经 EcoR I
酶切鉴定后, 由本单位测序室用 ABI3730 测序仪双
向测序。
1.5 序列分析
应用 DNAStar (Lasergene5.01)对核苷酸序列进
行拼接, 在 NCBI网站上进行 Blast同源性检索分析
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast), 用 BioXM 软件
寻找并翻译开放阅读框, 应用 ClustalX 软件进行多
序列比对, 用 MEGA4.1软件进行聚类分析。
1.6 花生种子脂肪酸组分的分析
从台山珍珠、台山三粒肉、临桂麻壳、飞龙乡、
江田种、勾了种、Chico、05-21063、鲁花 11 和鲁
花 14这 10个花生品种中各取 10粒花生种子提取油
脂 , 根据 Sukhija 等 [20]改进的一步法 , 用装有
HP-INNOWAX聚乙二醇毛细管柱(30 m × 320 μm ×
0.5 μm, Agilent Technologies)的气相色谱分析仪(HP-
6890, Aglient Technologies, Wilmington, DE)测定花
生脂肪酸的组分 , 每个品种测 3 个重复, 并计算出
各品种的 O/L比值。花育 19、花育 23和白沙 1016
的 O/L比值参考禹山林等[21]发表的数据。
2 结果与分析
2.1 AhFAD2基因编码区有效序列的确定
用特异性引物 FAD-F和 FAD-R从鲁花 14等 13
个花生品种幼叶 cDNA 中扩增 AhFAD2 基因, 应用
DNAStar 软件(Lasergene5.01)对核苷酸序列进行拼
接, 将拼接后的序列进行 Blast 同源性检索, 共得到
441个有效序列(表 1)。
2.2 AhFAD2基因转录本的分类及差异分析
参试品种的 AhFAD2基因转录本均存在两类情
况, 一类含 1 140 bp的 ORF, 编码 379个氨基酸组
成的完整蛋白; 另一类长 1 147 bp或 1 121 bp, 由
于转录本中第 451个碱基处由 G突变为 T (G451T),
形成 TAA终止子或由于在 674~680 bp之间 7 bp的
片段插入, 导致移码, 形成 TGA终止子, 使得蛋白
翻译提前终止 , 从而不能编码完整蛋白 , 为假基
因。
多序列比对和聚类分析结果表明, 在这 13个花
生品种中该基因皆存在 3类转录本, 即 AhFAD2A基
因 , AhFAD2B基因和假基因(图 1)。

表 1 13个花生品种 AhFAD2基因编码区测序情况统计
Table 1 Statistical analysis on sequencing of the coding region of AhFAD2 gene in 13 different peanut varieties
品种
Variety
类型
Type
实际测序序列数
Number sequenced
有效序列数
Valid sequences number
台山三粒肉 Taishansanlirou 多粒型 fastifgiata 34 28
05-21063 多粒型 fastifgiata 45 35
临桂麻壳 Linguimake 龙生型 hirsuta 58 50
飞龙乡 Feilongxiang 龙生型 hirsuta 32 29
江田种 Jiangtian 普通型 hypogaea 67 61
勾了种 Goule 普通型 hypogaea 25 25
鲁花 11 Luhua 11 普通型 hypogaea 39 31
鲁花 14 Luhua 14 普通型 hypogaea 55 46
花育 19 Huayu 19 普通型 hypogaea 44 33
台山珍珠 Taishanzhenzhu 珍珠豆型 vulgaris 22 19
Chico 珍珠豆型 vulgaris 30 20
花育 23 Huayu 23 珍珠豆型 vulgaris 30 19
白沙 1016 Baisha 1016 珍珠豆型 vulgaris 46 45
合计 Total 527 441
418 作 物 学 报 第 37卷


图 1 13个花生品种中 AhFAD2基因的聚类分析
Fig. 1 Phylogentic analysis of AhFAD2 mRNA transcripts in 13 different peanut varieties
A: 以花育 19为例, AhFAD2基因的 3类转录本为 AhFAD2A、AhFAD2B和假基因; B: 13个花生品种代表性核苷酸聚类分析结果, 均存
在 3类转录本, 即 AhFAD2A、AhFAD2B和假基因。
A: three kinds of mRNA transcripts of AhFAD2 in Huayu19; B: three kinds of mRNA transcripts of AhFAD2 in representative nucleotide of
the 13 peanut varieties.

AhFAD2A 和 AhFAD2B 基因的 ORF 大小相同,
都编码 379 个氨基酸组成的蛋白。AhFAD2A 和
AhFAD2B的序列很相似, 在ORF区有 99%的同一性,
只存在 10个或 11个碱基差异(表 2), 其中有 3个或
4个碱基变化造成编码的氨基酸不同(图 2)。此结果
与 Jung等[10]所述一致。
假基因与 AhFAD2A 和 AhFAD2B 在核苷酸序列
的组成上有近 98.3%的同一性。其差异主要因为假
基因在 674~680 bp之间均含有 7 bp的插入片段。台
山珍珠、台山三粒肉、Chico和白沙 1016四个品种的

表 2 AhFAD2A和 AhFAD2B的 ORF区的碱基差异
Table 2 Nucleotide differences between AhFAD2A and AhFAD2B in the ORF region
碱基位置及其相应碱基类型 Nucleotide site and its type 基因
Gene 150 172 282 432 448 465 528 534 728 1046 1112
AhFAD2A C G T C A A C C C T A
AhFAD2B A A C A G G T T T G C
斜体字母表示该位置碱基差异导致编码氨基酸不同。
The italic letters present the amino acid changes resulting from nucleotide differences.
第 3期 周丽侠等: 花生 AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性 419



图 2 AhFAD2A和 AhFAD2B的 ORF区编码的氨基酸差异
Fig. 2 Amino acid differences between AhFAD2A and AhFAD2B in the ORF region
此图是应用 ClustalX软件分析后的截图。依次为 AhFAD2A和 AhFAD2B编码的第 58、第 150、第 347、第 369个氨基酸差异。除第
150个氨基酸处阴影部分表示个别品种 AhFAD2A 编码的氨基酸外, 其余阴影部分均表示 AhFAD2B编码的氨基酸。
The figure is a section of the analysis by the ClustalX software, showing the amino acid differences between AhFAD2A and AhFAD2B at
position 58, 150, 347, 369. All of the shaded parts showed the amino acids encoded by AhFAD2B except the amino acid at position 150.

假基因核苷酸序列除含有一个 7 bp 的插入片段外,
在 853~878 bp之间还有一个长 26 bp的缺失片段(图
3)。此外, 与 AhFAD2A 核苷酸序列相比, 核苷酸序
列间存在 24个或 25个碱基差异, 其中在编码区有 6
或 7个碱基变化造成编码的氨基酸变化 ; 与
AhFAD2B核苷酸序列相比, 核苷酸序列间存在 22个
碱基差异, 在编码区有 5 个碱基变化造成编码的
氨基酸变化。

图 3 假基因中 674~680 bp之间的插入片段和 853~878 bp之间的缺失片段(此图是应用 ClustalX软件分析后的截图)
Fig. 3 Nucleotides insertion and deletion among 674–680 bp and 853–878 bp in pseudogene (the figure is a section of the analysis by
the ClustalX software)
A: 674~680 bp之间 7 bp的插入片段; B: 853~878 bp之间 26 bp的缺失片段。
A: 7 bp fragments insertion between 674–680 bp; B: 26 bp fragments deletion among 853–878 bp.

2.3 AhFAD2A 和 AhFAD2B 在不同品种中的多
态性
在临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、花育 14、花育
19、花育 23花生品种中, AhFAD2A开放读码框的第
448个碱基处的G突变为A (G448A), 导致相应氨基
酸由天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N, D150N)(图 4)。
除 G448A 点突变外, 大多数花生品种的 AhFAD2A
基因编码区的其他位置也存在多态性, 共检测到 8
个多态性位点, 其中, 在第 40、第 172、第 937、第
1024、第 1054个碱基处属于转换, 第 970、第 1046、
第 1112个碱基处属于颠换(表 3)。而且在第 40、第
172、第 1046、第 1112个碱基处的碱基差异导致相
420 作 物 学 报 第 37卷

应氨基酸变化, 分别由赖氨酸突变为谷氨酸、缬氨
酸突变为蛋氨酸、苯丙氨酸突变为缬氨酸、赖氨酸
突变为谷氨酰胺; 其他位置的碱基差异, 并没有产
生氨基酸的变化。而 AhFAD2B基因相对保守, 所测
13个花生品种的核苷酸序列没有差异。
2.4 花生脂肪酸组分的测定结果
所测 10个品种总脂肪酸含量占种子总重量的
50.0%~56.1%, 其中油酸含量占总脂肪酸含量的
38.5%~51.9%, 油酸含量为鲁花 11>勾了种>鲁花
14>临桂麻壳>江田种>Chico>05-21063>飞龙乡>台
山珍珠>台山三粒肉; 亚油酸含量占总脂肪酸含量
的 26.7%~38.5%, 亚油酸含量由高到低的排列次序
大致与油酸含量相反。临桂麻壳、勾了种、鲁花 11、
鲁花 14、花育 19、花育 23这些品种籽粒的 O/L比
值大于 1.5, 同时, 这些品种的 AhFAD2A基因在 448
位点也存在 G→A点突变。然而, 也有例外, 飞龙乡
的 AhFAD2A 基因中虽然也存在 G448A 点突变, 但
其籽粒的 O/L比值较低(表 4)。

图 4 不同花生品种中的 AhFAD2A 基因 G448A突变及其相应氨基酸的突变
Fig. 4 G448A mutation of AhFAD2A gene and their corresponding amino acid changes in different peanut varieties
A: 在 448个碱基处 G突变为 A; B: 相应氨基酸在 150处由 D突变为 N。此图是应用 ClustalX软件分析后的截图。
A: mutation from G to A at position 448; B: the amino acid mutation of D150N. The figure is a section of the analysis by the ClustalX
software.

表 3 不同花生品种中 AhFAD2A基因的多态性位点
Table 3 Polymorphism sites of AhFAD2A in different peanut varieties
各碱基位置相应碱基类型及序列数
Nucleotide site and its corresponding type and numbers sequenced 品种
Variety
FAD2A有效序列数
Valid sequences num-
ber of FAD2A 40 172 937 970 1024 1046 1054 1112
台山三粒肉
Taishansanlirou
9 2G,7A 2A,7G 4G,5T 4C,5A
临桂麻壳
Linguimake
22 3G,19A 3A,19G 3A,19G 5T,17C 4G,18T 6G,16A 10C,12A
飞龙乡
Feilongxiang
16 4C,12A
江田种
Jiangtian
28 3A,25G
勾了种
Goule
9 2G,7A 2A,7G 2A,7T 2T,7C 2G.7A 2C,7A
05-21063 6 3A,3G 2A,4G 2A,4T 2T,4C 2G,4T 3C,3A
鲁花 14
Luhua 14
16 2A,14G
花育 19
Huayu 19
15 2C,13A
花育 23
Huayu 23
10 2C,8A
表中列出的是除 G448A之外的 AhFAD2A基因的多态性位点。斜体字母表示该位置碱基差异导致编码氨基酸不同。
The table above showed the other polymorphism sites of AhFAD2A except the G448A in some peanut varieties. The italic letters pre-
sent the amino acid changes resulting from nucleotide differences.


第 3期 周丽侠等: 花生 AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性 421


表 4 各品种 AhFAD2A基因 G448A位点突变与籽粒的 O/L比值关系
Table 4 Correlation between G448A point mutation of AhFAD2A and the O/L ratio in 13 peanut varieties
品种
Variety
FAD2A有效序列数
Valid sequences
number of FAD2A
G448A突变序列数
Sequence number of
G448A mutation
油酸
Oleic acid
(%)
亚油酸
Linoleic acid
(%)
O/L比值
O/L ratio
台山珍珠 Taishanzhenzhu 4 0 38.8 38.5 1.01
台山三粒肉 Taishansanlirou 9 0 38.5 38.2 1.01
临桂麻壳 Linguimake 22 22 47.5 31.4 1.50
飞龙乡 Feilongxiang 16 16 39.9 37.8 1.05
江田种 Jiangtian 28 0 42.3 38.5 1.10
勾了种 Goule 9 9 51.6 27.1 1.90
Chico 11 0 40.5 37.2 1.09
05-21063 6 0 40.1 38.5 1.04
鲁花 11 Luhua 11 17 4 51.9 26.7 1.95
鲁花 14 Luhua 14 16 16 48.5 30.9 1.57
花育 19 Huayu 19 15 15 – – 1.68
花育 23 Huayu 23 10 10 – – 1.54
白沙 1016 Baisha 1016 12 0 – – 1.04

3 讨论
3.1 O/L比值性状的遗传基础
AhFAD2 蛋白与其他膜结合脱氢酶一样具有 3
个极其保守的富含组氨酸结构域 [HECGHH]、
[HRRHH]和 [HVAHH], 并且与来自 Synechococcus
的亚油酸脱氢酶、环氧化酶及来自 Crepis的乙酰基
酶相同, 在第 2个组氨酸区后第 9个氨基酸处(即第
150个氨基酸 )均呈现保守的天冬氨酸[22]。Bruner
等[22]进一步通过特异位点突变改变第 150个氨基酸,
发现第 150 位的天冬氨酸非常重要 , 它位于
AhFAD2A脱氢酶的活性部位, D150N的突变, 导致
AhFAD2A脂肪酸脱氢酶酶活性降低或丧失。通过对
参试品种 cDNA 序列及其相应氨基酸序列的比对分
析, 在临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、花育 14、花育
19、花育 23 中 , AhFAD2A 存在一自发的点突变
(G448A), 导致相应氨基酸的改变(D150N), 推测这
些花生品种的 AhFAD2A 448 位碱基的变化可能造
成 AhFAD2A 脂肪酸脱氢酶活性降低或丧失。除
G448A 点突变外, 在个别品种中 AhFAD2A 基因的
其他位置也存在多态性, 其中第 40、172、1 046、
1 112个碱基处的碱基差异导致相应氨基酸变化, 这
些改变的氨基酸位于 AhFAD2蛋白序列的 3个组氨
酸保守区之外。目前尚未见有关它们引起酶结构、
活性或表达调控变化的相关报道。
Jung 等[16]对高油酸花生遗传分析表明, 高油酸
性状是由两个隐性非等位基因 ol1 和 ol2 共同控制
的。OL1编码具有活性的 AhFAD2A脱氢酶, OL2编
码 AhFAD2B 脱氢酶。ol1 是 AhFAD2A 的一个突变
等位基因, 它编码的酶活性比野生型低或没有活性;
ol2 是 AhFAD2B 的隐性等位基因。因而高油酸花生
的基因型应该是 ol1ol1ol2ol2, 常规油酸花生的纯合
子基因型是 OL1OL1OL2OL2。
结合各个品种 AhFAD2A 基因的 cDNA 有效序
列数和存在 G448A 点突变的序列数(表 4)可以确定,
台山珍珠、台山三粒肉、江田种、Chico、05-21063、
白沙 1016 的基因型是 OL1OL1OL2OL2, 因为在这
几个花生品种中 AhFAD2A 和 AhFAD2B 皆不存在基
因突变; 临桂麻壳、飞龙乡、勾了种、鲁花 14、花
育 19、花育 23 的基因型是 ol1ol1OL2OL2, 因为在
这些品种中, AhFAD2A 突变成为它的等位基因 ol1,
而 AhFAD2B 没有发生基因突变 ; 在鲁花 11 中,
AhFAD2A的 17个有效 cDNA序列中, 有 4个序列存
在 G448A点突变, 13个序列的第 448个碱基仍为 G,
表明 OL1 位点为杂合子即可能存在 OL1ol1 等位位
点。
3.2 AhFAD2基因的多态性与O/L比值之间的相
关性
花生高油酸品种 F435, 其籽粒油酸含量高达
80%, 亚油酸含量仅占 2%[23]。研究 F435和 F435衍
生的品种的遗传基础, 发现在 Δ12 脂肪酸脱氢酶基
因中含有两个关键的突变。一是 AhFAD2A 基因中存
在一自发的点突变(G448A), 导致相应氨基酸的改变
(D150N), 致使 AhFAD2A 脱氢酶功能降低或丧失[16];
422 作 物 学 报 第 37卷

二是 AhFAD2B 开放读码框第 441~442 个碱基间 1
个A碱基的插入导致 AhFAD2B翻译提前终止, 继而
导致AhFAD2B不能编码有活性的蛋白[24]。Patel等[25]
对 2个通过化学诱变培育的高油酸花生品种
Mycogen-Flavo(MF)和 M2-225 的分析发现, 它们的
AhFAD2A中也存在G448A突变; 同时MF和M2-225
分别在 AhFAD2B基因编码区的 656 bp和 998 bp处
插入了一个 205 bp 的微型反向重复转座元件
(miniature inverted-repeat transposable element,
MITE), 造成移码, 导致氨基酸编码提前终止。进一
步的研究表明 AhFAD2B基因中MITE的插入也与基
因的转录水平相关。也就是说, 在上述花生品种中,
AhFAD2A 的 G448A 突变和 AhFAD2B 突变 (因
441~442插入 A或 1个 MITE的插入)共同导致高油
酸基因型花生的产生。本研究的 13个花生品种中,
某些花生品种的 AhFAD2A 存在 G448A 突变, 造成
了 AhFAD2A 脂肪酸脱氢酶酶活性降低或丧失。但
AhFAD2B 基因非常保守, 所测 13 个花生品种该基
因的核苷酸序列没有差异。
结合这些花生品种的基因型和相应花生籽粒的
O/L比值(表 4)分析发现, AhFAD2A基因存在 G448A
点突变的花生品种籽粒的 O/L 比值相对提高, 提高
幅度平均为 35.9%。以往的研究发现在酵母体系中
花生 FAD2B 脱氢酶催化生成亚油酸的量约是
FAD2A 脱氢酶催化生成亚油酸量的 10 倍, FAD2A
脱氢酶的活性仅是 FAD2B 脱氢酶的 40%[16]。因此,
笔者推测 AhFAD2B 脱氢酶在催化油酸转变成为亚
油酸的过程中比AhFAD2A脱氢酶起更重要的作用。
但 AhFAD2A 基因 G448A 点突变并不能完全解释
O/L 比值相对提高这一现象。如龙生型品种临桂麻
壳和飞龙乡 AhFAD2A 基因均存在 G448A 点突变,
但相比普通型品种它们的 O/L 比值相对较低, 并且
两者间 O/L 比值相差较大。这两个品种 AhFAD2A
基因编码区还存在其他多个位点 SNP 差异, 是这些
差异导致了O/L比值差异或其调控区不同产生差异,
还需进一步的研究。
在多个品种 AhFAD2A 基因的 40、172、1 046
和 1 112 bp位置存在多态性, 并且这些碱基差异改
变了蛋白的氨基酸组成, 但这些多态性的存在是否
与花生籽粒的 O/L 比值相关, 还有待分析更多的材
料和进一步酶活实验研究证实。
3.3 假基因功能的相关探讨
假基因与有功能的基因在核苷酸顺序的组成
上非常相似。但由于缺失、倒位或点突变等原因, 使
其失活, 不能合成功能蛋白质。长期以来, 人们认
为假基因是貌似正常却没有功能的“死亡基因”, 是
基因组进化的“化石记录”[26]。但是目前的研究显示,
假基因并不是“垃圾基因”, 它在基因表达、基因调控
等方面可能扮演着重要角色, 但其确切的作用机制
仍不清楚。
本研究的 13 个花生种质中皆存在假基因。
Zucherkandl[27]曾描述过假基因的转录产物在体内
往往不能表达或仅仅在其功能基因发生特殊表达的
情况下才表达。而在这 13个花生品种中假基因的这
些转录产物是否表达, 或在功能基因发生特殊表达
的情况下是否表达, 尚待进一步研究。Healy 等[28]
曾证实假基因 Est-6 对功能基因表达的重要调控作
用。肖钢等[29]通过对甘蓝型油菜基因组中 FAD2 基
因的 6 个假基因拷贝在酿酒酵母中进行体内表达实
验, 证明其不具备油酸脱氢酶功能, 也没有改变酵
母体内脂肪酸组成。在本研究中, 假基因是否具有
调节功能还需进一步研究验证。
4 结论
在不同花生品种中 , AhFAD2 基因皆存在
AhFAD2A、AhFAD2B 和假基因三类转录本, 它们的
表达调控方式及编码蛋白的活性决定了花生籽粒油
酸含量和 O/L比值。AhFAD2A基因的若干位置存在
多态性, 其中在 448 位由 G→A 的点突变与花生籽
粒的 O/L 比值提高相关联; 与 AhFAD2A 基因相比,
AhFAD2B基因相对保守, 且其活性对 O/L比值的影
响更大; 假基因与 AhFAD2A和 AhFAD2B核苷酸序
列相似性很高 , 但是否具有基因表达调控功能, 有
待进一步研究。
References
[1] Wan S-B(万书波). Peanut Quality (花生品质学). Beijing: China
Agricultural Science and Technology Press, 2005. p 2 (in Chi-
nese)
[2] Moore K M, Knauft D A. The inheritance of the high oleic acid
in peanut. J Heredity, 1989, 80: 252−253
[3] Chu Y, Holbrook C C, Ozias-Akins P. Two alleles of ahFAD2B
control the the high oleic acid trait in cultivated peanut. Crop Sci,
2009, 49: 2029−2036
[4] Wan S-B(万书波). Peanut Cultivation in China (中国花生栽培
学). Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers,
2003. pp 1−10 (in Chinese)
[5] St Angelo A J, Ory R L. Investigations of causes and prevention
of fatty acid peroxidation in peanut butter. J Am Peanut Res Educ
第 3期 周丽侠等: 花生 AhFAD2基因的多态性及其与籽粒油酸/亚油酸比值间的相关性 423


Assoc, 1973, 5: 128−133
[6] Grundy S M. Comparison of monounsaturated fatty acids and
carbohydrates for lowering plasma cholesterol in man. New Eng
J Med, 1986, 314: 745−748
[7] Yu S L, Pan L J, Yang Q L, Min P, Ren Z K, Zhang H S. Com-
parison of the Δ12 fatty acid desaturase gene between high-oleic
and normal-oleic peanut genotypes. J Genet Genomics, 2008, 35:
679−685
[8] OKeefe S F, Wiley V A, Knauft D A. Comparison of oxidative
stability of high-and normal-oleic peanut oils. J Am Oil Chem
Soc, 1993, 70: 489
[9] Bolton G E, Sanders T H. Effect of roasting oil composition on
the stability of roasted high-oleic peanuts. J Am Oil Chem Soc,
2002, 79: 129−132
[10] Jung S, Swift D, Sengoku E, Patel M, Teule F, Powell G, Moore
K, Abbott A. The high oleate trait in the cultivated peanut (Ara-
chis hypogaea L.): I. Isolation and characterization of two genes
encoding microsomal oleoyl-PC desaturases. Mol Gen Genet,
2000, 263: 796−805
[11] Chong E W, Sinclair A J, Guymer R H. Facts on fats. Clin Exp
Ophthalmol, 2006, 34: 464−471
[12] Colomer R, Menendez J A. Mediterranean diet, olive oil, and
cancer. Clin Transl Oncol, 2006, 8: 15−21
[13] Mesa Garcia M D, Aguilera Garcia C M, Gil Hernandes A. Im-
portance of lipids in the nutritional treatment of inflammatory
diseases. Nutr Hosp, 2006, 21: 28−41
[14] Vassiliou E K, Gonzalez A, Garcia C, Tadros J H, Chakraborty G,
Toney J H. Oleic acid and peanut oil high in oleic acid reverse
the inhibitory effect of insulin production of the inflammatory
cytokine TNF-α both in vitro and in vivo system. Lipids Health
Disease, 2009, 8: 25
[15] Ray T K, Holly S P, Knauft D A, Abbott A G, Powell G L. The
primary defect in developing seed from the high oleate variety of
peanut (Arachis hypogaea L.) is the absence of Δ12-desaturase
activity. Plant Sci, 1993, 91: 15−21
[16] Jung S, Powell G, Moore K, Abbott A. The high oleate trait in the
cultivated peanut (Arachis hypogaea L.): II. Molecular basis and
genetics of the trait. Mol Gen Genet, 2000, 263: 806−811
[17] Chu Y, Ramos L, Holbrook C C, Ozias-Akins P. Frequency of a
loss-of-function mutation in oleoyl-PC desaturase (ahFAD2A) in
the mini-core of the U.S. peanut germplasm collection. Crop Sci,
2007, 47: 2372−2378
[18] Barkley N A, Chenault-Chamberli K D, Wang M L, Pittman R N.
Development of a real time PCR genotyping assay to identify
high oleic acid peanuts (Arachis hypogaea L.). Mol Breed, 2010,
25: 541−548
[19] Chen Z B, Wang M L, Barkley N A, Pittman R N. A simple al-
lele-specific PCR assay for detecting FAD2 alleles in both A and
B genomes of the cultivated peanut for high-oleate trait selection.
Plant Mol Biol Rep, 2010, 28: 542−548
[20] Sukhija P S, Palmquist D L. Rapid method for determination of
total fatty acid content and composition of feedstuffs and feces. J
Agric Food Chem, 1988, 36: 1202−1206
[21] Yu S-L(禹山林). The Varieties and Pedigree of Peanut in China
(中国花生品种及其系谱). Shanghai: Shanghai Scientific and
Technical Publisher, 2008. pp 290−611 (in Chinese)
[22] Bruner A C, Jung S, Abbott A G, Powell G L. The naturally oc-
curring high oleate oil character in some peanut varieties results
from reduced oleoyl-PC desaturase activity from mutation of as-
partate 150 to asparagine. Crop Sci, 2001, 41: 522–526
[23] Norden A J, Gorbet D W, Knauft D A, Young C T. Variability in
oil quality among peanut genotypes in the Florida breeding pro-
gram. Peanut Sci, 1987, 4: 7−11
[24] Lopez Y, Nadaf H L, Smith O D, Connell J P, Reddy A S, Fritz A
K. Isolation and characterization of the Δ12-fatty acid desaturase
in peanut (Arachis hypogaea L.) and search for polymorphisms
for the high oleate trait in spanish market-type lines. Theor Appl
Genet, 2000, 101: 1131−1138
[25] Patel M, Jung S, Moore K, Powell G, Ainsworth C, Abbott A.
High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into the
FAD2 gene. Theor Appl Genet, 2004, 108: 1492−1502
[26] Harrison P M, Hegyi H, Balasubramanian S, Luscombe N M,
Bertone P, Echols N, Johnson T, Gerstein M. Molecular fossils in
the human genome: identification and analysis of the pseu-
dogenes in chromosomes 21 and 22. Genome Res, 2002, 12:
272−280
[27] Zucherkandl E. Why so many noncoding nucleotides ? The eu-
karyote genomes as an epigenetic machine. Genetica, 2002, 115:
105−129
[28] Wu H(吴浩), Cao M-F(曹明富). Pseudogene. Bull Biol (生物学
通报), 2005, 40(5): 20 (in Chinese)
[29] Xiao G(肖钢), Zhang Z-Q(张振乾), Wu X-M(邬贤梦), Tan
T-L(谭太龙), Guan C-Y(官春云). Cloning and characterization
of six oleic acid desaturase pseudogenes of Brassica napus. Acta
Agron Sin (作物学报), 2010, 36(3): 435−441 (in Chinese with
English abstract)