全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(7): 1304−1310 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA101107-3)和湖南农业大学作物学开发基金资助项目(ZWKF201303)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding author): 熊兴华, E-mail: ndxiongene@yahoo.com, Tel: 13508487613
第一作者联系方式: E-mail: 787600117@qq.com
Received(收稿日期): 2013-11-16; Accepted(接受日期): 2014-04-16; Published online(网络出版日期): 2014-05-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140516.1003.024.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01304
甘蓝型油菜 2个 GPAT6同源基因的克隆与表达分析
刘 聪 1 肖旦望 1 胡学芳 1 邬克彬 1 官春云 1,2 熊兴华 1,2,*
1 湖南农业大学作物基因工程湖南省重点实验室, 湖南长沙 410128; 2 湖南农业大学油料作物研究所, 湖南长沙 410128
摘 要: 甘油-3-磷酸酰基转移酶(sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是三酰甘油生物合成的关键酶, 催化三
酰甘油合成的起始步骤, 在植物中参与调节生长发育、脂质的合成和逆境应答等过程。本试验通过 RT-PCR从甘蓝型油
菜品种湘油 15中克隆得到 GPAT6基因的 2个拷贝, 分别命名为 BnGPAT6-1 (GenBank登录号为 KJ000117)和 BnGPAT6-2
(KC106728)。它们的编码区序列(coding DNA sequence, CDS)均为 1506 bp, 编码 501个氨基酸。预测其蛋白结构 N端含
有一个类卤酸脱卤酶(haloacid dehalogenase-like hydrolase, HAD-like)活性结构域, C端含有一个溶血磷脂酰基转移酶
(lysophospholipid acyltransferase, LPLAT)功能域。蛋白序列比对和进化树分析表明, 甘蓝型油菜与白菜(B. rapa)、甘蓝(B.
oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和琴叶拟南芥(A. lyrata)中的 GPAT6 序列相似性最高。组织表达结果表明
BnGPAT6 基因在花中的表达量最高, 在未成熟的胚中表达量呈先升高后降低的趋势。BnGPAT6 的表达受 ABA 的抑制;
在干旱和 6-BA胁迫下几乎同时升高; 在盐胁迫下,短时间内升高, 达到峰值后降低; 在水渍条件下没有明显变化。
关键词: 甘蓝型油菜; 甘油-3-磷酸酰基转移酶; 基因克隆; 表达分析; 逆境胁迫
Cloning and Expression Analysis of Two Homologous Genes Coding
sn-Glycerol-3-Phosphate Acyltransferase 6 in Brassica napus
LIU Cong1, XIAO Dan-Wang1, HU Xue-Fang1, WU Ke-Bin1, GUAN Chun-Yun1,2, and XIONG Xing-Hua1,2,*
1 Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Oilseed Crops Institute,
Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: A key enzyme sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT) catalyzes the initial step of TAG biosynthetic pathway,
and is involved in many processes including plant growth, development and response to abiotic stresses. In this study, two B.
napus GPAT6 homologs were cloned from the leaf of the cultivar xiangyou 15 using RT-PCR, and designated as BnGPAT6-1 and
BnGPAT6-2, respectively. The coding DNA sequences (CDS) of two BnGPAT6 genes are 1506 bp in length, encoding two differ-
ent polypeptides of 501 amino acid residues. The proteins were predicted to consist of a haloacid dehalogenase-like hydrolase
domain and a lysophospholipid acyltransferase domain. Multiple sequence alignments and phylogenetic analysis of GPAT proteins
showed that BnGPAT6-1 and BnGPAT6-2 share high similarity with GPAT6 proteins from B. rapa, B. oleracea, Arabidopsis
thaliana, and A. lyrata. Tissue expression amounts of BnGPAT6 genes showed that their mRNA were more abundant in flower
than the other organs, and the patterns rise up at first and then down in the developing embryo. The expression of BnGPAT6 genes
are inhibited by ABA, while go up simultaneously under drought and 6-BA conditions. In the treatment of salt, the expression of
BnGPAT6 genes are uptrend in a short time and then down, and there is not obvious change under stress of water logging.
Keywords: Brassica napus; sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase; Gene cloning; Expression analysis; Abiotic stresses
GPAT是三酰甘油(triacylglycerol, TAG)生物合成的限
速酶[1], 催化 TAG生物合成的起始步骤。目前拟南芥中已
经发现 10 个 GPAT 基因家族成员[2], 分别命名为 ATS1、
AtGPAT1、AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT5、
AtGPAT6、AtGPAT7、AtGPAT8 和 AtGPAT9。根据亚细胞
定位可分为 3 类, 分别为质体 GPAT (ATS1)[3]、线粒体
GPAT (AtGPAT1/2/3)[4] 和 内 质 网 GPAT (AtGPAT4/5/6/
7/8/9)[2,5]。GPAT主要将酰基从 acyl-ACP或 acyl-CoA (定
位于质体的 GPAT 酶以 acyl-ACP 为酰基供体, 定位于内
质网和线粒体的 GPAT 以 acyl-CoA 为酰基供体)[6]转移到
第 7期 刘 聪等: 甘蓝型油菜 2个 GPAT6同源基因的克隆与表达分析 1305


G-3-P 的 sn-1 位置上形成溶血磷脂酸(lysophosphatidic
acid, LPA)[6-8]。陆生植物特异性 GPAT(EC2.3.1.198)具有
sn-2 酰基转移酶活性, 他们能将酰基转移到甘油-3-磷酸
的 sn-2 位上, 形成 sn-2 单酰甘油(sn-2-monoacylglycerol,
sn-2 MAG)[4,9]。溶血磷脂酸和 acyl-CoA在溶血磷脂酸酰
基转移酶的作用下形成磷脂酸(phosphatidic acid, PA)[10]。
在磷脂酸磷酸酶的作用下, PA 脱去磷酸基团形成二酰甘
油 (diacylglycerol, DAG), 经 二 酰 甘 油 酰 基 转 移 酶
(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)的催化作用产生
TAG[11]。
TAG 是植物种子储存脂的主要成分, 提高种子 TAG
含量很大程度上就意味着种子含油量的提高。Jain 等[12]
将红花质体 GPAT 基因(CtpGPAT)转入拟南芥中超表达,
使其种子含油量提高了 15%。此外, Gidda 等[5]对拟南芥
AtGPAT9 编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 推测
其与拟南芥种子含油量有关。
软木脂和几丁质是植物体中 2种重要的聚酯, 它们构
成植物阻止病原体入侵的防护栏 , 并控制水分和溶质的
运输。Li等[13]发现, 拟南芥 gpat5突变体的幼根中软木脂
的含量下降 50%, 种皮中软木脂含量成倍减少, 导致渗透
性增强, 种子萌发和幼苗成活率显著降低。几丁质合成相
关的 GPAT 基 因 在 拟 南 芥 (AtGPAT4, AtGPAT6, At-
GAPT8)[4-5,9,14-15] 、 甘 蓝 型 油 菜 (BnGPAT4)[16] 和 蓝 蓟
(Echium vulgare)(EpGPAT1, EpGPAT2)[17]等植物中被克
隆。拟南芥 atgpat4/8 双突变体的茎和叶中表现出明显的
几丁质缺陷[13], atgpat6 突变体的花瓣表现出几丁质缺陷,
并且花的各组成结构相互融合, 花无法开放[18]。甘蓝型油
菜 BnGPAT4 干扰系叶片角质层有明显几丁质缺陷, 气孔
不能正常关闭, 使植株长期处于高蒸腾作用状态, 容易失
水[16]。
研究表明低温敏感型植物的质体 GPAT 酶具有棕榈
酰 -ACP(C16:1-ACP)底物偏好性 , 而耐低温植物质体
GPAT 酶的底物以油酰-ACP 为主[19-22]。磷脂是生物膜的
主要成分 , 根据主链结构分为磷酸甘油脂 (phospho-
glycerides, PG)和鞘磷脂(sphingomyelin, SM)。PG饱和度
的改变影响类囊体膜脂和膜蛋白接界面的动力学活性[23],
而质体 GPAT酶的底物选择性能改变类囊体膜 PG的饱和
度。抗低温能力强的植物如拟南芥 [3]、菠菜 (Spinacia
oleracea)[19,24]、豌豆(Pisum sativum)[24-25]等质体 GPAT酶
对顺 9-十八碳烯酸(油酸)的亲和力比较强[26]。抗低温能力
弱的植物如南瓜(Cucurbita moschata)质体 GPAT酶偏好于
饱和脂肪酸[19]。Yan等[27]将甜椒的 GPAT基因转入烟草中
超表达, 转基因烟草在高温下, 其类囊体膜上单半乳糖基
二脂酰甘油(monogalactosyl-diacylglycerol, MGDG)、硫代
异鼠李糖甘油二酯(sulfoquinovosyl-diacylglycerol, SQDG)、
二半乳糖基甘油二酯(digalactosyl-diacylglycerol, DGDG)和
PG的饱和程度普遍增加, 对高温压力的抗性增强。
油菜在我国具有悠久的栽培历史。目前我国面临对食
用油需求的日益增加和全球气候变化而带来的干旱、盐碱
地面积扩大等问题, 如何提高油菜的抗逆性对提高我国油
菜单产具有重要意义。研究表明甘油-3-磷酸酰基转移酶家
族与作物的育性[14,28]、种子含油量[12]和抗逆性[13,16,21,23,27]相
关。其中拟南芥 AtGPAT6 与结实率有关。在花药发育阶
段 , 拟南芥 AtGPAT6 在绒毡层和小孢子中大量表达 ,
atgpat6 突变体绒毡层的内质网数量减少, 花粉壁发育缺
陷, 花粉萌发和花粉管的伸长受阻, 导致结实率降低[14]。
本文通过 RT-PCR 法从甘蓝型油菜湘油 15 中克隆油菜的
GPAT6 基因 BnGPAT6-1 和 BnGPAT6-2, 并利用逆境胁迫
和半定量RT-PCR研究 BnGPAT6基因的表达, 为揭示油菜
BnGPAT6 基因的功能和利用抗逆境候选基因进行油菜的
分子育种提供基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
湘油 15由国家油料改良中心湖南分中心提供 ,
TransGen生物技术有限公司TRIzol RNA提取试剂盒与
EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒、
TransTaq DNA Polymerase High Fidelity DNA聚合酶套装
以及10 mmol L–1 dNTPs, Solarbio科技有限公司的DNaseI、
PEG4000、ABA、6-BA和NaCl, TaKaRa生物有限公司的
pMD18-T载体。
1.2 甘蓝型油菜总 RNA提取
用TransGen TRIzol RNA提取试剂盒参照其说明书提
取油菜组织的总RNA。
1.3 cDNA第一链的合成
RNA经 DNaseI处理后 , 用 EasyScript First-Strand
cDNA Synthesis SuperMix试剂盒参照其说明书合成第一
链cDNA。
1.4 GPAT6基因 CDS全长序列的克隆与序列分析
挑取饱满的种子播种于1/2MS培养基中, 在22℃的组
织培养室中萌发。当油菜长出2片真叶时 , 提取叶片总
RNA, 经DNase酶消化后, 反转录合成第一链cDNA。
用拟南芥AtGPAT6基因在甘蓝型油菜EST数据库中找
到6条EST序列(ES913056.1、ES913056.1、CX190605.1、
CX190597.1、CD833550.1和CX191564.1), 其中ES913056.1、
ES913056.1、与拟南芥AtGPAT6基因的5′-端序列相似性很
高, CX190605.1、CX190597.1、CD833550.1、CX191564.1
与其3′-端序列匹配值很高。因此, 根据这6条EST序列设计
出2条上游引物F1: 5′-TCTTCTTGTCTGATGGGGGCTC-3′、
F2: 5′-CTCGAGGATGGGGTCTCAGGAG-3′和4条下游引
物R1: 5′-TCATAGAAGACAAAAGAAACAAAC-3′、R2:
5′-GCCAAAAGAGAAATATTCAAAAGG-3′、R3: 5′-TTGA
AAATATCACGAAAAAACTTGC-3′和R4: 5′-AGCCAAAA
GAAAAATATTCAAATG-3′。以第一链cDNA为模板, 2条
上游引物分别与4条下游引物配对进行PCR扩增。PCR体
系10 μL含 5 U μL–1 DNA聚合酶0.2 μL、10 mmol L–1
1306 作 物 学 报 第 40卷


dNTPs 0.2 μL、10×PCR缓冲液1 μL、50 ng μL–1模板1 μL、
2 μmol L–1正反引物各1 μL、ddH2O 5.6 μL。PCR程序为
95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 54℃复性30 s, 共35个循
环; 72℃延伸90 s, 72 ℃保温8 min, 16℃恒温。PCR产物经
1.0%琼脂糖凝胶电泳 , 用凝胶成像系统(Bio-Rad)检测和
记录结果。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接, 转化
大肠杆菌感受态细胞, 筛选阳性克隆送华大基因测序。用
MEGA5.0对白菜、甘蓝和甘蓝型油菜GPAT6基因的全长
CDS序列进行序列比对和聚类分析。
1.5 BnGPAT6基因编码的蛋白生物信息学分析
用ANHERO对BnGPAT6-1和BnGPAT6-2基因编码氨
基酸序列的物理性质和蛋白质跨膜区结构进行分析; 用
SoftBerry的ProtComp 9.0、pSORT和Predotar进行亚细胞定
位 分 析 ; 应 用 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/)进行信号肽分析; 通过美国国立生物技术信息中
心网站(NCBI)对BnGPAT6-1和BnGPAT6-2基因编码的蛋白
质进行保守性功能域预测; 应用BlastP (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/)和Phytozome (http://www.phytozome.net/)进行蛋
白质序列比对; 用MEGA5.0作蛋白质序列相似性比较和
进化树分析。
1.6 组织特异性表达分析
分别提取种植于田间的湘油 15开花期植株的根、茎、
叶、花以及开花后 1周、2周、3周的胚和果荚的总 RNA,
进行半定量 RT-PCR 分析。以甘蓝型油菜 ACTIN2.1
(FJ529167.1)基因为内参, 上游引物为 ACTINFW: 5′-CG
AGCAGGAGATGGAGACT-3′, 下游引物为 ACTINRV:
5′-GCTGAGGGAAGCAAGAATG-3′; 根据 BnGPAT6-1 和
BnGPAT6-2基因以及白菜(Bra005137、Bra017137)和甘蓝
(Bol017760、Bol025280) GPAT6 基因 CDS的相同序列设
计 RT-PCR引物, 上游引物为 G6-GYFW: 5′-TGCCACGTA
CAAAATGCGAA-3′下游引物为 G6-GYRV: 5′-ACCCT
ACCGTCAGTGCCAGC-3′进行半定量 PCR, 检测甘蓝型
油菜 GPAT6-1 和 BnGPAT6-2 基因组织表达总量的特征。
PCR体系 10 μL含 5 U μL–1 DNA聚合酶 0.2 μL、10 mmol
L–1 dNTPs 0.2 μL、10×PCR缓冲液 1 μL、50 ng μL–1模板
1 μL、2 μmol L–1上下游引物各 1 μL、ddH2O 5.6 μL。PCR
程序为 95℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 58℃复性 30 s,
共 28 个循环(内参 25 个循环); 72℃延伸 40 s, 72℃保温
8 min, 16℃恒温。PCR产物经 2%琼脂糖凝胶电泳。
1.7 胁迫表达分析
将油菜种于育苗盆中, 待长出 4~5 片真叶时用于处
理。分别提取经处理 0、3、6、12 和 24 h后油菜叶的 RNA
进行半定量 RT-PCR分析。PCR引物、体系和程序及电泳
同 1.6。参照文献[29-32] 处理方法, 略有改变。水渍处理是
将育苗钵浸泡至清水中, 水面淹没油菜根部; 干旱胁迫是
用 20% PEG-4000溶液喷洒油菜叶面浇灌根部; 盐胁迫是
以 300 mmol L–1 NaCl 溶液喷洒叶面和浇灌根部; 植物
生长调节剂处理是分别以 0.1 mg L–1 6-BA 和 3 mg L–1
ABA溶液喷洒叶面和浇灌根部。每株叶面喷洒量为 2 mL,
根部浇灌量即将育苗钵中土壤浇透, 约每钵 50 mL。
2 结果与分析
2.1 GPAT6基因全长 CDS序列的克隆
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RT-PCR 扩增产物显示,
引物对 BnGPAT6FW1/BnGPAT6RV1 与 BnGPAT6FW2/
BnGPATRV3 扩增出目的条带(图 1)。将 PCR 产物回收后
与 T-vector 连接, 转化大肠杆菌感受态细胞, 筛选阳性克
隆进行测序。序列分析结果表明, 克隆到 2 个含 1506 bp
的 BnGPAT6基因全长CDS序列 BnGPAT6-1和 BnGPAT6-2,
其核苷酸序列与拟南芥 AtGPAT6 (NM_129367.3)基因的
相似度分别为 84.7%和 85.3%, BnGPAT6-1 与 BnGPAT6-2
之间的相似度达到 89.1%。
2.2 GPAT6基因序列比对与聚类分析
用 MEGA5.0 对白菜(Bra005137、Bra017137)、甘蓝
(Bol017760、Bol025280)和甘蓝型油菜的 GPAT6基因全长
CDS序列进行聚类分析(图 2), 发现这 6个序列分为 2组。
BnGPAT6-1、Bra005137 和 Bol017760 归为一组(X 组),
BnGPAT6-2、Bra017137和 Bol025280归为一组(Y组)。序
列比对结果表明, 2 组序列之间存在不同的单体型, 共包
含 124 个 SNP, X 组的单体型为: 5′-CGTTCTCTCCTTAA
CTCAGTTATTGGCATACCTGATATGCATTAGTCGCCTC
TGAAGATGATCTATTACCTATCGGTAAATTCACTCATG
CTGGTCCAGCCCTTCCCATTACTGGAGATCTAAA-3′,
Y组的单体型为: 5′-GCACTGTCTGCCGCTCTGACCGCA
ATTCAGTGCATGGGTTGAAGACGTTACTCAGTACATG

图 1 油菜 BnGPAT6基因扩增产物
Fig. 1 RT-PCR products of BnGPAT6 genes
M: marker; 1~8: 引物对 F1/R1、F1/R2、F1/R3、F1/R4、F2/R1、
F2/R2、F2/R3、F2/R4的 PCR产物。
M: marker; 1–8: PCR product of primer pairs F1/R1, F1/R2, F1/R3,
F1/R4, F2/R1, F2/R2, F2/R3, F2/R4.

图 2 白菜、甘蓝和甘蓝型油菜 GPAT6基因编码区核苷酸序列
聚类分析(MEGA5.0)
Fig. 2 Phylogenetic analysis of GPAT6 genes CDS from
Brassica rapa, B. oleracea, and B. napus
Bra005137和 Bra017137来自白菜, Bol017760和 Bol025280来自
甘蓝。
Bra005137 and Bra017137 from B. rapa, Bol017760 and
Bol025280 from B. oleracea.
第 7期 刘 聪等: 甘蓝型油菜 2个 GPAT6同源基因的克隆与表达分析 1307


ATCGCCGTGCCCAAACCCCCCTCGCAGGATCTTCTAC
CTTTCGTTGGCCGGGATGACCTCGGG-3′。
2.3 BnGPAT6基因编码的蛋白生物信息学分析
BnGPAT6 基因编码 501 个氨基酸, 其中 BnGPAT6-1
相对分子质量为 56.04 kD, 等电点为 9.865, BnGPAT6-4蛋
白的相对分子质量为 5 5 . 8 6 , 等电点为 9 . 8 5 5。用
ANTHEPROT 预测发现, BnGPAT6-1 和 BnGPAT6-2 蛋白
均有 3个跨膜结构, 推测 BnGPAT6-1与 BnGPAT6-2为跨
膜类蛋白。亚细胞定位预测结果显示 , BnGPAT6-1 和
BnGPAT6-2 最有可能定位于原生质体膜。SignalP 预测结
果显示, BnGPAT6-1和 BnGPAT6-2都没有信号肽。保守结
构域预测发现, BnGPAT6-1与 BnGPAT6-2基因均编码一个
双功能酶 , 其 N 端含有一个类卤酸脱卤酶 (haloacid
dehalogenase-like hydrolase, HAD-like)活性结构域, C端含
有一个溶血磷脂酰基转移酶结构域 (lysophospholipid
acyltransferase, LPLAT)(图 3)。

图 3 BnGPAT6蛋白保守结构域预测(根据 NCBI)
Fig. 3 Predicted functional domains of BnGPAT6s (from NCBI)

在 NCBI 中对 BnGPAT6 基因编码的蛋白全序列进行
BlastP分析, 发现除了 2条分别来自拟南芥和琴叶拟南芥
的序列外, 还有多个物种的 GPAT6蛋白与 BnGPAT6-1和
BnGPAT6-2 有较高的相似性。BnGPAT6-1 和 BnGPAT6-2
与拟南芥和琴叶拟南芥 GPAT6序列的相似度均达到 92%,
与可可树(Theobroma cacao)、葡萄(Vitis vinifera)、大豆
(Glycine max)的相似度达到 80%, 与黄瓜 (Cucumis
sativus)、番茄 (Solanum lycopersicum)、鹰嘴豆 (Cicer
arietinum)、草莓(Fragaria vesca)的相似度达到 75%, 说明
GPAT6蛋白在进化中具有保守性。为了进一步研究 GPAT6
基因在不同物种中的进化关系, 用 MEGA5.0 及非加权平
均法, 对不同物种的 GPAT6 基因编码的蛋白序列及拟南
芥 GPAT 基因家族成员编码的蛋白序列构建系统进化树
(图 4)。结果表明, BnGPAT6-1和 BnGPAT6-2与白菜和甘
蓝的 GPAT6 关系最近, 其次与拟南芥 AtGPAT6 的关系最
近 , 并且与各物种的 GPAT6 蛋白序列的关系比拟南芥
GPAT家族其他成员的关系紧密。
2.4 BnGPAT6基因组织特异性表达分析
以湘油 15开花期的根、茎、叶、花以及开花后 1周、
2周、3周的胚和角果的 RNA反转录的 cDNA为模板, 以
ACTIN2.1 为内参基因 , 通过半定量 RT-PCR 进行
BnGPAT6 基因的组织特异性表达分析。电泳检测结果(图
5)表明, BnGPAT6 在根、茎、叶和果荚中表达较弱, 在花
中大量表达 , 在未成熟胚中其表达量呈先上升后下降的
趋势。
2.5 BnGPAT6基因逆境胁迫下的半定量RT-PCR表达分析
以未处理的同龄幼苗作对照, 进行半定量 RT-PCR。
电泳检测结果(图 6)表明, BnGPAT6 基因的转录水平在干
旱胁迫 12 h 表达转录水平开始上升, 24 h 后成倍增加;
6-BA 处理的表达状况与干旱处理基本一致。盐胁迫下转
录水平在短时间内急剧上升, 12~24 h内呈下降趋势。水渍
胁迫下 BnGPAT6基因的表达量基本不受影响。在经 ABA
处理的油菜幼苗中, BnGPAT6基因表达量有所下降。逆境
处理对照组的表达水平都比较弱 , 与组织特异性表达结
果(图 5)相符。
3 讨论
甘油-3-磷酸酰基转移酶作为TAG生物合成的关键酶,
不仅是Kennedy途径中的重要酶之一 , 而且参与植物膜
脂、几丁质和软木脂的生物合成, 因此, 对植物种子含油
量和逆境抗性有着不可忽视的影响。虽然在多种植物中发
现了GPAT酶 , 但在油菜中 , 只对BnGPAT4基因进行了比
较深入的研究 [16], 目前对油菜BnGPAT6基因的相关研究
尚为空白。
通过序列比对和聚类分析 (图2)发现 , BnGPAT6-1和
BnGPAT6-2基因与白菜和甘蓝GPAT6核苷酸序列的相似度
超过88%。BnGPAT6-1与白菜4号染色体和甘蓝4号染色体
上的GPAT6序列相似度超过99%, BnGPAT6-2与白菜5号染
色体及甘蓝2号染色体上的GPAT6基因的核苷酸序列一致
性超过98%, BnGPAT6-1与BnGPAT6-2 CDS序列的相似度为
89.6%, 2组序列中存在2个非常保守的单体型。结合序列比
对和聚类分析结果, 推测白菜和甘蓝中的2个GPAT6同源基
因均非常保守, 它们将GPAT6基因遗传给甘蓝型油菜, 并
在油菜的进化过程中非常保守。
Yang等[4,9]发现拟南芥AtGPAT4、AtGPAT6和AtGPAT8
基因编码的酶具有HAD-like结构域并证明其具有磷酸酶
活性。通过对BnGPAT6基因编码的蛋白进行预测发现 ,
BnGPAT6-1和BnGPAT6-2基因均编码一个双功能酶, N端
含有一个HAD-like活性结构域, C端含有一个LPLAT功能
域, 这与拟南芥AtGPAT4、AtGPAT6和AtGPAT8蛋白的结
构相符。从蛋白序列系统进化树分析 (图4)可以看出 ,
BnGPAT6-1和BnGPAT6-2与白菜、甘蓝和拟南芥的GPAT6

1308 作 物 学 报 第 40卷




图 4 不同物种 GPAT6及拟南芥 GPAT家族氨基酸序列的进化树分析(MEGA5.0)
Fig. 4 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of GPAT6 from different species and the others GPAT family
members from Arabidopsis thaliana (MEGA 5.0)


图 5 BnGPAT6基因在湘油 15不同器官中的表达
Fig. 5 Expression of BnGPAT6 gene in different organs of
Xiangyou 15
M: DNA分子标量; R、S、L、F: 根、茎、叶、花, E1、E2、E3:
开花后 1、2、3周的胚; C1、C2、C3: 开花后 1、2、3周的果荚。
M: DNA marker; R, S, L, and F: root, stem, leaf, and flower, re-
spectively; E1, E2, and E3: to 1-, 2-, 3-week after pollination em-
bryos respectively; C1, C2, and C3: 1-, 2-, 3-week after pollination
capsules, respectively.

非常紧密 , 与其他物种GPAT6蛋白的进化距离比与拟南
芥GPAT家族其他成员的近, 这表明GPAT6蛋白在进化中
具有较高的保守性 , 同时也证明我们克隆得到的基因为
GPAT6基因, 而非GPAT基因家族中的其他成员。
有研究表明拟南芥AtGPAT6在花中大量表达 [14,28],
在花瓣和萼片几丁质的生物合成中起决定性作用 [18], 并
与AtGPAT1共同影响拟南芥的结实率[14]。半定量RT-PCR
分析表明(图5), 甘蓝型油菜BnGPAT6基因在花中的表达
远远高于其他组织, 与拟南芥AtGPAT6基因表达一致; 在
未成熟的种子中表达量呈倒“V”形。据此推测油菜GPAT6
基因负责花中的几丁质合成, 并影响油菜的结实率, 对油
菜种子含油量的影响比较小。

图 6 BnGPAT6基因逆境表达的半定量 RT-PCR分析
Fig. 6 Semi-quantitative RT-PCR analysis of expression for
BnGPAT6 gene under stresses
第 7期 刘 聪等: 甘蓝型油菜 2个 GPAT6同源基因的克隆与表达分析 1309


在不同的非生物逆境处理中, 油菜叶片中 BnGPAT6
基因表达模式不同(图 6)。在干旱胁迫下, 12 h内 BnGPAT6
基因的表达量基本没有发生变化, 24 h后大量增加。这表
明油菜在缺水条件下, 通过提高 BnGPAT6 的表达量来应
对干旱。经 6-BA 处理 24 h 后, 油菜 BnGPAT6 基因的表
达量大量增加, 以应对细胞分裂加速。盐胁迫下, 油菜
BnGPAT6基因表达量在短时间内迅速提高, 12~24 h之间
开始降低, 表明随着胁迫时间的延长, 油菜逐渐适应高盐
环境。经水渍处理的油菜 BnGPAT6 基因的表达量基本没
有变化 , 这表明湘油 15 对水渍有一定的抗性 , 或者
BnGPAT6 与植物抗涝害无关。在 ABA 胁迫下, BnGPAT6
基因的表达量降低, 表明 ABA对 BnGPAT6基因的表达有
一定程度的抑制作用。有研究表明 [4-5,9,14-15], 拟南芥
AtGPAT4、AtGPAT6和 AtGPAT8基因均参与几丁质的合成。
AtGPAT4和AtGPAT8在茎和叶中大量表达, 负责茎和叶中
的几丁质合成[12]; AtGPAT6在花中大量表达, 在茎和叶中
表达量很低 [14,28]。油菜经 6-BA 处理后表达量大增, 经
ABA处理后表达量下降。因此, 推测油菜 GPAT6基因可能
参与茎和叶中的几丁质合成。在正常情况下 BnGPAT6 基因
进行本底水平表达, 当油菜细胞分裂突然加速表达急剧上
升以弥补GPAT4和GPAT8的不足, 当生长受到抑制时, 表达
水平下降。
从油菜 GPAT6 基因在上述逆境胁迫中的表达变化,
可以间接推测油菜叶中几丁质生物合成的变化 , 对研究
油菜抗逆性有着重要的意义。可以根据油菜对胁迫的反应,
进一步探索抗逆的生理代谢指标 , 以此来选择合适的抗
性品种以及适合的栽培条件, 为油菜的育种和生产服务。
此外 , 油菜是异源四倍体 , 其基因组中究竟有多少个
GPAT6拷贝, 各拷贝的表达是否有差异, 油菜GPAT6基因
是否参与营养组织中几丁质的合成还有待进一步的研究。
BnGPAT6 基因的克隆与表达分析不仅丰富了 GPAT 基因
家族的信息, 同时为进一步研究油菜 GPAT6 酶的功能与
耐逆境胁迫及产量之间的关系奠定了基础。
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