全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(10): 1711−1719 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31101174)项目, 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A10403), 江苏省自然科学基金项目
(BK2011679), 江苏省农业自主创新基金[cx(11)4012]和南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室开放基金(ZW2011006)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 浦惠明, E-mail: puhuiming@126.com, Tel: 025-84390370
第一作者联系方式: E-mail: humolon@163.com, Tel: 025-84390370
Received(收稿日期): 2013-02-26; Accepted(接受日期): 2013-05-25; Published online(网络出版日期): 2013-07-31.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130731.1819.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01711
油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因 BnALS1R等位基因特异 PCR标记的开
发与应用
胡茂龙 龙卫华 高建芹 付三雄 陈 锋 周晓婴 彭 琦
张 维 浦惠明* 戚存扣 张洁夫 陈 松
江苏省农业科学院经济作物研究所 / 国家油料作物改良中心南京分中心 / 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室, 江苏南京 210014
摘 要: 油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因 BnALS1R是从抗性突变体 M9中克隆获得, 抗性基因 BnALS1R与野生型基因
BnALS1存在 1处 SNP, 即乙酰乳酸合酶第 638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因 BnALS1R
的分子标记, 根据该处点突变, 结合获得的 BnALS3与 BnALS1序列, 开发 30条等位基因特异 PCR (allele-specific PCR,
AS-PCR)引物, 采用筛选出的 3 条 AS-PCR 引物在 F2、BC1和 BC2群体中进行 PCR 扩增。结果表明, 该标记有效检
测出群体中存在的 3种基因型, 其分离比分别为 1∶2∶1、1∶1、1∶1, 均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得
的抗性恢复系进行 PCR扩增, 结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因 BnALS1R目的条带, 表明 3条标记引物
可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。
关键词: 油菜; 咪唑啉酮类除草剂; BnALS1R; 乙酰乳酸合成酶; 等位基因特异 PCR
Development and Application of Allele-Specific PCR Markers for Imidazoli-
none-Resistant Gene BnALS1R in Brassica napus
HU Mao-Long, LONG Wei-Hua, GAO Jian-Qin, FU San-Xiong, CHEN Feng, ZHOU Xiao-Yin, PENG Qi,
ZHANG Wei, PU Hui-Ming*, QI Cun-Kou, ZHANG Jie-Fu, and CHEN Song
Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Nanjing Sub-center, National Center of Oil Crops Improvement / Key Labo-
ratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing), Ministry of Agriculture, Nanjing 210014, China
Abstract: A BnALS1R gene conferring resistance to the imidazolinone herbicides was previously isolated from an ALS (acetolac-
tate synthase) inhabiting herbicide-resistant mutant line M9 in Brassica napus. A single nucleotide polymorphism leading to an
amino acid substitution from serine to asparagine at site 638 of ALS was found between the BnALS1R in the mutant and BnALS1
in the wild type. We reported here the development of polymorphic molecular marker for allele-specific PCR (AS-PCR) assays to
distinguish herbicide-susceptible and resistant ALS alleles in either homozygous or heterozygous genotypes. Thirty primers were
designed according to the SNP (site 638, Ser was replaced by Asn) and the difference in DNA sequence between the BnALS1 and
BnALS3 cloned from M9 and other susceptible cultivars. Three primers of them with polymorphism were obtained, which can
differentiate the homozygous resistant M9 from susceptible rapeseed. Meanwhile, these PCR markers can effectively discriminate
among three genotypes using polymorphic primers and were evaluated in F2, BC1, and BC2 populations. Observed segregation
ratios fitted the expected 1:2:1, 1:1, and 1:1 ratios, respectively, which confirms the single-locus Mendel model. Furthermore, we
used the markers for detecting the resistant gene and evaluating the size of DNA segments introgressed from the M9 donor in the
resistant restoring lines containing BnALS1R. All the resistant restoring lines had the DNA banding pattern of BnALS1R. There-
fore, PCR-based assays using the markers could be used for the detection and characterization of the herbicide-resistant gene
BnALS1R in rapeseed. The validated AS-PCR markers will facilitate the breeding of herbicide-resistant rapeseed by using
BnALS1R in marker-assisted selection.
Keywords: Rapeseed (Brassica napus L.); Imidazolinone herbicides; BnALS1R; Acetolactate synthase; Allele-Specific PCR
1712 作 物 学 报 第 39卷


咪唑啉酮类除草剂是目前应用较广泛的一类除
草剂, 具有杀草谱广、用量低、除草效率高等优点,
深受广大农户喜爱 [1]。研究表明, 乙酰羟基酸合酶
(acetohydroxyacid synthase, AHAS), 也叫乙酰乳酸
合酶(acetolactate synthase, ALS)是咪唑啉酮类除草
剂的靶酶; 该除草剂通过与 ALS 形成复合物阻断底
物进入酶活性位点通路, 抑制 ALS 活性, 导致支链
氨基酸合成受阻, 使植物组织失绿、黄化, 最后逐渐
死亡[2]。ALS负责催化 2个平行反应, 催化两分子丙
酮酸缩合形成 2-乙酰乳酸放出 CO2, 最终生成缬氨
酸和亮氨酸, 催化一分子丙酮酸和一分子 2-氧丁酸
缩合形成乙酰羟基丁酸, 最终生成异亮氨酸[3]。对拟
南芥、烟草、水稻、小麦、向日葵、大麦等抗性植
物的分子机制研究表明, 抗性植物是由于体内 ALS
基因核酸序列产生若干碱基位点的变异, 造成编码
蛋白氨基酸残基位点改变, 从而引起除草剂与 ALS
结合方式的变化[4-7]。
在油菜中, 加拿大 Swanson 等[8]采用小孢子化
学诱变获得 2 个抗咪唑啉酮类除草剂的油菜突变体
PM1 和 PM2[8]。PM1 和 PM2 都由 ALS 基因点突变
而成, 其中 PM1 是基因 BnALS1 的第 653 位 Ser 发
生突变, PM2是基因 BnALS3的第 574位 Trp发生突
变(以拟南芥的 ALS 氨基酸位置计算), 目前国外已
商品化的抗咪唑啉酮油菜品种都是由这 2 个突变体
转育而成[9]。2004 年, 高建芹等[10-11]在油菜和大豆
多年轮作的试验田中发现了 1 株抗咪唑啉酮油菜。
通过连续多年自交及小孢子培养得到了抗性株系
M9。抗性效应鉴定发现, M9抗除草剂的浓度是除草
剂有效杀草浓度的 2~3 倍, 抗性稳定、具有极高的
利用价值。胡茂龙等 [12]从 M9 中克隆到抗性基因
BnALS1R 发现, 抗性基因 BnALS1R 与野生型基因
BnALS1存在 1处 SNP, 导致 ASL1的第 638位丝氨
酸残基被天冬酰胺酸替代(以油菜的 ALS1氨基酸位
置计算), 这与 PM1碱基突变位点相同。但 M9为大
豆田中发现的天然突变株后代系选材料, 该材料抗
性是由除草剂诱发的自然突变获得, 这与向日葵抗
性突变体 IMISUN-1、IMISUN-2、RW-B获得的途径
相同, 而与 PM1、PM2 抗性获得的途径不同[5-7]。国
外抗性基因商业化利用需要交纳昂贵的专利费, 这
将会提高油菜生产成本[12]。而我们发现的抗性基因
BnALS1R 具有自主知识产权, 不受国际知识产权保
护的限制, 若能进一步找到与之紧密连锁的分子标
记, 从而进行标记辅助选择, 区分出育种材料中抗
性基因的不同基因型, 则可指导田间选育, 加快育
种进程。
等位基因特异 PCR (allele-specific PCR, AS-
PCR)是基于等位基因的 SNP 设计特异引物, 通过
PCR扩增来检测样本基因型的一种鉴定方法[13]。该
方法不受季节和时间限制, 具有快速、高效的优点,
已在水稻 [14]和大麦 [4]中成功运用。但迄今, 国内外
关于检测甘蓝型油菜对咪唑啉酮类除草剂抗性基因
的鲜见报道。前期研究发现, 突变体 M9 抗性基因
BnALS1R 与正常敏感基因存在 1 处 SNP 差异, 用
DNA 测序技术可检测抗性基因, 但操作繁琐、费用
相对昂贵。本研究依据 SNP 差异, 拟开发抗性基因
位点的 AS-PCR 标记, 以期快速、准确检测抗性基
因 BnALS1R, 为利用抗性基因进行油菜抗除草剂分
子标记辅助选择育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及除草剂
油菜抗咪唑啉酮类除草剂突变体 M9 为浦惠明
等[15]在油菜和大豆多年轮作的试验田中发现的天然
突变体及后代单株M9-2、M9-3、M9-11和M9-14; 敏
感野生型对照品种宁油 12、宁油 14、宁油 16、宁
油 18和宁油 20为江苏省审定品种; BnALS1R基因型
分离群体所用的敏感型亲本 3075R 为江苏省农业科
学院经济作物研究所选育的 MICMS 细胞质雄性不
育双低恢复系。F2群体(3075R/M9-2)是以 3075R 为
母本 , M9-2 为父本杂交、自交获得 ; BC1 群体
[(3075R/M9-2)/3075R]和 BC2 群体 [(3075R/M9-2)/
M9-2]是由 F1(3075R/M9-2)为母本, 分别与 3075R、
M9-2 回交获得。190 个抗咪唑啉酮 MICMS 纯合恢
复系分别是由(3018R/M9)和(3075R/M9)的 F1植株花
粉经小孢子培养加倍获得的 DH 株系[12]。咪唑啉酮
类除草剂为山东先达化工有限公司生产的 5.0%“豆
施乐”水剂。试验在本院油菜隔离繁殖区进行, 严格
控制花粉外漂, 不对外界环境产生污染。
1.2 菌株、试剂与克隆载体
大肠杆菌 E. coli DH5α由农业部长江下游棉花
与油菜重点实验室保存, DNA分子量标准、DNA回
收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技北
京有限公司, 普通 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、PCR
产物平末端加 A 试剂盒和 IPTG 均购自 TaKaRa 宝
第 10期 胡茂龙等: 油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因 BnALS1R等位基因特异 PCR标记的开发与应用 1713


生物工程有限公司(中国大连), 高保真性 DNA 聚合
酶 KOD-Plus 及 PCR 试剂购自东洋纺(上海)生物科
技有限公司, 克隆载体 pEASY-T1 购自北京全式金
生物技术有限公司。引物由上海 Invitrogen生命技术
有限公司合成, DNA 测序由南京金斯瑞生物科技有
限公司完成。
1.3 除草剂处理与 DNA提取
2007 年油菜花期用 M9 株系的不同单株与
MICMS 双低恢复系 3075R 配制 F1组合, 秋播鉴定
F1和亲本的抗性表现。2008 年春以 F1自交获得 F2
世代, 同时用相应的抗性亲本和敏感型亲本分别对
以敏感型亲本为母本的反交组合 F1回交, 获得 BC1、
BC2群体, 秋播鉴定分离世代 F2、BC1、BC2的抗性
表现。在油菜三至五叶期用浓度为 90 ga.i. hm–2除草
剂处理, 处理前取少许叶片保存于–80℃冰箱, 用于
DNA提取。20 d后调查成活苗与死苗数, 统计分离
比例, 进行卡方测验。采用 CTAB 法并稍作修改提
取 DNA [16], 用 1％(V/W)的琼脂糖电泳和分光光度
法检测其纯度。
1.4 分子标记开发
此前研究发现, M9与常规油菜宁油 16、宁油 18
编码 ALS 家族中 BnALS1 的核苷酸序列存在 1 处
SNP[12], 根据该处 SNP 可开发 AS-PCR 标记检测抗
性基因 BnALS1R。但由于油菜 ALS基因家族核酸序
列的高度同源性, 特别是 BnALS1和 BnALS3在核酸
水平的同源性达 98% [17], 使得在编码区内很难开发
出引物分别特异扩增 BnALS1 和 BnALS3 的基因片
段。为此首先必须找到这 2个基因在 M9、宁油 16、
宁油 18 的序列差异, 通过比较 BnALS1 和 BnALS3
的序列差异, 设计特异引物扩增 BnALS1 基因序列
片段, 排除 BnALS3 基因序列对检测抗性基因的干
扰。由于此前申请的专利中已经获得 M9、宁油 16、
宁油 18 的 BnALS1 全长编码序列(BnALS1-NY16、
BnALS1-NY18)[18], 因此为获得 M9、宁油 16、宁油
18的 BnALS3全长编码序列, 根据 NCBI中 BnALS3
基因序列(GenBank 登录号为 Z11526), 利用 Primer
Premier 5.0 软件在基因编码区段两侧且与 BnALS1
的非同源区设计特异正向引物 BnALS3-F: 5-CGC
GGTACCCTCTCTCTCTCTCATCTAACCAT-3和反
向引物 BnALS3-R: 5-CGCACTAGTCTCTCAGTAC
TTAGTGCGACC-3, 通过 PCR 扩增全长的 BnALS3
基因。PCR体系含 DNA模板 1 μL、10×酶反应缓冲
液 2 μL、25 mmol L–1 MgSO4 1.2 μL、2 mmol L–1
dNTPs 2 μL、 10 μmol L–1 引物各 2 μL、 1 U
L–1KOD-Plus Taq酶 0.8 μL, 加水至 20 μL。反应程
序为 94℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s,
72℃延伸 2.5 min, 35个循环。按试剂盒使用说明书
进行 PCR产物平末端加 A后, 经 1.2% (V/W)琼脂糖
凝胶电泳分离, 用DNA凝胶回收试剂盒将目的片段
回收纯化, 连接于克隆载体 pEASY-T1上, 热激转化
DH5α。通过蓝白斑筛选和菌落 PCR鉴定, 将阳性克
隆送公司测序。通过 DNAMAN6.0、Sequencher、
DNASTAR 等软件分析野生型与突变体 BnALS1、
BnALS3 基因序列的差异。根据序列差异, 设计 30
条分子标记引物(表 1)。其中每条等位基因特异 PCR
引物的 3′末端分别与 SNP位点对应的等位碱基完全
匹配, 同时在特异引物 3′末端的倒数第 3 或第 4 位
置引入 1 个错配碱基, 每个位置引入 3 种错配碱基,
以期获得多个多态性标记。等位基因特异 PCR引物
AP3F~AP14F 分别与 3 条公用引物 AP1R、AP2R、
A5R配对, 公用引物AP15F~AP17F分别与等位基因
特异 PCR引物 AP18R~AP29R配对。以提取的油菜
基因组 DNA 为模板, PCR 筛选 36 个组合分子标记
引物扩增产物多态性。理论上, 若样品中的等位位
点与等位基因特异 PCR 引物的 3′末端相匹配, 便能
进行有效扩增, 反之则不能进行有效扩增。
PCR反应体系含: 10 ng μL–1 DNA模板 2.0 μL,
10 μmol L–1引物的各 2. 0 μL, 10×酶反应缓冲液 2 μL,
25 mmol L–1 MgC12 1.2 μL, 2.5 mmol L–1 dNTPs 1.6
μL, 5 U L–1 Taq酶 0.1 μL, 加水至 20 μL; PCR反应程
序为 94oC 预变性 5 min, 94℃变性 30 s, 60℃退火
30 s, 72℃延伸 1 min, 共 35个循环; 然后 72℃延伸
5 min, 12℃冷却 10 min后, 将扩增产物加上样缓冲
液终止反应。扩增产物在质量比浓度为 1.2%的琼脂
糖凝胶上电泳, 经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统
下观察、记载。用筛选的多态性标记引物在抗性油
菜和敏感野生型品种中克隆, PCR产物测序。
1.5 多态性标记对分离群体中 BnALS1R 基因型
的检测
为探明多态性标记对甘蓝型油菜抗咪唑啉酮基
因 BnALS1R基因型的检测效果, 提取油菜苗期 3 个
BnALS1R基因型分离群体植株叶片 DNA, 利用多态
性标记引物进行 PCR扩增。DNA提取、PCR反应、
产物检测方法同上。统计基因型分离比例, 进行卡
平方测验。
1714 作 物 学 报 第 39卷


表 1 检测抗性基因的 AS-PCR引物序列
Table 1 AS-PCR primer for assay of herbicide-resistant gene
引物编号
Primer No.
序列
Sequence
引物编号
Primer No.
序列
Sequence
AP1R 5-CGTCTGGGAACAACCAAAAGT-3 AP15F 5-CTTTCGCTAGCAGGGCTAAA-3
AP2R 5-GCATTGAGTCCCAAACATATGA-3 AP16F 5-ATCCTCGACGAGCTAACCG-3
A5R 5-CGAGTACGTCTGGGAACAA-3 AP17F 5-CTGTCGTCATCAGGCCTCG-3
AP3F 5-TGTGTTACCGATGATCCCCAG-3 AP18R 5-CATCTTTGAAAGTGCCACAAC-3
AP4F 5-TGTGTTACCGATGATCCCCAA-3 AP19R 5-CATCTTTGAAAGTGCCACAAT-3
AP5F 5-TGTGTTACCGATGATCCCTAG-3 AP20R 5-CATCTTTGAAAGTGCCACTAC-3
AP6F 5-TGTGTTACCGATGATCCCTAA-3 AP21R 5-CATCTTTGAAAGTGCCACTAT-3
AP7F 5-TGTGTTACCGATGATCCCGAG-3 AP22R 5-CATCTTTGAAAGTGCCACGAC-3
AP8F 5-TGTGTTACCGATGATCCCGAA-3 AP23R 5-CATCTTTGAAAGTGCCACGAT-3
AP9F 5-TGTGTTACCGATGATCCAAAG-3 AP24R 5-CATCTTTGAAAGTGCCAACAC-3
AP10F 5-TGTGTTACCGATGATCCAAAA-3 AP25R 5-CATCTTTGAAAGTGCCAACAT-3
AP11F 5-TGTGTTACCGATGATCCTAAG-3 AP26R 5-CATCTTTGAAAGTGCCATCAC-3
AP12F 5-TGTGTTACCGATGATCCTAAA-3 AP27R 5-CATCTTTGAAAGTGCCATCAT-3
AP13F 5-TGTGTTACCGATGATCCGAAG-3 AP28R 5-CATCTTTGAAAGTGCCAGCAC-3
AP14F 5-TGTGTTACCGATGATCCGAAA-3 AP29R 5-CATCTTTGAAAGTGCCAGCAT-3
下画线碱基表示错配碱基, 黑体碱基表示 SNP位点。
The underline shows mismatched bases. The bold bases indicate SNP loci.

1.6 应用多态性标记检测抗咪唑啉酮MICMS纯
合恢复系
于苗期提取抗咪唑啉酮 MICMS 纯合恢复系的
DNA, 利用多态性标记引物进行 PCR 扩增, 检测抗
性恢复系中抗性基因 BnALS1R 是否存在。DNA 提
取、PCR反应、产物检测方法同上。
2 结果与分析
2.1 检测抗咪唑啉酮基因 BnALS1R 多态性分子
标记的开发
为消除 BnALS3 基因序列对特异性检测抗性基
因 BnASL1R的干扰, 首先扩增M9及野生型宁油 16、
宁油 18的 BnALS3基因, PCR产物与预期大小相同。
测序发现, 3 个序列与 NCBI上公布的 BnALS3基因
序列 Z11526同源性达 99%, 表明成功克隆到 3个材
料的 BnALS3 基因 , 分别命名为 BnALS3-M9、
BnALS3-NY16、BnALS3-NY18。将 3个基因序列与之
前获得专利的 BnALS1 的 3 个基因序列及 Z11524、
Z11526比对发现, 3个材料的 BnALS1和 BnALS3基
因编码区的 DNA序列高度同源, 仅存在 1处 9个碱
基插入/缺失和一些单核甘酸变异(图 1)。而 9个碱基
插入/缺失主要是重复序列, 不适合作为引物序列。
因此, 根据此前专利中发现的突变体M9与宁油 16、
宁油 18 的 BnALS1 核苷酸序列存在的单碱基突变
(G/A), 将引物序列锚定在BnALS1与BnALS3单核甘
酸变异上, 共设计 30 条 AS-PCR 引物(表 1)。筛选
36 个组合 AS-PCR 标记多态性 , 结果获得
AP15F/AP18R、AP15F/AP19能分别特异扩增敏感基
因 BnALS1、抗性基因 BnALS1R, 这 3条引物在基因
序列上位置如图 1所示。引物对 AP15F/AP18R特异
扩增的是 BnALS1位点上第 1933处核苷酸为 G的等
位位点, 即未突变的油菜野生型 BnALS1基因, 对除
草剂敏感 ; 引物对 AP15F/AP19R 特异扩增的是
BnALS1 位点上第 1933 处核苷酸为 A 的等位位点,
即抗性基因 BnALS1R, 对除草剂具有抗性。
用上述 2 对引物对含敏感基因 BnALS1 的常规
油菜宁油 12、宁油 14、宁油 16、宁油 18、宁油 20
与含有抗性基因 BnALS1R 的抗咪唑啉酮油菜 M9、
M9-2、M9-3、M9-11、M9-14为模板进行 PCR扩增。
结果表明, 所有常规油菜由引物对 AP15F/AP18R扩
增的产物均有 828 bp 特征条带, 而 AP15F/AP19无
特征条带。反之, 所有抗性油菜 AP15F/AP18R扩增
产物无特征条带而 AP15F/AP19R 均有 828 bp 特征
条带(图 2)。特征条带经测序表明, PCR产物属于油
菜 BnALS1 的基因片段而非其他非特异性扩增, 且
在抗性油菜与常规油菜中存在单碱基突变 G/A (图
3)。田间苗期喷施除草剂表明, 未发现抗性油菜死苗,
而 5个常规油菜喷药后 20 d全部死亡。以上结果表
明, 用 2 对引物多态性分子标记可以准确检测油菜
种质资源中是否含有抗咪唑啉酮基因 BnALS1R。
第 10期 胡茂龙等: 油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因 BnALS1R等位基因特异 PCR标记的开发与应用 1715




图 1 不同来源的油菜 ALS1与 ALS3基因序列比对与多态性引物位置
Fig. 1 Sequencing alignment of ALS1 and ALS3 genes from different species in rapeseed and sites of polymorphic loci
倒三角形表示突变位点, 箭头线表示引物位置和扩增方向。
The single-site mutation is denoted by inverted triangle. The arrow lines represent sites and directions of primers.



图 2 AS-PCR标记引物在抗性油菜和敏感油菜中 PCR扩增结果
Fig. 2 PCR products obtained using AS-PCR primers among resistant and susceptible lines in rapeseed
M: DNA分子量标准(500、800、1200、2000、3000和 4500 bp); 1~5: 敏感油菜宁油 12、宁油 14、宁油 16、宁油 18、宁油 20;
6: H2O; 7~11: 抗性油菜 M9、M9-2、M9-3、M9-11、M9-14。
M: DNA marker (500, 800, 1200, 2000, 3000, and 4500 bp); 1–5: Ningyou 12, Ningyou 14, Ningyou 16, Ningyou 18,
and Ningyou 20; Lane 6: H2O; 7–11: M9, M9-2, M9-3, M9-11, and M9-14.

1716 作 物 学 报 第 39卷



图 3 AS-PCR引物在抗性油菜和敏感油菜中 PCR产物序列比对
Fig. 3 Sequencing of PCR products obtained using AS-PCR primers among resistant and susceptible lines in rapeseed
三角形表示突变位点。The single-site mutation is denoted by triangle.

2.2 多态性标记对分离群体中 BnALS1R 基因型
的检测
利用 2对多态性标记在对 3个分离群体 F2、BC1
和 BC2中的 BnALS1R基因型检测发现, F2群体呈现
3 种特征条带(图 4), 即不含抗性基因 MICMS 双低
恢复系 3075R 特征条带(引物对 AP15F/AP18R 扩增
产物有特征条带 828 bp而 AP15F/AP19无特征条带)
为纯合敏感基因型单株, 如单株 6、11、14、17、20;
含 有 抗 性 基 因 的 M9-2 特 征 条 带 ( 引 物 对
AP15F/AP18R 扩增产物无特征条带而 AP15F/
AP19R 有特征条带 828 bp)为纯合抗性基因型单株,
如单株 10、12、16、24; 同时具有双亲杂合带型(引
物对 AP15F/AP18R 和 AP15F/AP19 扩增产物都有
特征条带 828 bp)为杂合抗性基因型单株, 如单株 4、
5、7~9、13、15、18、19、21~23。在 F2 群体中检
测 154 个单株, 纯合敏感基因型单株 35 个, 纯合抗
性基因型单株 39个, 而具有杂合抗性基因型单株 80
个, 3种基因型数量符合 1∶2∶1 (表 2)。BC1群体中
检测的 227个单株呈现 2种条带(图 5)。其中纯合敏
感基因型单株共 110个, 如单株 5、9~10、12、14~15、
19~20、23, 杂合抗性基因型单株 117个, 如单株 4、
6~8、11、13、16~18、21~22、24, 2 种基因型数量
符合 1∶1 (表 2)。BC2群体中检测的 201 个单株同
样呈现 2 种条带(图 6), 其中纯合抗性基因型单株
113 个(图 6), 如单株 4、6~7、9、12~13、16~17、
21~22、24, 杂合抗性基因型单株 98个, 如单株 5、
8、10~11、14~15、18~20、23, 2种基因型数量符合
1∶1 (表 2)。以上 3个群体 PCR检测结果与苗期喷
施除草剂鉴定结果完全一致, 基因型分离比均遵循
单基因遗传规律。因此, 2 对引物的多态性标记可
有效检测油菜抗咪唑啉酮基因 BnALS1R 的 3 种基
因型。

图 4 AS-PCR引物在 F2群体中 PCR扩增结果
Fig. 4 PCR products obtained using AS-PCR primers among
F2 population in rapeseed
M: DNA分子量标准(同图 2); 1: 3075R; 2: F1(3075R×M9-2);
3: M9-2; 4~24: 部分 F2单株。
M: DNA marker (same as Fig. 2); 1: 3075R; 2: 3075R×M9-2 F1;
3: M9-2; 4~24: plants randomly selected from F2 population.


图 5 AS-PCR引物在 BC1群体中 PCR扩增结果
Fig. 5 PCR products obtained using AS-PCR primers among
BC1 population in rapeseed
M: DNA分子量标准(同图 2); 1: 3075R; 2: M9-2;
3: F1(3075R×M9-2); 4~24: 部分 BC1单株。
M: DNA marker (same as Fig.2); 1: 3075R; 2: M9-2;
3: 3075R×M9-2 F1; 4–24: plants randomly selected from BC1
population.


图 6 AS-PCR引物在 BC2群体中 PCR扩增结果
Fig. 6 PCR products obtained using AS-PCR primers among
BC2 population in rapeseed
M: DNA分子量标准(200、500、800、1200和 2000 bp); 1: 3075R;
2: M9-2; 3: F1(3075R×M9-2); 4~24: 部分 BC2单株。
M: DNA marker (200, 500, 800, 1200, and 2000 bp); 1: 3075R;
2: M9-2; 3: 3075R×M9-2 F1; 4–24: plants randomly selected from
BC2 population.
第 10期 胡茂龙等: 油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因 BnALS1R等位基因特异 PCR标记的开发与应用 1717


表 2 SNP位点在 F2、BC1、BC2群体中的基因型分离
Table 2 Genotype frequencies at SNP site in F2, BC1, and BC2 populations
基因型 Genotype 杂交组合
Cross G/G G/A A/A
总株数
Total
卡平方值
χ2-value
P值
P-value
F2 (3075R×M9-2) 35 80 39 154 0.20 0.50–0.75
BC1 [(3075R×M9-2) ×3075R] 110 117 0 227 0.45 0.25–0.50
BC2 [(3075R×M9-2) ×M9-2] 0 98 113 201 0.37 0.50–0.75

2.3 应用多态性标记检测抗性恢复系中的抗性
基因 BnALS1R
在此前的研究中, 我们已获得 190 个携带抗性
基因 BnALS1R的 MICMS 纯合恢复系。为验证筛选
的多态性标记 AP15F/AP18R、AP15F/AP19R对抗性
基因 BnALS1R 的检测效果, 对获得的抗咪唑啉酮纯
合恢复系进行 2 次 PCR 扩增, 电泳结果表明, 所有
抗性恢复系中都含有抗性基因 BnALS1R 特征条带
(图 7), 进一步证明 2对引物多态性标记检测抗性基
因的准确性。


图 7 多态性标记对抗性恢复系中抗性基因 BnALS1R的检测
Fig. 7 Assay results of resistant gene BnALS1R for resistant
restoring lines using polymorphic markers
M: DNA分子量标准(同图 2); 1: M9; 2: 宁油 18; 5: 水;
3~4、6~24: 抗性恢复系。
M: DNA marker (same as Fig. 2); 1: M9; 2: Ningyou 18; 5: H2O;
3–4, 6–24: some of resistant restoring lines.

3 讨论
基于基因序列 SNP 开发分子标记的方法很多,
如 RFLP、CAPS 或 dCAPS 等传统方法[19-21]。本研
究利用抗性油菜 M9携带的抗性基因 BnALS1R与野
生型基因的 SNP 差异, 在油菜 BnALS1 与 BnALS3
序列的非同源区设计 30 条标记引物, 从中筛选出 3
条引物的 AS-PCR 标记。与传统标记相比, 该方法
不需要繁琐的分子杂交和限制性酶切实验, 仅需通
过 2次 PCR反应就可鉴定出甘蓝型油菜抗除草剂基
因 BnALS1R及其基因型。方法高效、快捷、价格低
廉, 只要具有 PCR 仪及相关电泳设备的实验室就能
完成。
与一般农艺性状连锁的分子标记不同, 本研究
获得的标记是根据基因突变位点设计的功能性标记,
能直接反映植株的抗性, 不存在由于遗传交换而造
成的错误鉴定。因此, 利用该标记方法能有效用于
抗咪唑啉酮基因 BnALS1R引起的油菜对咪唑啉酮类
除草剂抗性的标记辅助育种。常规育种方法是利用
含 BnALS1R基因的 M9与生产上推广的主栽品种进
行一系列杂交, 然后在每个分离后代中喷施除草剂
进行鉴定 , 最终选择含抗咪唑啉酮基因 BnALS1R的
抗性单株。在每个分离后代除草剂鉴定过程中 , 如
果除草剂剂量使用不当或喷施不均匀极易导致误
选。另外 , 多年连续喷施过量的咪唑啉酮类除草剂
可能会导致土壤残留 , 对下茬作物有一定影响。有
时在抗除草剂基因研究过程中需要保存不抗的材料,
用作比较研究。因此, 利用 BnALS1R 基因的功能性
标记检测植株 DNA, 可以在油菜任何时期鉴定出抗
性基因的纯合基因型单株以及优良性状的不抗单株,
淘汰其他单株, 这样不仅节约育种成本、减少土壤
残留 , 而且可大大加速抗咪唑啉酮油菜品种的选择
进程。
甘蓝型油菜为白菜型油菜和甘蓝天然杂交自然
加倍而来, 包括 A、C两套基因组, 其中 A基因组起
源于白菜型油菜, C基因组起源于甘蓝。基因组进化
过程中高度重排导致甘蓝型油菜相关基因多以基
因家族的形式存在[22]。家族内基因核酸序列高度同
源, 咪唑啉酮类除草剂的靶基因 ALS也不例外。A、
C基因组内 3个具有功能的 ALS基因核酸序列高度
同源[23], 特别是 BnALS1和 BnALS3在核酸水平的同
源性达 98%, 这给 AS-PCR标记检测 BnALS1增加了
难度, 因为在进行 PCR 扩增油菜 BnALS1 过程中会
受到高度同源序列 BnALS3 的干扰。本研究中使用
的 30条引物组合成 36对 AS-PCR标记, 仅筛选出 1
个组合在抗性油菜和常规油菜间具有多态性, 而其
他组合虽然都能有效扩增但无多态性, 可能是由于
同源序列 BnALS3 的干扰。另外一个原因可能来自
AS-PCR引物的自身设计特点, 因为在设计 AS-PCR
引物时, 不管将公用引物设计成正向引物或者是反
向引物, 其他 2条等位基因特异 PCR引物的 3′末端
都必须锚定在 SNP 位点上, 即使在 AS 引物 3′末端
1718 作 物 学 报 第 39卷


倒数第 3或第 4位置人为引入 1个特定的错配碱基,
降低 AS-PCR 引物与非匹配模板结合, 也很难保证
在多倍体中每条引物均具有很好的 PCR特异性[24]。
同时研究中发现, 开发甘蓝型油菜 AS-PCR 标记时
公用引物序列的特异性非常重要。本研究筛选的多
态性 AS-PCR 标记公用引物 AP15F 恰好锚定在
BnALS1 和 BnALS3 的 4 个 SNP 上(图 1), 其分别与
等位基因引物 AP18R、19R 配对才能准确鉴定抗性
基因型。反之, 换成公用引物 AP16F、AP17F, 则达
不到鉴定效果。推测是由于 AP16F、AP17F 仅锚定
在 BnALS1和 BnALS3的 2个 SNP上, 特异性较差。
研究中还发现, 当使用共同公用引物 AP15F 时, AS
引物 3–末端引入错配碱基的替换方式和位置也尤为
关键。因为仅在 3′末端倒数第 3位引入错配碱基时,
3 种碱基替换方式中的 C/A 类型替换才具有引物特
异性。反之, 在倒数第 4位引入错配碱基时, 任何 1
种碱基替换方式的 AS 引物都不具有引物特异性。
Hayashi 等[25]在水稻中也发现, AS 引物在 3′末端倒
数第 3 位引入 C/A 类型的替换能显著提高引物的特
异性, 他对 49 个 SNP 位点设计了特异引物, 其中
67%的引物能可靠地区分 2 个等位基因。卫波等[24]
认为错配碱基的位置及替换方式对 PCR结果的影响
可能与 3′末端不同错配碱基产生的碱基堆积力、氢
键及其立体结构的稳定性有关。还可能与错配碱基
对和 DNA 聚合酶之间的相互作用造成的空间位阻
有关。因此, AS引物 3′末端能否与其互补模板特异
扩增而不与其非互补模板扩增的特性是人工引入错
配碱基与等位基因 3′末端固有的 SNP错配碱基共同
作用的结果。
Kadaru 等[14]在水稻、Lee 等[4]在大麦中也都获
得了检测抗咪唑啉酮基因的 AS-PCR 标记, 但与水
稻染色体组(2n=24)和大麦(2n=14)不同 , 甘蓝型油
菜为异源四倍体 (2n=38), 基因组庞大 , 重复序列
较多。因此 , 为明确研究获得的引物对 AP15F/18R、
AP15F/19R 特异扩增的是油菜 BnALS1 基因片段而
非其他非特异扩增, 我们对 2 对引物分别在常规油
菜和抗性油菜扩增的条带进行了测序, 结果表明特
异扩增的是 BnALS1 基因片段, 且在常规油菜和抗
性油菜之间存在单碱基突变。同时, 用该引物组合
对 3 个群体进行扩增, 发现基因型分离比遵循单基
因遗传模式, 证明该 AS-PCR 分子标记可以有效、
准确检测油菜抗咪唑啉酮基因 BnALS1R的 3种不同
基因型。另外, 陈吉宝等 [26]根据普通小麦(Triticum
aestivum L.)品种旱选 10和鲁麦 14之间在 TaDREB1
基因的 SNP 进行 AS-PCR 标记研究, 获得了 1 对
AS-PCR标记可以区分 2个品种, 并用该标记引物将
TaDREB1 基因定位于 3BS, 表明 AS-PCR 标记可以
用在诸如油菜、小麦等多倍体作物中。当然, 利用
本研究的标记定位油菜 BnALS1R 的工作正在进
行中。
抗咪唑啉酮类除草剂油菜已在加拿大、澳大利
亚、欧洲国家广泛种植, 但我国由于缺乏自主知识
产权的抗除草剂基因一直无法商业化应用[27-28]。前
期研究, 我们从油菜自然突变的抗性材料 M9 中克
隆获得了抗性基因 BnALS1R, 虽然该基因的碱基突
变位点与加拿大 PM1突变位点相同, 但 BnALS1R是
我国拥有自主知识产权的抗除草剂基因, 不受国际
知识产权保护的限制, 也是国内首次报道的抗咪唑
啉酮类除草剂基因[12]。同时, 本研究根据该突变位
点的 SNP, 在国内外首次开发了检测该抗性基因的
分子标记, 并在抗性恢复系中进行了检测, 发现该
AS-PCR 标记能特异扩增出抗性基因的目的条带 ,
表明基于此标记的 PCR检测方法精确、可靠。显然,
以上这些研究为我国抗咪唑啉酮油菜的选育提供了
基因来源和功能标记。
4 结论
从 30 条等位基因特异 PCR 引物中筛选、鉴定
出 3条 AS-PCR引物, 通过 2次 PCR就可以快速、
准确检测出油菜品种或品系中咪唑啉酮类除草剂抗
性基因 BnALS1R的基因型。该 AS-PCR标记的获得
为利用抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选
择育种奠定了基础。
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