全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(7): 1164−1173 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国博士后科学基金(2012M511053)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2013ZX08011-006)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张杰道, E-mail: jdzhang@sdau.edu.cn; 董树亭, E-mail: stdong@sdau.edu.cn
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-01-21; Accepted (接受日期): 2014-04-16; Published online(网络出版日期): 2014-05-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140516.1002.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01164
玉米响应渗透胁迫的数字基因表达谱分析
葛淑娟 1,** 孙爱清 2,** 刘 鹏 2 张杰道 1,* 董树亭 2,*
1山东农业大学生命科学学院 / 作物生物学国家重点实验室 / 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安 271018; 2山东农业大学农学
院, 山东泰安 271018
摘 要: 以玉米种质 POB21 为材料, 利用数字基因表达谱技术对 15% PEG 渗透胁迫处理后的玉米叶片 cDNA 文库
进行差异基因表达谱分析。结果表明, 转录组基因序列与参考基因组高度一致, 基因表达呈现出高度不均一性和部分
冗余性。从中筛选出 1097个有效差异表达基因, 其中 795个表达上调, 302个表达下调。GO功能显著性富集分析表
明, 3种细胞组分和分子功能中的 3种糖基转移酶活性表现为富集。KEGG代谢分析表明差异表达基因广泛涉及糖、
蛋白、核酸和脂类等生物大分子代谢、次生代谢、激素代谢以及能量代谢过程。脯氨酸代谢相关基因的差异表达分
析表明, 谷氨酸途径是胁迫诱导脯氨酸积累的主要方式。表达谱分析结果为玉米渗透胁迫响应分子机制的深入研究
和功能基因的筛选奠定了基础。
关键词: 玉米; 渗透胁迫; 基因表达谱; 差异表达基因
In silico Expression Profile of Maize Genes in Response to Osmotic Stress
GE Shu-Juan1,**, SUN Ai-Qing2,**, LIU Peng2, ZHANG Jie-Dao1,*, and DONG Shu-Ting2,*
1 State Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Key Laboratory of Crop Biology / College of Life Sciences, Shandong Agricultural University,
Tai’an 271018, China; 2 College of Agriculture, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: In this study, a germplasm POB21 was used to analyze leaf cDNA library of maize treated with 15% PEG by in silico
expression profile. The results indicated the POB21 genome shared significantly high similarity with reference genome. The gene
expression in maize transcriptome presented strong nonhomogeneity and partial redundancy. A total of 1097 differentially ex-
pressed genes (DEGs) were screened out, of which 795 DEGs were up-regulated and 302 DEGs were down-regulated. GO en-
richment analysis of these DEGs showed that three cellular components and three molecular functions of glycosyl transferase
activity were enriched. The KEGG pathway analysis showed these DEGs were involved in metabolisms of carbohydrate, protein,
nucleic acid, lipid, secondary metabolites, hormones and energy. The DEGs involving in proline metabolism indicated glutamate
pathway is the predominant accumulation way of proline under osmotic stress in maize. The result lay a foundation for further
study of molecular mechanism in response to osmotic response and functional genes screening of maize.
Keywords: Maize; Osmotic stress; Gene expression profile; Differentially expressed genes
我国玉米种植面积仅次于美国, 其中约三分之
二是旱作 , 从播种到收获的全生育期都可遇到干
旱。干旱脱水产生渗透胁迫可致玉米减产 25%~30%,
严重时甚至绝收[1]。盐胁迫等其他非生物逆境也可
以间接产生渗透胁迫[2]。提高玉米渗透胁迫抗性是
改善玉米对干旱为主的多种非生物胁迫抗性的重要
手段, 阐明玉米对渗透胁迫的抗性机制是抗旱育种
和栽培技术改良的理论基础。
在渗透胁迫下, 水势下降引起植物各种盐离子
和代谢物浓度相对升高, 造成细胞结构破坏、蛋白
损伤和代谢异常, 同时也能引发植物保护机制的响
应[3-4]。植物根系在短期胁迫时生长加速, 而长期胁迫
时生长受抑制; 地上部分由于气孔关闭和光合酶活
性下降导致光合作用受抑制, 生长减缓。活性氧积累
造成膜脂和某些功能蛋白的过氧化, 使膜脂饱和度
增加、蛋白聚合和交联等结构异常。细胞内大部分多
第 7期 葛淑娟等: 玉米响应渗透胁迫的数字基因表达谱分析 1165


糖和蛋白合成受到抑制。在防御反应中, 植物通过积
累 K+、Ca2+、脯氨酸等渗透调节物质的来调节渗透平
衡; 通过提高 SOD、CAT、POD等酶活性来减轻活性
氧伤害; 通过改变ABA等激素水平来调节基因表达。
ZmMKK4、ZmbZIP72、ZmLEA3等众多基因的表达水
平在渗透胁迫下发生变化[5-7]。玉米在生理、生化和
分子水平上对渗透胁迫的响应因胁迫强度、胁迫时间
和遗传基础的差异表现出广泛的多样性。
以高通量测序技术为基础的基因表达谱分析是
从转录组学水平上系统研究整体基因表达差异的有
效方法。与差减杂交、基因芯片等差异表达分析方
法相比, 高通量测序筛选效率高, 没有对基因组测
序的依赖性, 同时还提供了基因片段的真实序列信
息[8-9]。近年来, 玉米基因组测序的完成和基因注释
信息的不断丰富, 为玉米表达谱分析中的基因比对
和筛选提供了有利条件[10]。本研究通过高通量测序
分析玉米在渗透胁迫下的数字基因表达谱变化, 以
阐述玉米响应渗透胁迫的分子基础, 为抗性基因的
发掘和利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
试验玉米材料为 POB21改良热带晚熟马齿型白
粒群体。取饱满一致的种子 30粒, 6次重复, 播于沙
床上, 25 , 12 h d℃ –1光照培养 12 d, 将生长整齐一致
的玉米幼苗分为 2组, 一组加入 15% PEG-6000溶液
模拟渗透胁迫处理 10 h, 另一组正常供水作为对照。
渗透胁迫处理结束后取完全展开叶片混合, 于液氮
中保存, 用于基因表达谱分析和差异表达基因的定
量 RT-PCR分析。
1.2 玉米叶片 RNA提取及基因表达谱测序
以 TRIzol法提取 10 µg以上的叶片总 RNA, 加
热打开二级结构 , 用带有 Oligo(dT)的磁珠富集
mRNA, 加入 fragmentation buffer 使其成为短片段,
再以短片段 mRNA 为模板, 用六碱基随机引物合成
cDNA第一链, 并加入缓冲液、dNTPs、RNase H和
DNA polymerase I合成 cDNA第 2链, 用 QiaQuick
PCR试剂盒纯化, 进行末端修复, 加碱基A, 加测序
接头, 以琼脂糖凝胶电泳回收目的片段后进行 PCR
扩增, 从而完成整个文库制备工作。用 Agilent 2100
Bioanalyzer和 ABI StepOnePlus Real-time PCR Sys-
tem 检测文库的质量和产量, 文库质控合格后使用
Illumina HiSeq 2000测序, 测序读长(read)为 49 bp。
测序仪产生的图像数据经 Base Calling 转化为 raw
reads 序列数据, 去除接头序列、空载序列、含氮比
例大于 10%和低质量序列, 获得去除杂质的 reads
(Clean reads)。对原始 Clean reads做标准化处理(每
个基因包含的原始 Clean reads数/该样本中总 Clean
reads数×1 000 000), 获得标准化的基因表达量 TPM
(transcript per million clean reads)。用 reads比对软件
SOAPaligner/SOAP2将 Clean Reads分别比对到参考
基因组和参考基因序列, 获得唯一比对上参考基因
的 reads (unique reads)。利用唯一比对上单一基因的
reads 数和唯一比对上参考序列的总 reads 数来计算
基因表达量, 使用 RPKM 算法对测序深度和基因长
度进行归一化。
1.3 基因功能注释
B73 参考基因数据库和参考基因组数据库的数
据信息来源于 MaizeGDB 数据库 (http://ftp.maize-
sequence.org/current/)。差异表达基因的 GO 分析数
据来自 Gene Ontology 数据库(http://www.eneontol-
ogy.org/), 基因序列首先跟 NCBI的 Nr库用 BLAST
比对(参数: -p blastx -e 1e-5 -m 7), 再用 Blast2GO软
件(默认参数)注释到 GO 的各级 term 下。以校正之
后的差异检验值 p-value≤0.05 为阈值, 满足此条件
的 GO term定义为在差异表达基因中显著富集。基
因序列通过 BLAST(参数: -p blastx -e 1e-5 -m 8)比对
到 KEGG 数据库(kyoto encyclopedia of genes and
genomes)[11]进行注释, Q value≤0.05 的代谢途径定
义为在差异表达基因中显著富集。
1.4 荧光定量 RT-PCR
荧光定量 PCR(qRT-PCR)中应用 2×SYBRGreen
master mix荧光染料。使用 Beacon Designer7.5软件
设计引物, 扩增长度为 75~110 bp, 基因上下游引物
分别为 GRMZM2G125813: 5′-TCTTATCCATCTT
GTGTTC-3′ 和 5′-GACCTTAACAGGAATGAC-3′;
GRMZM2G178074: 5′-TAATCCTGTGCTCGTCTTA-3′
和 5′-GTCTCTTCCTCAGCCATA-3′; GRMZM2G339327:
5′-CACTTGTAATGTTGATGT-3′和 5′-ATATTGATG
GAACGGTAT-3′。扩增程序为 95℃预变性 2 min,
95 20 s, 58 30 s, 72 30 s, ℃ ℃ ℃ 共 35个循环。actin1
基因为内参, 引物为 5′-AATGACGCAGATTATGTT-
3′和 5′-GAATCCATCACAATACCA-3′。
2 结果与分析
2.1 测序质量分析
对测得的 Reads 分析表明, 对照样本(97.53%)
和渗透胁迫处理样本(98.14%) Raw reads 去杂后获
1166 作 物 学 报 第 40卷


得的 Clean reads比例接近, 说明 cDNA文库构建和
测序质量较高。由于遗传背景的差异和注释信息量
的限制, 对照样本 Clean reads中近 79.15%可被参考
基因组注释, 20.85%的 Clean reads未能注释到对应
的基因(表 1), 胁迫处理样本的 reads注释情况相近。
在可注释的 reads 中, 几乎全部 reads 序列与基因组
序列差异都小于 2个碱基, 其中大部分 reads序列(对
照样本 73.8%, 渗透胁迫处理样本 82.5%)可以与基
因组完全匹配, 说明所用玉米材料 POB21与参考基
因组之间遗传基础差异较小。另一方面, 多种 reads
对应同一基因的情况较少, 大部分注释基因只有一
种 read (对照样本 81.9%, 渗透胁迫处理样本
84.3%)。此外, 测序随机性分析表明, reads在基因中
的分布均一, 说明测序样品的 mRNA 完整性和片段
化均一性很好, 序列分析中没有 mRNA 降解和偏向
性的影响。
2.2 Unique reads的种类和表达量分布
正常玉米叶片基因表达谱分析表明, 在 2 410 116
个共计 27 665 种 unique reads 中, 拷贝数(同一种
read的测得数量)超过 1000的高表达 reads的种类虽
然很少(0.99%), 但其表达量占 mRNA 总表达量的
44.81%; 而拷贝数小于 5的 unique reads虽然表达量
小, 只占 mRNA 总量 0.89%, 但在种类上非常丰富,
占 mRNA 种类的 40.23%。在渗透胁迫处理样品
unique reads拷贝数分级中, 同样表现为>1000 拷贝
reads 种类最少(0.93%), 而表达量最高(37.44%); 而
<5 拷贝 reads 表达量最低 (0.89%)而种类最多
(38.78%)。这说明细胞中基因表达表现出高度的不
均一性和部分冗余性 , 少数基因呈现高丰度表达 ,
而多数基因表达水平很低(表 2)。
2.3 玉米响应渗透胁迫的差异表达基因分析
在进行差异表达基因分析过程中, 选取了参考
基因 39 354个, 可被注释的 reads产生的有效参考基
因 22 996 个, 占参考基因总数的 87.7%。以差异检
验 FDR值≤0.001且差异倍数不低于 2倍为差异表达
基因(DEGs, differentially expressed genes)的选择标

表 1 样品序列与参考基因组比对分析
Table 1 Sequence comparison of samples with reference genome
Read分类
Read classification
对照样本
Control sample
胁迫处理样本
Osmotic-stressed sample
总 Clean read数 Total clean read number 7353651 (100%) 7422178 (100%)
Mapped reads 79.52% 79.00%
Perfect match 58.68% 65.15%
<2 bp mismatch 20.85% 14.37%
Unique match 65.15% 66.57%
Multi-position match 14.37% 12.43%
Unmapped reads 20.85% 21.00%

表 2 玉米叶片表达谱 unique reads拷贝数分布
Table 2 Distribution of unique reads with different copies expressed in maize leaves
对照样本 Control sample 渗透胁迫样本 Osmotic-stressed sample
拷贝数
Copy number
Read种类
Read
species
所占比例
Percentage
(%)
Read数量
Read
number
所占比例
Percentage
(%)
Read种类
Read
species
所占比例
Percentage
(%)
Read数量
Read
number
所占比例
Percentage
(%)
Total read number 27 665 100.00 2 410 116 100.00 29 190 100.00 2 478 836 100.00
<5 11 129 40.23 21 495 0.89 11 319 38.78 22 048 0.89
5–10 3721 13.45 24 735 1.03 3910 13.39 26 204 1.06
10–20 2933 10.60 40 459 1.68 3170 10.86 43 517 1.76
20–50 3540 12.80 113 499 4.71 3626 12.42 116 464 4.70
50–100 2438 8.81 173 055 7.18 2607 8.93 187 010 7.54
100–500 3225 11.66 256 086 10.63 3771 12.92 297 262 11.99
500–1000 405 1.46 275 372 11.43 515 1.76 349 724 14.11
>1000 274 0.99 1 079 855 44.81 272 0.93 927 970 37.44

第 7期 葛淑娟等: 玉米响应渗透胁迫的数字基因表达谱分析 1167


准, 渗透胁迫处理样本与对照样本之间有 1097个基
因表现为差异表达, 其中 302个DEGs在渗透胁迫条
件下表达下调, 795个 DEGs表达上调, 后者明显高
于前者(图 1)。
由图 2 可以看出, 基因表达差异高度不均一,
表达水平变化主要集中在 10倍以内, 占差异表达基
因总数的 89.15%。其中, 表达上(下)调 2~5 倍的基
因占差异表达上(下)调基因总数的 71.82% (82.45%),
表达上(下)调 5~10倍的基因占 14.97% (12.91%), 表
达上(下)调 10~100 倍的基因占 10.19% (4.30%), 表
达上(下)调 100倍以上的基因占 3.02% (0.33%)。相
比而言, 上调基因的表达增强幅度更大, 表达上调
10 倍以上的基因所占比例是表达下调 10 倍以上基
因所占比例的 2.85倍。

图 1 正常和渗透胁迫条件下玉米差异表达基因分布
Fig. 1 Distribution of differentially expressed genes in maize
under control and osmotic stress

图 2 玉米渗透胁迫差异表达基因统计分析
Fig. 2 Statistical analysis of differentially expressed genes in
maize under osmotic stress

2.4 差异表达基因的 GO分类和显著性富集分析
在 GO 功能显著性富集分析中, 通过与参考基
因比较, 从 GO数据库中筛选出差异表达基因的 GO
分类条目, 可以寻找与基因表达差异相关的主要特
征功能分类。在从数据库中查询到校正 P≤1.0 的
496 个 GO 分类信息条目中, 细胞位置组分(cellular
component)、基因的分子功能(molecular function)和
参与生物过程 (biological process)三类条目分别占
31.82%、11.87%和 56.31%, 校正 P 值小于 0.5 的部
分 GO分类条目见图 3。以校正 P≤0.05为显著性富
集标准, 在细胞组分分类信息中, 有 3个分类条目达
到显著性富集, 分别为膜内在组分(GO: 0031224)、膜
组分(GO: 0044425)和类囊体组分(GO: 0044436)。在
分子功能分类信息中, 也有 3 个条目达到显著性富集,
分别为糖基转移酶活性(GO: 0016757)、葡萄糖基转
移酶活性 (GO:0046527)和己糖基转移酶活性 (GO:
0016758), 说明渗透胁迫下玉米叶片中的糖基转移
反应受影响较大。在生物过程分类信息中, 未获得
显著性富集的条目。
在渗透胁迫下高水平差异表达 100倍以上的 25
个注释基因中, 只有 GRMZM2G092747一个假定蛋
白(hypothetical protein)基因表达下调(表 3)。在表达
上调基因中, 除 8 个假定蛋白基因外, 其他 16 个基
因的功能涉及以下 3个方面: (1)基础代谢。参与糖代
谢的差异表达基因有 4个, 分别编码呋喃果糖苷酶
(GRMZM2G089836)、含淀粉结合结构域的 CBM家
族蛋白(GRMZM2G161534)、棉籽糖合酶(GRMZM2
G340656)和 PEP 羧激酶(GRMZM2G178074)。参与
脂代谢的差异表达基因有 3个 , 即脂基转移蛋白
(GRMZM2G058208)、甘油-3-磷酸转运蛋白(GRMZM
2G124136)和羧酸酯酶 (GRMZM2G391795)。另外 ,
EDL3蛋白(GRMZM2G389301)参与调节蛋白降解。
(2)转录因子。包括 NAC 转录因子 (GRMZM2
G146380)、AP2/EREBP基因家族(GRMZM2G319786)
和 HD-ZIP因子(GRMZM2G117164)。(3)其他逆境响
应因子。有蛋白磷酸化酶 PP2C(GRMZM2G159811)、
BAX1 抑制因子 (GRMZM2G014672)、ABC(ATP-
binding cassette)转运体(GRMZM2G167658)、生长素
响应因子(GRMZM2G460861)和功能未知的胁迫响
应膜蛋白(GRMZM2G179462)。
2.5 差异表达基因的代谢分析
在 KEGG数据库中对差异表达基因进行功能注
释和分类, 通过显著性富集能确定差异表达基因参
与的主要生化代谢和信号转导途径。结果表明, 差
异表达基因分布在 110 个分类代谢途径中。这些差
异表达基因广泛涉及基础物质代谢、次生代谢、能
量代谢、激素代谢及信号转导途径(图 4)。受 KEGG
数据库注释信息量的限制, 只有 68.09%的差异表达
基因可以详细注释到具体的代谢路径图中。其中与
1168 作 物 学 报 第 40卷



图 3 渗透胁迫差异表达基因的 GO分类
Fig. 3 GO categories of differentially expressed genes under osmotic stress

表 3 玉米渗透胁迫差异表达 100倍以上的基因
Table 3 Genes differentially expressed more than 100 folds under osmotic stress
基因名称
Gene name
log2比值
log2 ratio
基因注释
Gene annotation
GRMZM2G159811 11.48 protein phosphatase 2C
GRMZM2G389301 11.14 EID1-like protein 3 (EDL3)
GRMZM2G125813 10.87 hypothetical protein
GRMZM2G058208 10.69 lipid-transfer protein
GRMZM2G179462 10.47 stress responsive protein
GRMZM2G146380 10.39 NAC transcription factor 30
GRMZM2G115127 10.38 hypothetical protein
GRMZM2G383338 10.31 hypothetical protein
GRMZM2G542272 10.00 hypothetical protein
GRMZM2G178074 9.96 phosphoenolpyruvate carboxylase kinase
GRMZM2G124136 9.68 glycerol-3-phosphate transporter
GRMZM2G460861 9.40 SAUR-like auxin-responsive protein
GRMZM2G391795 9.34 carboxylesterase15
GRMZM2G319786 9.15 AP2/EREBP transcription factor
GRMZM2G016586 9.12 hypothetical protein
GRMZM2G167658 9.10 ABC transporter
GRMZM2G014672 8.99 BAX inhibitor
GRMZM2G001451 8.66 hypothetical protein
GRMZM2G161534 8.63 starch binding domain protein
GRMZM2G106344 8.63 hypothetical protein
GRMZM2G339327 7.97 hypothetical protein
GRMZM2G340656 7.75 raffinose synthase
GRMZM2G117164 7.57 homeobox-leucine zipper protein
GRMZM2G089836 6.76 beta-fructofuranosidase
GRMZM2G092747 −9.88 hypothetical protein
第 7期 葛淑娟等: 玉米响应渗透胁迫的数字基因表达谱分析 1169



图 4 玉米渗透胁迫差异表达基因的代谢功能分类
Fig. 4 Metabolic classification of differentially expressed genes in maize under osmotic stress

糖类、蛋白(含氨基酸)、脂类和核酸等 4类生物大分
子代谢相关的基因共占差异表达基因总量的 32.19%,
次生代谢相关的基因占 16.71%, 激素代谢相关基因
也较多(7.88%), 氧化磷酸化、光合作用和细胞活动
相关基因所占比例相对较低。在 Q≤0.05 为标准的
显著性富集分析中, 达到显著水平的代谢途径可以
分成以下 5类: (1)次生代谢。包括类黄酮、花色素、
生物碱、萜烯类次生代谢物等的合成和降解。(2)激
素代谢和信号转导途径。包括传统五大类激素、油
菜素内酯及茉莉酸代谢。(3)转运体代谢。多种 ABC
转运体代谢发生改变。(4)光合作用。如天线蛋白、
叶绿素和光合电子传递体代谢。(5)渗透调节途径。
如糖代谢和脯氨酸合成代谢途径。
脯氨酸是渗透胁迫下积累的重要渗透调节物质,
高等植物体内脯氨酸合成根据底物不同主要有谷氨
酸途径和鸟氨酸途径两条途径。差异表达基因的
KEGG 代谢途径分析表明, 在精氨酸和脯氨酸代谢
途径(ko00330)中, 有 5 个脯氨酸代谢相关基因的表
达超过 2倍以上(表 4)。吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)
和吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是谷氨酸向脯氨酸转
化的 2 个关键酶, 这两个基因均被胁迫诱导表达,
且限速酶 P5CS 上调达 10 倍以上; 而逆向代谢中的
脯氨酸脱氢酶基因表达下调 4.29倍。鸟氨酸途径的
关键酶鸟氨酸转氨酶(OAT)基因表达没有检测到明
显变化, 谷氨酸-N-乙酰转移酶基因表达下调, 说明
谷氨酸向鸟氨酸转化过程受到抑制。精氨酸脱羧酶
基因的表达上调暗示精氨酸向鸟氨酸的转化也间接
受到抑制。这些脯氨酸代谢相关基因的差异表达表
明, 在玉米响应渗透胁迫过程中, 谷氨酸途径可能
是脯氨酸积累的主要合成途径。
2.6 差异表达基因的 qRT-PCR荧光定量验证
随机筛选3个差异表达上调基因 GRMZM 2G125-
813、GRMZM2G178074、GRMZM2G339327进行
qRT-PCR 验证。玉米幼苗按表达谱胁迫条件进行
PEG渗透胁迫处理后提取总 RNA, 反转录后进行定
量 PCR扩增。结果表明, 3个基因在胁迫处理后发生
不同程度的表达(图5)。尽管 qRT-PCR分析得到的表
达差异与表达谱分析的表达差异倍数不一致, 但胁
迫诱导表达的变化趋势相同, 说明基因表达谱的分
析结果可靠。

表 4 脯氨酸代谢相关差异表达基因
Table 4 Differentially expressed genes involving in proline metabolism
基因名称
Gene name
log2比值(胁迫/对照)
log2 Ratio of stress/control
基因注释
Gene annotation
GRMZM2G387394 −2.24 glutamate N-acetyltransferase
GRMZM2G382785 1.67 pyrroline 5-carboxylate reductase (P5CR)
GRMZM5G833124 −2.09 proline dehydrogenase
GRMZM2G053720 3.47 pyrroline-5-carboxylate synthetase(P5CS)
GRMZM2G374302 3.05 arginine decarboxylase
1170 作 物 学 报 第 40卷



图 5 差异表达基因的 qRT-PCR验证
Fig. 5 Validation of the differentially expressed genes by
qRT-PCR
3 讨论
在干旱、盐碱等产生的渗透胁迫下, 植物通过
改变基因的表达, 调控不同代谢途径和信号转导途
径, 从转录和翻译等不同水平作出响应。通过高通
量测序产生的数字基因表达谱分析获得了转录水平
上 32 208个基因的真实序列信息, 通过其拷贝数的
不同直接反映相应基因的表达差异, 筛选出 1097个
差异表达基因。尽管由于 read 测序长度较短, 大多
数注释基因的覆盖度较低, 对照样本和胁迫处理样
本分别有近 66%和 75%的注释基因的覆盖度低于一
半, 覆盖度超过 80%的注释基因只有 10%左右。但
对于参考已知的基因组进行基因注释, 基本能够满
足要求。尽管由于基因型的差异, 测序所得 reads中
有近 1/5 与参考基因组差异较大 , 但有近 60%的
reads 与参考基因组序列完全相同, 说明物种内遗传
基础相对比较保守。
在测序所得基因中 , 虽然渗透胁迫下只有
3.41%的基因的表达水平发生变化 , 但这些差异表
达基因表现出广泛的功能多样性。在 GO 功能分析
中, 差异表达基因涉及线粒体、叶绿体、细胞核和
染色体、核糖体等几乎所有细胞组分, 包含了各种
转移酶、水解酶、氧化还原酶、合成酶和异构酶等
各种酶活性, 参与四类生物大分子和各种次生物质
代谢、能量转换、跨膜运输、信号传递及其调节等
各种生物过程。这说明植物转录系统是相对稳定的,
同时又是高度灵敏的一个开放式表达调控体系。
在渗透胁迫下高水平诱导表达(>100 倍)的基因
中, 参与糖代谢、脂类代谢和蛋白代谢等基础代谢
过程的基因占很大比重。含有淀粉结合结构域的
CBM家族蛋白、棉籽糖合酶、呋喃果糖苷酶和 PEP
羧激酶基因的表达上调可以改变各种可溶性糖组成
和含量, 是植物响应胁迫进行渗透压调节的一种重
要方式[12-15]。脂基转移蛋白通过调节脂质合成和运
输影响植物逆境适应性, 如水稻超表达 OsDIL 基因
后抗旱能力明显增强[16-17]; 甘油-3-磷酸转运蛋白属
于 MSF (major facilitator superfamily)家族成员, 可
以通过调节磷酸甘油向细胞质的运输影响磷脂代谢
和糖酵解[18]; 羧酸酯酶通过调节脂质水解水平改变
多种生物和非生物胁迫抗性[19]。作为泛素蛋白降解
系统中的 SCF泛素连接酶复合物组分, EDL3蛋白通
过调节蛋白降解参与 ABA依赖的干旱、盐等逆境信
号转导过程[20]。其次, NAC等 3种高水平表达上调
的转录因子都是典型的逆境胁迫响应因子。NAC转
录因子是植物特有的一类转录因子, 不仅参与植物
生长发育的调控, 而且在各种植物抗逆反应中具有
重要的调控作用, 如玉米 ZmSNAC1基因能显著增强
转基因拟南芥的脱水耐性, 水稻 SNAC 基因在小麦
中超表达也可以提高其干旱和盐抗性 [21-22]。
AP2/EREBP 家族转录因子在植物中分布广泛, 在调
控植物发育和低温、干旱、盐等胁迫抗性中发挥重
要作用, 如过量表达 OPBP1基因可以显著提高烟草
的抗病和抗盐能力 , 而棉花 GhDREB 基因过量表
达可以提高小麦的干旱、高盐和冻害等多种胁迫
抗性 [23-25]。HD-ZIP 是响应渗透胁迫的代表性转录
因子, 在玉米基因组中至少有四类共 55个 HD-Zip
基因, 其中 17个玉米 I类 HD-Zip基因中有 12个受
干旱诱导上调[26]。在向日葵中过量表达 HaHB1 和
AtHB13 两种 HD-Zip 基因可以通过诱导表达膜稳定
蛋白从而提高其对干旱和盐的抗性[27]。此外, 蛋白
磷酸化酶 PP2C 是各种逆境胁迫信号激活的激酶信
号通路中一种代表性的调控因子 , 如拟南芥
AtPP2CG1 过量表达后可以提高耐盐能力 , 玉米
ZmPP2C2 基因在烟草中超表达可以提高其低温抗
性[28-30]。BAX1 抑制因子是内质网胁迫响应标记基
因, 可以抑制各种生物或非生物胁迫导致的细胞程
序化死亡[31]。ABC转运体可以通过改变植物激素和
次生代谢物运输、气孔调节等方式影响植物逆境胁
迫抗性, 如拟南芥超表达 AtABCG36 基因可以提高
干旱和盐等胁迫抗性 [32]。在玉米基因组中至少有
130个 ABC转运体基因[33]。上述基因的功能分析表
明, 胁迫响应基因具有广泛的功能多样性。另一方
面, 其中大多数基因可以参与多种生物或非生物逆
境响应过程, 也说明不同逆境胁迫响应途径有一定
的共通性。
植物可以通过多种代谢调节增加对逆境的抗
性。在玉米响应渗透胁迫的代谢响应过程中, 这些
第 7期 葛淑娟等: 玉米响应渗透胁迫的数字基因表达谱分析 1171


防御机制主要表现为以下几个方面: (1)通过激素受
体及其调控的转录因子的差异表达, 系统调节植物
激素平衡[34]。生长素调控转录因子 ARF、细胞分裂
素受体 CRE1、ABA调控转录因子 ABF、赤霉素受
体 GID1和油菜素内酯受体 BRI1基因表达上调, 而
生长素受体 AUX/IAA、ABA受体 PYR/PYL、赤霉
素调控 DELLA 蛋白、乙烯调控转录因子 ERF1 和
茉莉酸调控转录因子MYC2基因表达抑制, 说明渗
透胁迫响应是受多种激素共同调控的结果。(2)渗透
调节剂的积累是植物提高渗透胁迫逆境适应能力
最直接的方式。吡咯啉-5-羧酸还原酶和吡咯啉-5-
羧酸合成酶基因的表达上调说明脯氨酸在胁迫诱
导下快速积累[35]。淀粉酶、β-呋喃果糖苷酶、β-葡
萄糖苷酶、β-D-木聚糖合成酶、蔗糖合成酶、乙醛
还原酶、半乳糖醛酸转移酶等基因表达上调, 说明
渗透胁迫诱导多糖降解, 而棉籽糖、蔗糖、果糖、
甘露糖、阿拉伯糖、木糖等可溶性寡糖和单糖大量
积累。脯氨酸和可溶性糖的积累都有利于调节胁迫
下渗透压的稳定[36]。(3)通过提高抗氧化能力减轻胁
迫产生的活性氧伤害 [37]。过氧化氢酶(CAT)等抗氧
化酶及抗坏血酸、维生素 E、类黄酮、GSH等非酶
抗氧化剂合成代谢途径中的关键酶基因均表现为
诱导表达, 说明渗透胁迫下多种抗氧化机制协同发
挥作用。(4)通过蛋白质量控制减轻胁迫伤害 [38]。
HSP、DnaJ和 Clp等众多分子伴侣蛋白基因的诱导
表达说明蛋白损伤修复系统能够对渗透胁迫作出
快速响应, 而 EDL3 等蛋白降解系统的激活可以及
时清除损伤蛋白。
上述代谢响应的多样性说明玉米对渗透胁迫的
应答是多种代谢途径和信号通路共同作用的结果。
要对玉米的渗透胁迫抗性进行遗传改良, 不是调控
单个基因的功能可以独立完成的, 这可能也是目前
通过基因工程手段进行玉米抗旱、抗盐等遗传改良
不能进入生产应用的主要限制因素。通过玉米响应
渗透胁迫的数字基因表达谱分析, 有助于系统理解
渗透胁迫条件下各代谢途径的相互作用关系, 为阐
述玉米渗透胁迫抗性形成的分子机制, 筛选主效基
因提供了理论基础。
4 结论
通过玉米渗透胁迫表达谱分析鉴定出 1097个差
异表达基因, 其中 795 个在渗透胁迫下表达上调,
302 个在渗透胁迫下表达下调, 在表达上调基因中
82.45%表达上调 2~5倍。差异表达基因广泛涉及糖、
蛋白、核酸和脂类等生物大分子代谢、次生代谢、
激素代谢和能量代谢等过程。谷氨酸途径是渗透胁
迫下脯氨酸积累的主要合成途径。
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