全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 1054−1059 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31040058)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 田怀东, E-mail: huaidongt@sxu.edu.cn
Received(收稿日期): 2012-12-04; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-03-22.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130322.1737.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01054
新型水稻 57H突变体的发掘与表征
车倩倩 1 郭艳萍 1 李 强 1 王益华 2 王广元 3 田怀东 1,*
1 山西大学生命科学学院, 山西太原 030006; 2 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 3 山西省作物科
学研究所, 山西太原 030031
摘 要: 在正常型水稻的发育种子中, 谷蛋白与醇溶蛋白在胚乳细胞内质网被合成后, 作为主要储藏蛋白质分别被
蓄积成液泡型蛋白体与内质网衍生型蛋白体。一些 57H变异导致 57 kD谷蛋白前体高量增加与成熟型谷蛋白显著减
少, 是关于水稻储藏蛋白蓄积的基因突变。本研究采用 SDS-PAGE 技术, 从水稻种质资源中, 发现并获得 2 个 57H
突变体。种子全蛋白的 SDS-PAGE分析显示, 这 2个突变体兼具 57 kD多肽链大量增加与 13 kD多肽链缺失的性状,
但并没有成熟型谷蛋白等其他储藏蛋白性状的变化; 谷蛋白电泳与免疫印染分析显示其高量增加的多肽链是 57 kD
谷蛋白前体; 醇溶蛋白电泳分析显示它们中缺失的多肽链是 13 kD 醇溶蛋白。这些结果表明所得的 2 份突变体具有
与已报道 57H 突变体不同的性状, 它们可能含有关于储藏蛋白质合成表达的未知遗传信息, 是全面阐明储藏蛋白合
成蓄积遗传调控机制的有用素材。
关键词: 水稻; 胚乳; 储藏蛋白质; 新型 57H突变体
Excavation and Characterization of Novel Rice 57H Mutants
CHE Qian-Qian1, GUO Yan-Ping1, LI Qiang1, WANG Yi-Hua2, WANG Guang-Yuan3, and TIAN Huai-Dong1,*
1 College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2 State Key Laboratory for Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nan-
jing 210095, China; 3 Shanxi Institute of Crop Science, Taiyuan 030031, China
Abstract: Glutelins and prolamins, the main rice storage proteins, are synthesized in the ER and accumulated into the vacuolar
protein body and the ER-derived protein body in endosperm cell of the developing seed of the wild type rice, respectively. Several
57H mutations have been found to cause the high increase of 57 kD glutelin precursor and the remarkable decrease of the mature
glutelins, and involved in the accumulation of storage proteins in rice. In this study, two 57H mutants were newly found and ob-
tained from rice germplasms using SDS-PAGE technique. SDS-PAGE analysis of the total seed proteins showed that the two mu-
tants had the characters namely the great increase of 57 kD polypeptide and the lack of 13 kD polypeptide, but not alteration of
characters for the mature glutelins and other storage proteins; Electrophoretic and immuno-blotting analyses of glutelin showed
that the increased polypeptides was 57 kD glutelin precursor in the mutants; Electrophoretic analysis of prolamins showed that the
lacked polypeptide was 13 kD prolamin in them. It is indicate that the two mutants have novel characters distinct from the re-
ported 57H mutants. They probably contain unknown genetic information for synthesis and expression of storage proteins, and are
considered to be useful materials for the overall understanding of genetic mechanism regulating synthesis and accumulation of the
storage proteins in rice.
Keywords: Rice; Endosperm; Storage proteins; Novel 57H mutants
水稻是主要的粮食作物, 其种子储藏蛋白质是
人体维持正常生理机能的重要氨基酸源。醇溶蛋白
与谷蛋白作为水稻储藏蛋白质的主要成分, 分别占
种子全蛋白质含量的 20%和 70%左右[1], 是直接影
响稻米营养品质的重要物质。
在发育的水稻胚乳细胞中, 醇溶蛋白与谷蛋白
在糙面内质网(ER)分别由各自多基因家族的mRNA
编码合成后, 经过不同的亚细胞途径, 以不同的蛋
第 6期 车倩倩等: 新型水稻 57H突变体的发掘与表征 1055


白体(PB)形态被蓄积起来[2]。13~14 kD醇溶蛋白是
主要的醇溶蛋白, 它们被编码合成后, 经过肽链的
装配与浓缩, 被蓄积成内质网衍生的PB-I [3-5]。水稻
谷蛋白多肽链由10个以上结构基因编码合成后, 经
过立体构造、肽链装配等修饰形成57 kD前体多肽链,
被包进小泡; 依靠蛋白质小泡的转运, 经过或者避
开高尔基体 , 进入液泡; 在液泡里 , 前体多肽链被
内切形成成熟型的40 kD酸性组分和20 kD碱性组分,
最终被蓄积成液泡型PB-II [6-7]。在水稻胚乳的两型
蛋白体中 , PB-I是致密的不溶于水溶液的球状体 ,
而PB-II是易消化的不规则形蛋白体。由此可见, 储
藏蛋白质的合成蓄积过程和水稻蛋白质的营养品质
有密切关系。阐明调控这个生理过程的遗传机制 ,
对于改善水稻蛋白的营养品质具有重要的理论指导
和实践意义。
57 kD多肽链高量增加的57H突变体被认为是
研究水稻胚乳储藏蛋白质合成与蓄积的理想材料。
Tian等 [8-9]与Wang等[10-11]分别通过水稻品种MNU诱
变后代的筛选与水稻种质资源的筛选, 获得了谷蛋
白前体高量增加、成熟型谷蛋白显著减少的系列
57H突变体[8-11]。目前, 导致谷蛋白前体高量增加、
成熟型谷蛋白显著减少的4个隐性非等位57H变异
已被表明是调控储藏蛋白质蓄积的基因突变。Tian
等 [9]通过57H变异的等位性鉴定与机能解析 , 发现
了glup6基因变异 , 表明了glup6导致高量的谷蛋白
前体与醇溶蛋白蓄积在内质网衍生的变异型PB中,
指出了glup6阻碍谷蛋白前体与醇溶蛋白在ER的翻
译后区室化。Wang等[10-11]进行W379和gpa1突变性状
的遗传学研究与机能解析, 发现了W379变异是内切
谷蛋白前体的液泡内切酶(OsVPE1)的错义突变、而
gpa1性状起因于控制胚乳细胞的膜系统组织化及谷
蛋白亚细胞输送的OsRab5a基因突变。Takemoto等[12]
报道了esp2突变体中谷蛋白前体与醇溶蛋白的二硫
键结合以及分子伴侣(PDI)的缺失。这些研究进展促
进了水稻储藏蛋白蓄积机制的解明。然而, 水稻储
藏蛋白的合成与蓄积是一个紧密相接的生理过程 ,
全面阐明这个生理过程的遗传调控机制是一项长期
而系统的工程。为此, 有必要开发并解析更加多样
的57H突变体。
本研究采用SDS-PAGE技术, 对来源于国内外
的410份水稻种质进行筛选 , 最终发现并表征了兼
具57 kD谷蛋白前体高量增加与13 kD醇溶蛋白缺失
性状的2个新型57H突变体。
1 材料与方法
1.1 植物材料
选择来源于中国与外国的主要水稻栽培地域、
具有多样胚乳性状的水稻种质 410 份, 使用其种子
作为筛选材料(表 1)。
1.2 方法
1.2.1 种子蛋白质的提取 参照 Tian 等[12]的方
法, 分别配制含有 4% (W/V) SDS、4 mol L−1 Urea、
5% (V/V) 2-Me、2 mmol L−1 PMSF、1.5 mmol L−1
EDTA、0.125 mol L−1 Tris (pH 6.8)的种子全蛋白提
取缓冲液, 含有 1%乳酸的谷蛋白提取液, 含有 5%
2-Me、60% 1-propanol的醇溶蛋白提取液, 含有 10
mmol L−1 Tris、0.5 mol L−1 NaCl (pH 6.8)的球蛋白提
取缓冲液。分别将 0.025 g种子粉末悬浮于 1000 µL
的上述提取液, 经各自适当条件下的震荡、超声、
静置、离心等处理后, 提取种子全蛋白、谷蛋白、
醇溶蛋白与球蛋白组分, 所得蛋白用于 SDS-PAGE。
1.2.2 种子蛋白质的 SDS-PAGE 参照 Tian等的
方法[8], 使用 15%的聚丙烯酰胺凝胶对上述所提蛋
白进行 SDS-PAGE。使用含有 0.1% (W/V) CBB
R-250、50% (V/V) Methanol、10% (V/V) Acetic acid
的染色液进行凝胶染色, 使用含有 25% Methanol、
10% Acetic acid的脱色液进行凝胶脱色。使用凝胶
成像系统 (Gene Genius; SynGene Ltd. Cambrige,
England)与软件(Syngene GeneTools Analysis Soft-
ware-Version 3.02), 进行凝胶图像分析。
1.2.3 抗体制备与免疫印染 采用制备电泳技术
精致 20 kD谷蛋白碱性组分。将所得组分注入新西
兰大耳白兔体内, 进行 3 次免疫诱起。从免疫兔的
耳静脉采血, 经纯化, 获得抗谷蛋白碱性组分抗体。
采用间接 ELISA法检测所得抗体的效价。参照 Tian
等[10]的方法, 采用 SDS-PAGE 技术, 将种子全蛋白
分离在 10%的聚丙烯酰胺凝胶上; 将分离的蛋白转
印到硝酸纤维素膜上, 进行抗谷蛋白碱性组分抗体
的免疫反应; 使用 BM purple (Biochemical Company,
Roche, Germany), 进行免疫反应的可视化。

1056 作 物 学 报 第 39卷

表1 供试种质资源信息
Table 1 Informations of germplasm resources used in this study
来源地
Origin
数目
Number
籽粒性状
Grain traits
中国山西
Shanxi, China
40 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国海南
Hainan, China
30 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国四川
Sichuan, China
40 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国黑龙江
Heilongjiang, China
30 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国宁夏
Ningxia, China
30 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒, 长粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big, long
中国北京
Beijing, China
40 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国辽宁
Liaoning, China
60 正常, 黑粒, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, black, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国吉林
Jilin, China
30 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国湖南
Hunan, China
35 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
中国福建
Fujian, China
55 正常, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 大粒
Wild, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, big
美国
USA
1 正常
Wild
日本
Japan
13
褐粒, 绿粒, 糯性, 乳浊, 皱缩, 心白, 粉质, 短圆粒, 巨大胚
Brown, green, waxy, dull, shrunken, white-heart, powder, short-round,
giant-endosperm
中非
Central Africa
3 正常
Wild
泰国
Thailand
1 正常
Wild
印度
India
1 红胚乳
Red endosperm
巴西
Brazil
1 正常
Wild

2 结果与分析
2.1 新型水稻 57H突变体的发掘
在水稻种子储藏蛋白质 SDS-PAGE 凝胶上, 57
kD、40 kD、26 kD、20 kD以及 14 kD与 13 kD多
肽链条带分别对应于谷蛋白前体、谷蛋白酸性组分、
球蛋白、谷蛋白碱性组分以及主要醇溶蛋白。采用
种子全蛋白的 SDS-PAGE 技术, 对来源地域广泛、
具有多样籽粒外观性状的 410份水稻种质进行筛选。
“辽盐 6 号”具有正常型种子外观性状(图 1), 凝胶上
在条带组成及其相对含量方面显示了正常型种子蛋
白质性状(图 2和图 3), 因而被作为正常型品种用于
其他种质种子蛋白质性状的分析。与辽盐 6号相比,
发现 5 份种质(用于水稻品种培育的中间材料)含有
高量增加的 57 kD多肽链。通过分析这 5份种质的
3代自交后代的种子储藏蛋白表型, 确定其中 2份种
质兼具 57 kD多肽链高量增加与 13 kD多肽链缺失
的可遗传变异性状。这样的变异性状不同于已报道
的谷蛋白酸性与碱性组分显著减少的 57H 变异性
状。种子全蛋白质的电泳图谱分析结果显示, 这 2
个突变体中 57 kD多肽链的相对含量是辽盐 6号中
相应多肽链含量的 3倍左右(图 3)。
第 6期 车倩倩等: 新型水稻 57H突变体的发掘与表征 1057



图1 正常型水稻品种(辽盐6号)与新型57H突变体的胚乳外观性状
Fig. 1 Appearance characters of endosperms of the normal type rice cultivar (Liaoyan 6) and novel 57H mutants
1为辽盐 6号; 2和 3为突变体。1: Liaoyan 6; 2, 3: novel mutants.



图2 正常型水稻品种(辽盐6号)与新型57H突变体的种子全蛋
白质的SDS-PAGE图
Fig. 2 SDS-PAGE profile of the total seed proteins in the normal
type rice cultivar (Liaoyan 6) and novel 57H mutants
1为辽盐 6号; 2和 3为突变体。
1: Liaoyan 6; 2 and 3: novel mutants; M: marker.
2.2 新型 57H突变体种子储藏蛋白质性状的表征
为了证明所发掘的新型57H突变体中的多肽链
性状变化起因于相应储藏蛋白质的性状改变, 分别
进行了胚乳谷蛋白、醇溶蛋白与球蛋白性状的
SDS-PAGE分析。与辽盐6号相比, 在谷蛋白电泳图
谱上, 新型57H突变体的57 kD谷蛋白前体组分的染
色水平显著增强, 成熟型的40 kD谷蛋白酸性组分
与20 kD谷蛋白碱性组分的染色水平没有明显变化
(图4-A); 醇溶蛋白电泳图谱显示新型57H突变体中
13 kD醇溶蛋白组分的缺失(图4-B); 球蛋白电泳图
谱显示其胚乳球蛋白性状没有明显变化(图4-C)。这
些结果与种子全蛋白分析结果一致, 指出了它们具
有不同于已报道57H突变体的储藏蛋白性状。
进一步使用抗20 kD谷蛋白碱性组分抗体 , 进
行了免疫印染分析。如图5所示, 抗20 kD谷蛋白碱
性组分抗体与辽盐6号、新型57H突变体中的谷蛋白
发生了特异性免疫反应 ; 与辽盐6号相比 , 与新型
57H突变体中的57 kD谷蛋白前体的反应水平显著
增强, 与其谷蛋白碱性组分的反应水平没有明显变
化。这些结果证实了这2个突变体中57 kD多肽链的
显著增加起因于谷蛋白前体的高量表达。


图3 正常型水稻品种(辽盐6号)与新型57H突变体种子中57 kD谷蛋白前体(A)、40 kD酸性谷蛋白(B)、26 kD球蛋白(C)、
20 kD碱性谷蛋白(D)、14 kD醇溶蛋白(E)、13 kD醇溶蛋白(F)的SDS-PAGE光密度分析
Fig. 3 SDS-PAGE densitometric analysis of 57 kD glutelin precursor(A), 40 kD acid glutelin(B), 26 kD globulin(C), 20 kD basic
glutelin(D), 14(E), and 13 kD(F) of prolam in seeds of the normal type rice cultivar (Liaoyan 6) and novel 57H mutants
1为辽盐6号; 2和3为突变体。1: Liaoyan 6; 2, 3: novel mutants.
1058 作 物 学 报 第 39卷


图4 正常型水稻品种(辽盐6号)和新型57H突变体种子谷蛋白(A)、醇溶蛋白(B)、球蛋白(C)的SDS-PAGE图
Fig. 4 SDS-PAGE profiles of glutelins (A), prolamins (B), and globulins (C) from the normal type rice cultivar (Liaoyan 6) and each
novel 57H mutant
1为辽盐6号; 2和3为突变体。1: Liaoyan 6; 2 and 3: novel mutants; M: marker.


图5 使用抗谷蛋白碱性组分抗体, 进行新型水稻57H突变体与
正常型水稻品种(辽盐6号)种子蛋白质的免疫印染分析
Fig. 5 Western-blotting analysis of the total proteins from a
single grain of the normal type rice cultivar (Liaoyan 6) and
each of novel 57H mutants by using the antibody against 20 kD
glutelin subunit
1为辽盐6号; 2和3为突变体。1: Liaoyan 6; 2 and 3: novel mutants.

3 讨论
在水稻胚乳细胞中, 谷蛋白与醇溶蛋白由各自
多基因家族编码, 在内质网被合成后, 分别蓄积成
液泡型PB-II与内质网衍生型PB-I。在水稻胚乳的两
型蛋白体中, PB-I是致密的不溶于水溶液的球状体,
而PB-II是易消化的不规则形蛋白体。开发并解析具
有多样水稻储藏蛋白性状的基因资源 , 对于水稻
储藏蛋白合成蓄积遗传调控机制的全面阐明以及
水稻蛋白营养品质多样化育种目标的实现具有重要
意义。
一些学者分别通过水稻品种MNU诱变后代的
筛选与水稻种质资源的筛选 , 获得了谷蛋白前体
高量增加、成熟型谷蛋白显著减少的系列57H突变
体[8-11]。截至目前, 导致谷蛋白前体高量蓄积、成熟
型谷蛋白蓄积显著减少的4个隐性的57H基因变异
(esp2, glup6, osvpe1, osrab5a)已被表明是调控储藏
蛋白质的翻译后蓄积的基因突变。本研究通过筛选
具有多样籽粒性状的水稻种质资源, 发掘出不同于
已报道57H突变性状的2个新型57H突变体。各储藏
蛋白组分的电泳分析与免疫印染解析结果显示这2
个突变体兼有谷蛋白前体高量增加、13 kD醇溶蛋白
缺失的性状(图2~图5)。我们认为它们可能含有关于
储藏蛋白合成表达的未知遗传信息, 期待其遗传学
研究能为水稻储藏蛋白合成蓄积的遗传调控机制的
全面阐明提供助力。
第 6期 车倩倩等: 新型水稻 57H突变体的发掘与表征 1059


水稻醇溶蛋白与其谷蛋白相比, 含有低量的赖
氨酸、高量的疏水性氨基酸与含硫氨基酸, 具有难
溶解的特点[13]。与豆类、燕麦等作物的主要种子蛋
白相比, 水稻储藏蛋白质有着低量的赖氨酸、较低
的消化性等营养缺陷[14]。这样的营养缺陷主要起因
于水稻种子中较高量醇溶蛋白的存在。与正常型水
稻品种相比, 本研究发掘的57H突变性状导致其储
藏蛋白总量约增加了4%、谷蛋白含量增加了7%左右,
因而它们的种子蛋白可能有着较高的营养值。
4 结论
从410份水稻种质资源中 , 发现并获得了兼具
57 kD谷蛋白前体高量增加与13 kD醇溶蛋白缺失性
状的2个新型57H突变体。它们可能含有关于储藏蛋
白合成表达的未知遗传信息, 可用于水稻储藏蛋白
合成蓄积遗传调控机制的研究。
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