全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(5): 667674 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31271691)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2013ZX08001-002)资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271691) and the Major Project of China on New Varieties
of GMO Cultivation (2013ZX08001-002).
* 通讯作者(Corresponding author): 潘刚, E-mail: pangang12@126.com ** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2015-09-12; Accepted(接受日期): 2016-01-11; Published online(网络出版日期): 2016-01-19.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160119.1327.014.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00667
水稻叶片早衰突变体 ospls3的生理特征和基因定位
龚 盼 1,** 黎坤瑜 1,** 黄福灯 2 韦荔全 1 杨 茜 1 程方民 1 潘 刚 1,*
1浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058; 2 浙江省农业科学院, 浙江杭州 310021
摘 要: 叶片衰老是作物叶片发育的最后阶段, 功能叶早衰将影响作物产量和品质, 因此, 研究叶片早衰的分子与
生理机制对于培育耐早衰优良品种具有重要意义。本研究利用 60Co-辐射诱变籼稻N142, 获得叶片早衰突变体 ospls3,
其叶片早衰始于分蘖期, 最先表现为叶尖变褐及叶中上部出现褐色斑点, 并向叶基部蔓延而使叶片枯死。生理分析表
明, 野生型剑叶的叶绿素含量显著低于倒二叶和倒三叶, 而突变体的含量则分别低于野生型且依次显著降低; 野生
型剑叶、倒二叶和倒三叶间的超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量、O2܋ 含量和
H2O2 含量基本不变, 而突变体的这些活性和含量则依次显著升高; 野生型剑叶、倒二叶和倒三叶的可溶性蛋白含量
和过氧化氢酶(CAT)活性变化不显著, 而突变体则依次降低。遗传分析表明, ospls3 突变性状受 1 对隐性基因控制。
借助图位克隆技术, 将该基因定位于第 12染色体长臂的 RM6953与 RM28753之间, 物理距离为 294 kb, 该结果为进
一步克隆 OsPLS3基因并研究其功能奠定了基础。
关键词: 水稻; ospls3; 叶片早衰; 生理分析; 基因定位
Physiological Characteristics and Gene Mapping of a Precocious Leaf Senes-
cence Mutant ospls3 in Rice
GONG Pan1,**, LI Kun-Yu1,**, HUANG Fu-Deng2, WEI Li-Quan1, YANG Xi1, CHENG Fang-Min1, and PAN
Gang1,*
1 College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou
310021, China
Abstract: Leaf senescence is the final stage of leaf development. However, premature aging of functional leaves leads to yield
reduction and quality decline. Thus, it is very important for developing novel crop germplasms with delayed leaf-senescence
characteristics through investigating the molecular mechanism of leaf senescence. In this study, an ospls3 (Oryza sativa preco-
cious leaf senescence 3) mutant, produced by 60Co γ-radiation treatment of indica cultivar N142, was identified. The symptoms of
the premature senescence mutant presented firstly at tillering stage showing brown leaf tip and brown spots in top part of leaf
blade, then spread rapidly to basal part of leaf blade and led leaf to die. The physiological analysis indicated that, in the ospls3
mutant, the content of chlorophyll was the highest in the flag leaf, the following was in second-top and third-top leaves, but all of
them were significantly lower than those in the wild type. The contents of MDA, O2܋ , and H2O2 and the activities of SOD and
POD among the top three leaves in the wild type maintained similar levels, which were significantly lower than those in the mu-
tant. The soluble protein contents and the activity of CAT had no significant difference among top three leaves in the wild type
while significantly decreased in the mutant. Genetic analysis verified that the ospls3 is a recessive mutant and was mapped in a
294 kb interval between RM6953 and RM28753 on the long arm of chromosome 12, which establishes a solid foundation for
further cloning and functional studies of this gene.
Keywords: Rice; ospls3; Precocious leaf senescence; Physiological analysis; Gene mapping
叶片衰老是植物生长发育的必经阶段, 也是植 物适应环境的一种重要表现[1-2]。水稻等主要农作物
668 作 物 学 报 第 42卷
在灌浆中后期功能叶早衰, 将导致其结实率显著降
低、空秕率增加[3]、产量下降及品质性状(垩白和整
精米率等)变劣等“负面”效应[4-5]。据报道, 水稻灌浆
后期功能叶每推迟1 d衰老, 理论上可增产2%左右,
实际能增产1%左右[6], 而且还能改善稻米品质[7]。
关于植物叶片衰老成因, 现已提出许多重要的
学术观点或理论假说, 包括自由基损伤说、基因调
控说、光碳失衡说、营养胁迫说和激素平衡说等[8]。
尽管这些假说都在一定程度上解释了叶片的衰老启
动及衰老进程, 但还未真正探明植物叶片衰老的机
制。利用化学诱变及转基因T-DNA插入技术获得叶
片早衰突变体是研究叶片早衰分子机制的重要手段
之一。基于突变体策略, 至今已从水稻中克隆了14
个叶片早衰基因 , 包括 UAP1[9]、 OsNAP[10]、
OsSIK2[11]、OsWRKY42[12]、OsABC1-2[13]、SGR[14-15]、
OsAkαGal[16]、RLS1[17]、nol1[18]、nyc1[19]、NYC3[20]、
NYC4[21]、SPL28[22]和OsLMS[23]。
本课题组利用60Co-辐射诱变中籼恢复系N142,
获得一个隐性叶片早衰突变体 , 暂命名为ospls3
(Oryza sativa precocious leaf senescence 3)。该突变体
叶片早衰表型在水稻分蘖期(约4~5片叶龄时)就开始
显现 , 之后随着叶龄的增加 , 除心叶外 , 其他叶片
均不同程度早衰; 孕穗后期后则所有叶片均早衰。
本文研究突变体ospls3的基本表型、生理变化及基因
定位, 以期为进一步克隆该基因并揭示其早衰的分
子和生理机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
叶片早衰突变体 ospls3, 经杭州和海南连续 8代
回交和自交, 获得突变性状稳定株系。之后以 ospls3
为母本, 分别与 N142 和粳稻 02428 杂交获得 F2群
体并用于遗传分析。所有材料均种植于浙江大学农
业试验站。水稻成熟后, 分别取 ospls3 及其野生型
对照 N142 各 20 株, 调查它们的株高、有效穗数、
每穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等主要农艺
性状。
1.2 生理指标测定
选取ospls3及其野生型对照N142各12株处于孕
穗期(剑叶叶枕与倒二叶叶枕平齐的分蘖)的剑叶、倒
二叶和倒三叶分别测定叶绿素含量、可溶性蛋白含
量、H2O2含量、超氧阴离子含量(O2܋ )、MDA含量、
CAT活性、SOD活性和POD活性。用碧云天过氧化
氢检测试剂盒(s0038)测定H2O2含量, 提取方法参见
说明书。参考《植物生理学实验技术》测定其他生
理指标[24], 每个指标测定3个重复。
1.3 遗传分析与基因定位
在大田分单株剪取 2014 年 ospls3/02428 的 F2
定位群体中具有突变体性状的早衰单株、双亲以及
F2群体中 10 株正常植株的叶片, 采用 CTAB 法[25]
提取基因组总 DNA。利用均匀分布于水稻 12 条染
色体的 500 对 SSR 标记, 其引物序列来自 Gramene
数据库(http://www.gramene.org/), 以及 Shen 等[26]所
开发的 50对 InDel标记进行基因定位。PCR总反应
体系为 20 μL, 含 0.8 U Taq DNA聚合酶、1 × PCR
buffer (Mg2+ Plus)、1 mmol L–1 dNTP Mixture、50 ng
DNA、上下游引物各 0.25 μmol L–1。PCR反应条件
为 95℃预变性 5 min; 94℃, 30 s; 55℃, 30 s; 72℃, 30
s, 共 35个循环; 72℃, 10 min。PCR产物经 8%非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察[27]。
1.4 遗传图谱构建
从786株的ospls3/02428 F2群体中获得190个具
有早衰性状的单株组成基因定位群体, 利用上述筛
选到的基因连锁分子标记进行基因定位。同时在
Gramene数据库查找基因连锁分子标记在染色体上
的具体物理位置以确定其排列顺序, 结合每个标记
的重组交换单株确定OsPLS3基因与连锁标记的顺
序, 构建基因定位图谱。
2 结果与分析
2.1 突变体 ospls3 与野生型 N142 的表型及其主
要农艺性状
突变体 ospls3的叶片在分蘖期就表现早衰性状
(图1-A), 除心叶外, 各叶位叶片完整展开5~7 d 后,
从叶尖和叶中上部开始出现褐色斑点(图1-D), 并向
叶基部迅速蔓延而使叶片枯死。孕穗后期所有叶片
均不同程度早衰(图1-B, C)。叶片早衰导致突变体
ospls3的主要农艺性状, 如株高、有效穗数、每穗粒
数、结实率、千粒重和单株产量分别比野生型下降
27.74%、32.03%、69.08%、71.35%、36.03%和95.12%
(表1)。
2.2 突变体 ospls3 与野生型对照 N142 的生理性
状
2.2.1 叶绿素含量 孕穗期突变体 ospls3 的剑
叶、倒二叶和倒三叶的叶绿素含量及叶绿素 a/b的值
依次显著下降(表 2), 倒二叶和倒三叶的总叶绿素含
第 5期 龚 盼等: 水稻叶片早衰突变体 ospls3的生理特征和基因定位 669
量分别比剑叶下降 7.02%和 53.24%。与野生型相比,
突变体 ospls3 的剑叶、倒二叶和倒三叶的总叶绿素
含量分别下降 22.78%、47.63%和 74.66% (表 2)。
2.2.2 SOD、POD和CAT的活性 图2表明突变体
倒二叶和倒三叶的SOD和POD活性显著高于野生型,
而CAT的活性则极显著低于野生型。相对于突变体
剑叶, 倒二叶和倒三叶的SOD活性分别增加12.03%
和21.79%, POD活性分别升高100.00%和100.76%,
而CAT活性则分别下降23.04%和47.76%。
2.2.3 超氧阴离子(O2܋ )含量和H2O2含量 图3-A
和B显示, 野生型剑叶、倒二叶和倒三叶间的O2܋ 含
量和H2O2含量无显著性差异, 与野生型相比, 突变
体ospls3剑叶、倒二叶和倒三叶的O2܋ 含量分别增加
15.88%、49.08%和194.30%, 而H2O2含量则分别增加
28.46%、22.79%和88.18%。
2.2.4 MDA和可溶性蛋白含量 图3-C显示, 野
生型的剑叶、倒二叶和倒三叶间的MDA含量和可溶
性蛋白含量无显著性差异, 与野生型相比, 突变体
ospls3剑叶、倒二叶和倒三叶的MDA含量分别增加
38.25%、39.96%和125.31% (图3-C); 而突变体除剑
叶外, 其倒二叶和倒三叶的可溶性蛋白含量分别下
降13.17%和31.83% (图3-D)。
图 1 不同生育期突变体 ospls3及其野生型的表型
Fig. 1 Phenotype of ospls3 and its wild-type (WT) plants at
different growth stages
A: 分蘖期; B: 抽穗期; C: 灌浆结实期; D: 抽穗期叶片(1~4代
表剑叶至倒四叶); Bar = 20 cm。
A: tillering stage; B: heading stage; C: filling stage; D: leaves at
heading stage (1–4 means the flag leaf to 4th leaf from top);
Bar = 20 cm.
表 1 突变体 ospls3及其野生型的农艺性状
Table 1 Agronomic traits of ospls3 and its wild-type (WT) plants
2013 2014 性状
Trait 野生型 WT 突变体 ospls3 野生型 WT 突变体 ospls3
株高 Plant height (cm) 112.32±2.83 81.19±2.56** 109.78±2.78 79.31±3.45**
有效穗数 Effective panicle number 11.52±2.43 7.34±1.25** 12.74±2.79 9.15±0.84**
每穗粒数 Grain number per panicle 175.79±24.84 47.71±9.17** 167.43±25.94 58.42±12.65**
结实率 Seed-setting rate (%) 88.05±3.92 28.85±2.84** 80.34±5.35 19.39±4.11**
千粒重 1000-grain weight (g) 25.33±0.79 16.65±1.13** 24.68±0.74 15.34±1.12**
单株产量 Yield per plant (g) 47.27±5.32 2.78±0.56** 44.35±7.72 1.69±0.42**
** 表示在 0.01水平上差异显著。** Significant difference at P<0.01.
表 2 孕穗期突变体 ospls3及其野生型叶片的叶绿素含量
Table 2 Chlorophyll content of leaves in ospls3 and its wild-type (WT) plants at booting stage
材料
Material
叶位
Leaf position
叶绿素 a
Chl a (mg g–1 FW)
叶绿素 b
Chl b (mg g–1 FW)
叶绿素 a/b
Chl (a/b) ratio
叶绿素 a+b
Chl (a+b) (mg g–1 FW)
剑叶 Flag leaves 11.74±0.40 5.00±0.28 2.35±0.05 16.97±0.69
倒二叶 2nd leaves from top 16.24±0.35** 6.70±0.32* 2.42±0.06 23.26±0.68**
野生型
WT
倒三叶 3rd leaves from top 16.18±0.36 7.69±0.72* 2.22±0.15 24.18±1.08
剑叶 Flag leaves 8.97±0.24 3.96±0.13 2.27±0.14 13.10±0.12
倒二叶 2nd leaves from top 8.13±0.57* 3.90±0.31 2.08±0.02* 12.18±0.89*
突变体
ospls3
倒三叶 3rd leaves from top 3.52±0.12** 2.24±0.27** 1.30±0.26** 6.13±0.68**
*表示在 0.05水平上差异显著; **表示在 0.01水平上差异显著。
*Significant difference at P<0.05; **Significant difference at P<0.01.
670 作 物 学 报 第 42卷
图 2 孕穗期突变体 ospls3及其野生型叶片的 SOD、POD和 CAT的活性
Fig. 2 SOD, POD, and CAT activities of ospls3 and its wild-type (WT) plants at booting stage
1: 剑叶; 2: 倒二叶; 3: 倒三叶。*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
1: flag leaves; 2: 2nd leaves from top; 3: 3rd leaves from top. *Significant difference at P<0.05; **Significant difference at P<0.01.
图 3 孕穗期突变体 ospls3及其野生型叶片的 O2܋ 、H2O2、MDA和可溶性蛋白含量
Fig. 3 O2܋ , H2O2, MDA, and soluble protein contents of ospls3 and its wild-type (WT) plants at booting stage
1: 剑叶; 2: 倒二叶; 3: 倒三叶。*表示在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
1: flag leaves; 2: 2nd leaves from top; 3: 3rd leaves from top. *Significant difference at P<0.05; **Significant difference at P<0.01.
第 5期 龚 盼等: 水稻叶片早衰突变体 ospls3的生理特征和基因定位 671
2.3 遗传分析与基因定位
ospls3/N142和 ospls3/02428两个杂交 F1单株的
叶色正常, 说明突变体叶片早衰性状是由隐性位点
控制。在 ospls3/N142 的 638 个 F2单株中, 有 153
株表现叶片早衰, 485株表现正常, 正常单株∶早衰
单株=3∶1 [χ2=0.30 < 3.84 (χ2(0.05, 1))]; 而在 ospls3/
02428 的 786 个 F2定位群体中, 正常单株为 596 株,
早衰单株为 190 株 , 正常单株∶早衰单株 = 3∶1
[χ2=0.24 < 3.84 (χ2(0.05, 1))]。遗传结果均符合孟德尔单
基因隐性遗传的分离比例, 从而证实突变体 ospls3
的叶片早衰症状受单隐性核基因控制。
为了定位OsPLS3基因, 分别选取ospls/02428 F2
群体中10株正常株和10株早衰突变株构建正常基因
池和突变基因池, 选取均匀分布于水稻12条染色体
上的SSR标记与InDel标记, 确定各标记与OsPLS3基
因的连锁关系。结果发现水稻第12条染色体上的
SSR标记RM28466、RM3739、RM1194及RM28826
与OsPLS3连锁。利用这4个标记对ospls3/02428的F2
群体中的190个早衰单株进行基因型分析 , 发现
RM28466、RM3739、RM1194和RM28826的交换单
株分别是50、19、16和21株。进一步在RM1194和
RM28826之间设计了16个SSR标记, 利用其中10个在
定位群体亲本间具多态性的标记将OsPLS3基因定位
在RM6953和RM28753之间, 物理距离为294 kb, 横
跨BX000457、AL731885和AL845347三个BAC (图4)。
其间有EST支持的开放阅读框 (ORF)为21个 (http://
rapdb.dna.affrc.go.jp/viewer/gbrowse/build5/) (表3)。
图 4 OsPLS3基因在第 12染色体长臂上的分子定位
Fig. 4 Molecular mapping of OsPLS3 gene on the long arm of
chromosome 12
表 3 定位区间内的基因及功能注释
Table 3 Gene names and their annotations in the target interval
基因号
Locus identifier
功能注释
Annotation
LOC_Os12g42200 Cation/hydrogen exchanger, putative, expressed
LOC_Os12g42210 OsDegp15-putative deg protease homologue, expressed
LOC_Os12g42220 Expressed protein
LOC_Os12g42230 Transketolase, putative, expressed
LOC_Os12g42240 Expressed protein
LOC_Os12g42250 ZOS12-10-C2H2 zinc finger protein, expressed
LOC_Os12g42260 Initiation factor 2 subunit family domain containing protein, expressed
LOC_Os12g42280 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 1, chloroplast precursor, putative, expressed
LOC_Os12g42300 Potassium efflux antiporter protein, putative, expressed
LOC_Os12g42310 Serine/threonine-protein phosphatase BSL2, putative, expressed
LOC_Os12g42330 Sublingual apomucin, putative, expressed
LOC_Os12g42370 GTPase of unknown function domain containing protein, putative, expressed
LOC_Os12g42380 Expressed protein
LOC_Os12g42390 Expressed protein
LOC_Os12g42400 Nuclear transcription factor Y subunit, putative, expressed
LOC_Os12g42420 DNA binding protein, putative, expressed
LOC_Os12g42430 IQ calmodulin-binding motif domain containing protein, expressed
LOC_Os12g42550 Methyl-CpG binding domain containing protein, putative, expressed
LOC_Os12g42570 Expressed protein
LOC_Os12g42590 Expressed protein
LOC_Os12g42600 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase domain containing protein
672 作 物 学 报 第 42卷
3 讨论
叶片衰老最明显的外在表现是叶片黄化, 而内
在生理生化变化则包括叶绿体降解、蛋白水解酶活
性增加、蛋白质降解、活性氧清除系统受到抑制、
自由基含量及丙二醛(MDA)含量急剧增加等[1,28]。本
研究利用辐射诱变获得叶片早衰突变体ospls3, 其
叶片早衰症状始于分蘖期(图1-A), 孕穗后期则所有
叶片均早衰(图1-B)。相对于野生型, 突变体ospls3
的剑叶、倒二叶和倒三叶的总叶绿素含量分别下降
22.78%、47.63%和74.66% (表2)。说明突变体的剑叶、
倒二叶和倒三叶均已衰老, 且衰老程度依次加重。
研究表明, 叶绿素a/b的值是衡量植物叶片光合效率
的重要生理指标之一[29]。本研究中与突变体剑叶相
比 , 其倒二叶和倒三叶的叶绿素a含量下降率均比
叶绿素b高(表2)。结果说明突变体叶片的光合效率将
受到抑制, 且叶绿素a比叶绿素b下降更快, 究其原
因, 可能是倒二叶和倒三叶中的活性氧离子含量显
著高于剑叶(图3-A), 导致叶绿素a对活性氧离子的
反应比叶绿素b更敏感[2,30]。
叶绿体是植物ROS (reactive oxygen species,
ROS)形成的主要场所, 伴随衰老叶片叶绿体的解体
以及其他逆境胁迫, 叶绿体中的电子传递链将受到
抑制, 致使1O2、H2O2和O2܋ 大量形成[31]。同时, 高
浓度的ROS不仅作用于脂质, 使其发生过氧化反应
而产生大量MDA, 加剧膜的损伤, 还通过细胞氧化
应激反应诱导细胞凋亡甚至坏死[32]。本研究中野生
型剑叶、倒二叶和倒三叶间的H2O2、O2܋ 和MDA含
量无显著差异, 而突变体的含量分别显著高于野生
型并依次增加(图3)。此外, 蛋白质含量特别是可溶性
蛋白质含量的下降是衡量叶片衰老的重要指标之一[1]。
本研究中野生型倒二叶和倒三叶的可溶性蛋白含量
极显著高于突变体, 说明突变体倒二叶和倒三叶明
显衰老。作为可溶性蛋白的抗氧化系统酶SOD、POD
和CAT, 担负着清除细胞内ROS并保护膜系统的重
任。野生型剑叶的CAT活性低于突变体(图-C), 其原
因可能是野生型剑叶尚未发育完全, 前人研究也显
示叶片完全发育前其CAT活性持续增加[33], 而对于
突变体来说 , 要及时清除过多的H2O2, 势必增加
CAT活性。而突变体的CAT活性依次显著下降(图
2-C), 致使细胞中H2O2不能及时被清除而累积 (图
3-B)。至于突变体剑叶、倒二叶和倒三叶的SOD和
POD活性显著高于野生型且依次显著升高的原因 ,
可能是叶片在衰老初期的自我保护, 诱导了SOD和
POD合成相关基因的表达(图2-A和B), 该结果进一
步证实了汪媛[34]和赵晨晨等[35]的研究。当然, 叶片
中高浓度的H2O2和O2܋ 也将导致突变体倒二叶和倒
三叶中的MDA含量显著升高 , 分别比剑叶增加
8.29%和76.93% (图3-C)。
叶片衰老既受生物和非生物等因素的影响, 也
受植物内源激素的调节。研究已证实, 乙烯、油菜
素甾醇、脱落酸(ABA)、水杨酸、茉莉酸及其衍生
物茉莉酸甲酯等均是叶片衰老促进激素 [36]。其中
ABA合成的关键限速步骤是9-顺-环氧类胡萝卜素
(9-cis-epoxycarotenoids)被裂解成C15的ABA前体黄
质醛, 此步骤涉及的酶是9-顺-环氧类胡萝卜素双加
氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)[36]。
一旦内源ABA水平增加, 将诱导NAC类转录因子如
AtNAP[37]和OsNAP[10]的表达, 并进一步促进其靶基
因SAG113的表达[38], 进而抑制叶片气孔关闭, 加快
叶肉细胞呼吸及水分蒸发, 最终导致叶片衰老。此
外 , 叶片衰老还受其他衰老相关基因的精细调控 ,
其中水稻DNA结合蛋白OsWRKY42可以与OsMT1d
的启动子区域结合, 进而抑制其表达并诱导ROS反
应 , 促进叶片衰老 [12]; 抑制水稻锌指蛋白基因
OsDOS [39]或OsTZF1[40]的表达则会引起水稻叶片早
衰; 过量表达水稻GTP酶基因OsRab7B3也导致叶片
早衰[41]。在本研究的OsPLS3基因定位区间内, 尚没
有衰老相关的基因被定位或克隆, 而与报道相关的
导致水稻叶片衰老的基因分别为锌指蛋白基因(LOC_
Os12g42250)、9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因
(LOC_Os12g42280)、GTP酶基因(LOC_Os12g42370)
和DNA结合蛋白基因(LOC_Os12g42420)。研究表明
锌指蛋白转录因子 [42]及DNA结合因子 [43]可以通过
与清除ROS的CAT互作 , 调控叶肉细胞的ROS反应
来控制叶片衰老。本研究突变体的MDA含量、CAT
活性、O2܋ 含量、H2O2含量等结果表明叶片衰老很
可能与ROS反应密切相关, 因此初步推测候选基因
很可能是锌指蛋白基因 (LOC_Os12g42250)或DNA
结合蛋白基因(LOC_Os12g42420)。当然, 候选基因
的最终确定要依赖于这两个基因的测序分析及遗传
互补验证。
4 结论
ospls3 是一个新的叶片早衰突变体。与野生型
N142相比, 孕穗期突变体叶片中的叶绿素总量显著下
降。伴随 ospls3 叶绿体的降解, 致使叶片中的 O2܋ 和
H2O2大量产生。同时, 由于 ospls3的 CAT活性显著
第 5期 龚 盼等: 水稻叶片早衰突变体 ospls3的生理特征和基因定位 673
下降, 清除 H2O2的能力也显著下降, 并进一步引起
MDA 含量的极显著增加; 然而, 在叶片衰老的初期,
SOD和 POD活性显著升高。该突变受 1对核隐性基
因控制, 定位于第 12 染色体 SSR 标记 RM6953 和
RM28753之间约 294 kb的范围内。
References
[1] Lim P O, Kim H J, Nam H G. Leaf senescence. Annu Rev Plant
Biol, 2007, 58: 115–136
[2] 伍泽堂. 超氧自由基与叶片衰老时叶绿素破坏的关系. 植物
生理学通讯, 1991, 27: 277–279
Wu Z T. Relationship between superoxide radical and destruction
of chlorophyll during leaf senescence. Plant Physiol Commun,
1991, 27: 277–279 (in Chinese with English abstract)
[3] 段俊, 梁承邺, 黄毓文. 杂交水稻开花结实期间叶片衰老. 植
物生理学报, 1997, 23: 139–144
Duan J, Liang C Y, Huang Y W. Studies on leaf senescence of
hybrid rice at flowering and grain formation stage. Acta Phyto-
physiol Sin, 1997, 23: 139–144 (in Chinese with English abstract)
[4] Zhang C J, Chu H J, Chen G X, Shi D W, Zuo M, Wang J, Lu C G,
Wang P, Chen L. Photosynthetic and biochemical activities in
flag leaves of a newly developed superhigh-yield hybrid rice
(Oryza sativa) and its parents during the reproductive stage. J
Plant Res, 2007, 120: 209–217
[5] Inada N, Sakai A, Kuroiwa H, Kuroiwa T. Senescence program in
rice (Oryza sativa L.) leaves: analysis of the blade of the second
leaf at the tissue and cellular levels. Protoplasma, 1999, 207:
222–232
[6] 刘道宏. 植物叶片的衰老. 植物生理学通讯, 1983, (2): 14–19
Liu D H. Plant leaf senescence. Plant Physiol Commun, 1983, (2):
14–19 (in Chinese)
[7] Thomas H, Smart C M. Crops that stay green. Ann Appl Biol,
1993, 123: 193–219
[8] 魏道智, 戴新宾, 许晓明, 张荣铣. 植物叶片衰老机理的几种
假说. 广西植物, 1998, 18(1): 90–97
Wei D Z, Dai X B, Xu X M, Zhang R X. Several hypotheses on
the mechanism of the plant leaf senescence. Guihaia, 1998, 18(1):
90–97 (in Chinese with English abstract)
[9] Wang Z, Wang Y, Hong X, Hu D, Liu C, Yang J, Li Y, Huang Y,
Feng Y, Gong H, Li Y, Fang G, Tang H, Li Y. Functional inactiva-
tion of UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase 1 (UAP1)
induces early leaf senescence and defence responses in rice. J
Exp Bot, 2015, 66: 973–987
[10] Liang C, Wang Y, Zhu Y, Tang J, Hu B, Liu L, Ou S, Wu H, Sun
X, Chu J, Chu C. OsNAP connects abscisic acid and leaf senes-
cence by fine-tuning abscisic acid biosynthesis and directly tar-
geting senescence-associated genes in rice. Proc Natl Acad Sci
USA, 2014, 111: 10013–10018
[11] Chen L, Wuriyanghan H, Zhang Y, Duan K, Chen H, Li Q, Lu X,
He S, Ma B, Zhang W, Lin Q, Chen S, Zhang J. An S-domain re-
ceptor-like kinase, OsSIK2, confers abiotic stress tolerance and
delays dark-induced leaf senescence in rice. Plant Physiol, 2013,
163: 1752–1765
[12] Han M, Kim C, Lee J, Lee S, Jeon J. OsWRKY42 represses
OsMT1d and induces reactive oxygen species and leaf senescence
in rice. Mol Cells, 2014, 37: 532–539
[13] Gao Q, Yang Z, Zhou Y, Yin Z, Qiu J, Liang G, Xu C. Charac-
terization of an Abc1 kinase family gene OsABC1-2 conferring
enhanced tolerance to dark-induced stress in rice. Gene, 2012,
498: 155–163
[14] Park S, Yu J, Park J, Li J, Yoo S, Lee N, Lee S, Jeong S, Seo H S,
Koh H, Jeon J, Park Y, Paek N. The senescence-induced stay
green protein regulates chlorophyll degradation. Plant Cell, 2007,
19: 1649–1664
[15] Jiang H, Li M, Liang N, Yan H, Wei Y, Xu X, Liu J, Xu Z, Chen
F, Wu G. Molecular cloning and function analysis of the stay
green gene in rice. Plant J, 2007, 52: 197–209
[16] Lee R, Hsu J, Huang H, Lo S, Chen S G. Alkaline alpha- galacto-
sidase degrades thylakoid membranes in the chloroplast during
leaf senescence in rice. New Phytol, 2009, 184: 596–606
[17] Jiao B, Wang J, Zhu X, Zeng L, Li Q, He Z. A novel protein RLS1
with NB-ARM domains is involved in chloroplast degradation during
leaf senescence in rice. Mol Plant, 2012, 5: 205–217
[18] Sato Y, Morita R, Katsuma S, Nishimura M, Tanaka A, Kusaba M.
Two short-chain dehydrogenase/reductases, NON-YELLOW
COLORING 1 and NYC1-LIKE, are required for chlorophyll b
and light-harvesting complex II degradation during senescence in
rice. Plant J, 2009, 57: 120–131
[19] Kusaba M, Ito H, Morita R, Iida S, Sato Y, Fujimoto M, Kawa-
saki S, Tanaka R, Hirochika H, Nishimura M, Tanaka A. Rice
NON-YELLOW COLORING1 is involved in light-harvesting
complex II and grana degradation during leaf senescence. Plant
Cell, 2007, 19: 1362–1375
[20] Morita R, Sato Y, Masuda Y, Nishimura M, Kusaba M. Defect in
non-yellow coloring 3, an alpha/beta hydrolase-fold family pro-
tein, causes a stay-green phenotype during leaf senescence in rice.
Plant J, 2009, 60: 1110–1110
[21] Yamatani H, Sato Y, Masuda Y, Kato Y, Morita R, Fukunaga K,
Nagamura Y, Nishimura M, Sakamoto W, Tanaka A, Kusaba M.
NYC4, the rice ortholog of Arabidopsis THF1, is involved in the
degradation of chlorophyll protein complexes during leaf senes-
cence. Plant J, 2013, 74: 652–662
[22] Qiao Y, Jiang W, Lee J, Park B, Choi M, Piao R, Woo M, Roh J,
Han L, Paek N, Seo H S, Koh H. SPL28 encodes a
clathrin-associated adaptor protein complex 1, medium subunit
μ1 (AP1M1) and is responsible for spotted leaf and early senes-
cence in rice (Oryza sativa). New Phytol, 2010, 185: 258–274
[23] Undan J R, Tamiru M, Abe A, Yoshida K, Kosugi S, Takagi H,
Yoshida K, Kanzaki H, Saitoh H, Fekih R, Sharma S, Undan J,
Yano M, Terauchi R. Mutation in OsLMS, a gene encoding a pro-
tein with two double-stranded RNA binding motifs, causes lesion
mimic phenotype and early senescence in rice (Oryza sativa L.).
Genes Genet Syst, 2012, 87: 169–179
[24] 张治安, 陈展宇. 植物生理学实验技术. 长春: 吉林大学出版
社, 2008. p 7
Zhang Z A, Chen Z Y. Experiment Technology of Plant Physio-
logy. Changchun: Jilin University Press, 2008. p 7 (in Chinese)
[25] Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram
amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues. Plant
Mol Biol, 1985, 5: 69–76
674 作 物 学 报 第 42卷
[26] Shen Y J, Jiang H, Jin J P, Zhang Z B, Xi B, He Y Y, Wang G,
Wang C, Qian L L, Li X, Yu Q B, Liu H J, Chen D H, Gao J H,
Huang H, Shi T L, Yang Z N. Development of genome-wide
DNA polymorphism database for map-based cloning of rice
genes. Plant Physiol, 2004, 135: 1198–1205
[27] Panaud O, Chen X, McCouch S R. Development of microsatellite
markers and characterization of simple sequence length poly-
morphism (SSR) in rice (Oryza sativa L.). Mol Gen Genet, 1996,
252: 597–607
[28] 李晴, 朱玉贤. 植物衰老的研究进展及其在分子育种中的应
用. 分子植物育种, 2003, 1: 289–296
Li Q, Zhu Y X. The progress of plant senescence research and
plant molecular breeding. Mol Plant Breed, 2003, 1: 289–296 (in
Chinese with English abstract)
[29] 刘贞琦, 刘振业, 马达鹏, 曾淑芬. 水稻叶绿素含量及其与光
合速率关系的研究. 作物学报, 1984, 10: 57–62
Liu Z Q, Liu Z Y, Ma D P, Zeng S F. A study on the relation be-
tween chlorophyll content and photosynthetic rate of rice. Acta
Agron Sin, 1984, 10: 57–62 (in Chinese with English abstract)
[30] 林植芳, 李双顺, 林桂珠, 孙谷畴, 郭俊彦. 水稻叶片的衰老
与超氧物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系. 植物学报,
1984, 26: 605–615
Lin Z F, Li S S, Lin G Z, Sun G C, Guo J Y. Superoxide dismu-
tase activity and lipid peroxidation in relation to senescence of
rice leaves. Acta Bot Sin, 1984, 26: 605–615 (in Chinese with
English abstract)
[31] Hideg E, Kalai T, Kos P B, Asada K, Hideg K. Singlet oxygen in
plants: its significance and possible detection with double (fluo-
rescent and spin) indicator reagents. Photochem Photobiol, 2006,
82: 1211–1218
[32] 华春, 王仁雷. 杂交稻及其三系叶片衰老过程中 SOD、CAT
活性和MDA含量的变化. 西北植物学报, 2003, 23: 406–409
Hua C, Wang R L. Changes of SOD and CAT activities and MDA
content during senescence of hybrid rice and three lines leaves.
Acta Bot Boreali-Occident Sin, 2003, 23: 406–409 (in Chinese
with English abstract)
[33] 金杨, 周丽芬 , 陈析丰, 刘峰 , 马伯军. 水稻类病变突变体
spl5 细胞坏死机制的分析. 浙江师范大学学报(自然科学版),
2009, 32: 326–331
Jin Y, Zhou L F, Chen X F, Liu F, Ma B J. Mechanisms of cell
death in rice lesion mimic mutant spl5. J Zhejiang Norm Univ
(Nat Sci), 2009, 32: 326–331 (in Chinese with English abstract)
[34] 汪媛. 水稻叶片衰老过程生理变化及蛋白质降解与蛋白酶活
性变化研究. 扬州大学硕士学位论文, 江苏扬州, 2010
Wang Y. The Research of Physiological Changes, Protein Degra-
dation and Protease Activity in the Process of Leaf Senescence in
Rice. MS Thesis of Yangzhou University, Yangzhou, China, 2010
(in Chinese with English abstract)
[35] 赵晨晨, 黄福灯, 龚盼, 杨茜, 程方民, 潘刚. 水稻叶片早衰
突变体 osled 的生理特征与基因定位. 作物学报, 2014, 40:
1946–1955
Zhao C C, Huang F D, Gong P, Yang Q, Cheng F M, Pan G.
Physiological characteristics and gene mapping of a leaf
early-senescence mutant osled in rice. Acta Agron Sin, 2014, 40:
1946–1955 (in Chinese with English abstract)
[36] 许智宏, 薛红卫. 植物激素作用的分子机理. 上海: 上海科学
技术出版社, 2012. pp 403–417
Xu Z H, Xue H W. Molecular Mechanism of Plant Hormones.
Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publisher, 2012. pp
403–407 (in Chinese)
[37] Guo Y F, Gan S S. AtNAP, a NAC family transcription factor, has
an important role in leaf senescence. Plant J, 2006, 46: 601–612
[38] Zhang K, Xia X, Zhang Y, Gan S. An ABA-regulated and
Golgi-localized protein phosphatase controls water loss during
leaf senescence in Arabidopsis. Plant J, 2012, 69: 667–678
[39] Kong Z, Li M, Yang W, Xu W, Xue Y. A novel nuclear-localized
CCCH-type zinc finger protein, OsDOS, is involved in delaying
leaf senescence in rice. Plant Physiol, 2006, 141: 1376–1388
[40] Jan A, Maruyama K, Todaka D, Kidokoro S, Abo M, Yoshimura
E, Shinozaki K, Nakashima K, Yamaguchi-Shinozaki K. OsTZF1,
a CCCH-tandem zinc finger protein, confers delayed senescence
and stress tolerance in rice by regulating stress-related genes.
Plant Physiol, 2013, 161: 1202–1216
[41] Pitakrattananukool S, Kawakatsu T, Anuntalabhochai S, Takaiwa
F. Overexpression of OsRab7B3, a small GTP-binding protein
gene, enhances leaf senescence in transgenic rice. Biosci Bio-
technol Biochem, 2012, 76: 1296–1202
[42] Li Y, Chen L, Mu J, Zuo J. LESION SIMULATING DISEASE1
interacts with catalases to regulate hypersensitive cell death in
Arabidopsis. Plant Physiol, 2013, 163: 1059–1070
[43] Smykowski A, Zimmermann P, Zentgraf U. G-Box binding
factor1 reduces CATALASE2 expression and regulates the on-
set of leaf senescence in Arabidopsis. Plant Physiol, 2010,
153: 1321–1331