全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(9): 15491556 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08009-002)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 吕维涛, E-mail: wtlv@ibcas.ac.cn, Tel: 13811773675; 周春菊, Tel: 029-87092262
第一作者联系方式: E-mail: wangce_@126.com, Tel: 13681244308
Received(收稿日期): 2014-01-21; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-06-27.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140708.1146.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01549
玉米 A亚族 bZIP转录因子基因 ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析
王 策 1,2 杨艳歌 2,3 吕维涛 2,* 周春菊 1,* 孙冬梅 3 邓 馨 2
1 西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100; 2 中国科学院植物研究所北方资源植物重点实验室, 北京 100093; 3 黑龙江八一
农垦大学生命科学技术学院, 黑龙江大庆 163319
摘 要: 碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)蛋白是真核生物所特有的一类转录因子, 对于植物在逆境下的基
因表达调控具有重要作用。为丰富对玉米 bZIP 转录因子功能的认识, 本研究以从玉米中克隆到的一个 A 亚族 bZIP
转录因子编码基因 ZmbZIP81为对象展开。ZmbZIP81基因位于玉米第 6染色体, 编码区全长 2492 bp, 由 4个外显子
和 3个内含子组成, 编码蛋白含 254个氨基酸。研究表明 ZmbZIP81基因表达受外源 ABA、NaCl和干旱胁迫诱导。
过表达该基因的拟南芥植物表现出 ABA不敏感和 NaCl胁迫抗性增强的表型, 推测 ZmbZIP81可能作为 ABA信号途
径的负调控因子参与植物抗逆基因表达调控网络。
关键词: 玉米; bZIP转录因子; A亚族; ABA; 逆境胁迫
Cloning, Expression, and Functional Analysis of an A Subfamily bZIP Tran-
scription Factor Gene ZmbZIP81 in Maize
WANG Ce1,2, YANG Yan-Ge2,3, LÜ Wei-Tao2,*, ZHOU Chun-Ju1,*, SUN Dong-Mei3, and DENG Xin2
1 College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Key Laboratory of Plant Resources, Institute of Botany, Chinese
Academy of Sciences, Beijing 100093, China; 3 College of Life Science and Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319,
China
Abstract: Basic leucine zipper (bZIP) proteins constitute a large family of transcription factors among eukaryotes, which plays
important roles in gene expression regulation under abiotic stress in plants. In order to gain a better understanding of bZIPs in
maize, we cloned ZmbZIP81 from maize, which encodes an A subfamily bZIP transcription factor. ZmbZIP81 is located on chro-
mosome 6. The coding region of ZmbZIP81 is 2492 bp in length with four exons and three introns, which encodes 254 animo acid
residues. Further study showed that the expression of ZmbZIP81 was induced by exogenous ABA, salt and drought treatments.
The transgenic Arabidopsis plants overexpressing ZmbZIP81 were less sensitive to ABA, but more tolerant to salt, compared with
the wild type. These results indicated that ZmbZIP81 may encode a transcription factor, regulate ABA signaling negatively and
participate in abiotic stress tolerance regulation in maize.
Keywords: Maize; bZIP transcription factor; A subfamily; ABA; Abiotic stress
bZIP 转录因子广泛存在于动植物和微生物中,
参与多种生物学过程。它是转录因子中一个较大的
家族, 所有成员均由一个起二聚体化作用的亮氨酸
拉链结构域和一个结合 DNA的碱性结构域组成[1]。
亮氨酸拉链结构域能够形成一个具有两亲性的 α螺
旋, 通过形成二聚体与 DNA 结合。DNA 结合结构
域再通过一个固定的 N-x7-R/K 结构专一性地识别
并结合启动子上的顺式作用元件。此外, bZIP转录
因子一般还含有一个或多个转录激活结构域, 当转
录因子与 DNA 结合后起加强转录的作用[2]。研究
表明, 植物 bZIP转录因子通过参与 ABA信号转导
响应多种非生物胁迫, 如盐胁迫、干旱胁迫、热胁
迫等[3]。拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中的 bZIP
转录因子家族共有75个成员, 可以根据其碱性亮
氨酸拉链的同源性和其他保守域的序列特征的不
同分为 10个亚族, A亚族 bZIPs主要在种子和植物
1550 作 物 学 报 第 40卷


组织对 ABA 和逆境胁迫的响应信号网络中发挥重
要作用[4-5]。如 ABI5 蛋白是 ABA 抑制种子萌发和
幼苗生长过程中的重要信号组分, 受 ABA、干旱和
高盐胁迫诱导表达, 能提高植物对外源 ABA 的敏
感性, 在干旱条件下参与靶基因的转录调控, 对植
物抗逆性起重要作用[6]。与拟南芥 ABI5相似, 水稻
(Oryza sativa L.)中的 OsABI5能抑制种子萌发和幼
苗生长, 可以与 G-box元件结合并激活抗逆基因的
表达[7]。在种子发育期, AtABI5和 OsABI5均可通
过对 ABA 的感知诱导胚胎发育晚期丰富蛋白基因
的表达[7]。
玉米(Zea mays L.)是重要的粮食作物。然而随着
生态环境的不断恶化, 土壤盐渍化已成为影响玉米
生长发育和结实的一大危害, 严重制约了作物产量[8]。
在一些盐渍化地区种植的玉米往往表现为出苗时间
延迟、发芽率降低、光合作用受抑并导致产量降低[9]。
因此, 提高植物的抗盐性、增加盐胁迫下作物产量
成为备受人们关注的课题。bZIP转录因子对植物逆
境基因表达调控具有重要作用, 已在玉米研究中受
到关注。Wei等[10]利用玉米基因组数据库鉴定出 125
个 bZIP 基因, 编码 170 种蛋白, 通过序列分析将其
划分为 11个亚族, 并按染色体中的定位顺序将其命
名。Ying等[11]和 Yan等[12]对玉米 A亚族 bZIP转录
因子ZmABI5和ZmbZIP72的研究表明, 它们的基因
表达均受 ABA 与逆境胁迫诱导上调 , 过表达
ZmbZIP72 使拟南芥转基因株系对 ABA 的敏感性增
强, 且抗旱、抗盐; 但过表达 ZmABI5却导致拟南芥
转基因株系对盐、旱、高温和低温胁迫更为敏感。A
亚族中 bZIP 转录因子从系统进化关系上可被进一
步分为 3个分支, ZmbZIP72与 ABI5和 OsbZIP72等
构建在同一个系统进化分支上[11], 而另外两个分支
上的 bZIP13/GBF4、bZIP14/27等在玉米中的同源基
因功能尚未见报道。为进一步探究玉米 A亚族 bZIP
转录因子在 ABA 信号途径与逆境胁迫响应中的作
用 , 本文对从 ZmGDB (http://www.plantgdb.org/
ZmGDB/)数据库搜索到的一个与拟南芥 GBF4 和
AtbZIP13基因有较高同源性的、被 Wei等[10]命名为
ZmbZIP81 的基因进行克隆, 利用实时定量 PCR 技
术分析了 ZmbZIP81 在玉米中的胁迫诱导表达模式,
并通过分析过表达该基因的拟南芥植物表型探讨了
ZmbZIP81在 ABA信号途径和逆境胁迫抗性中的作
用。本研究结果对于研究玉米响应外界环境胁迫的
机制、培育抗盐玉米新品种具有参考价值。
1 材料与方法
1.1 玉米材料及处理
将玉米 B73自交系种子置蒸馏水浸湿的纱布上,
于 28℃暗培养 2 d 后, 种植于盛有搅拌均匀的花土
和蛭石的小花盆中, 在 28℃、12 h/12 h光周期条件
下培养。参考 Ying等[11]的 ABA、NaCl和干旱处理
方法并加以改进: 取三叶一心期的幼苗, 将根部浸
没在 100 μmol L−1 ABA和 150 mmol L−1 NaCl溶液中,
并以溶剂浸根为对照, 分别于处理 0、2、6 和 12 h
后取样; 另从土中取出同时期幼苗, 在室温下自然
干燥, 分别于植株失水量达到鲜重的 20%、40%和
60%时取样, 并取土壤中正常生长的植株叶片为对
照。将各组样品立即用液氮冷冻并于−70℃保存。
1.2 RNA提取及第一链 cDNA的合成
用总 RNA提取试剂盒(TRIzol Reagent, TaKaRa)
提取样品总 RNA, 并用 DNase I (TaKaRa)纯化。按
照 SuperScript III反转录酶(Invitrogen)说明书合成第
一链 cDNA, 作为基因扩增及荧光定量 PCR
(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)的模板。
1.3 ZmbZIP81基因的克隆
以正常条件下生长的三叶一心期B73自交系玉
米幼苗的 cDNA为材料 , 用基因特异性引物
ZmbZIP81-F 和 ZmbZIP81-R ( 表 1) 和 高 保 真 的
Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(NEB)进行基因扩
增, 反应程序为98℃预变性30 s, 之后进入循环程序
98℃ 10 s, 62℃ 20 s, 72℃ 45 s, 退火温度每隔一
个循环降低1℃ , 至49℃ , 最后72℃延伸10 min的
Touchdown程序。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检
测, 并回收目的条带。产物连接Gateway载体pENTR/
D-TOPO (Invitrogen), 转化大肠杆菌感受态TOP10,
经菌液PCR筛选阳性克隆, 测序验证。测序正确的
中间载体通过LR反应(LR克隆酶 , Invitrogen)将扩
增片段连入植物表达载体pLeela (Invitrogen), 测序
验证。
1.4 DNA与蛋白质序列的生物信息学分析
利用 ZmGDB (http://www.plantgdb.org/ZmGDB/)
数据库搜索 ZmbZIP81 基因及其所编码的蛋白序列,
并通过 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.
be/webtools/plantcare/html/)在线服务器查找并分析
其启动子区 ABA 与胁迫相关信号响应元件。利用
TAIR (http://www.arabidopsis.org/)数据库查找拟南
芥中 A亚族 bZIP转录因子蛋白序列。使用 ClustalX
2.0 对 ZmbZIP81和拟南芥 A 亚族 bZIP蛋白进行多
第 9期 王 策等: 玉米 A亚族 bZIP转录因子基因 ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析 1551


重序列比对[13], 用 GeneDoc 对比对结果进行保守序
列分析, 用MEGA5构建由 Bootstrap检测(1000次抽
样)的系统发育树[14]。利用 MEME (http://meme.nbcr.
net/meme/cgi-bin/meme.cgi)在线服务器分析保守结
构域[15]。
1.5 玉米苗期ZmbZIP81基因在胁迫条件下的表达
以 ABA、NaCl和干旱处理条件下的三叶一心期
B73 自交系玉米幼苗和对照组的 cDNA 为材料, 采
用 Toyobo 公司 SYBR Green Master Mix 进行
qRT-PCR 扩增, 反应体系含 cDNA 1 μL、2×SYBR
Green Master Mix 7.5 μL、引物(10 pmol μL−1)各0.3 μL、
ddH2O 5.9 μL。以玉米 β-tubulin 为内参, 以 qRT-
ZmbZIP81-F和 qRT-ZmbZIP81-R, qRT-β-tubulin-F和
qRT-β-tubulin-R (表 1)为引物, 用 Eppendorf 公司
Realplex PCR 仪实时定量检测基因表达。反应程序
为 94℃预变性 30 s, 之后 94℃ 5 s, 55℃ 30 s, 72℃
20 s, 共 40个循环。采用 2−ΔΔCt法分析基因相对表达
量[16]。

表 1 所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
引物序列
Sequence information (5–3)
用途
Function
ZmbZIP81-F CACCGACTGTCTGAAGTTTTGCCC 基因克隆
ZmbZIP81-R CACGCACAATCACCTAAATGTTTTC Gene cloning
qRT-ZmbZIP81-F CTAGGGACAGGAAACAGGCC 荧光定量 PCR, 反转录 PCR
qRT-ZmbZIP81-R TACCATTCCATGGAGTTGTTTC Real-time PCR, RT-PCR
qRT-β-tubulin-F GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA 玉米内参照基因
qRT-β-tubulin-R CGCCAAACTTAATAACCCAGTA Reference gene as control in maize
RT-actin7-F CCGGTATTGTGCTCGATTCTG 拟南芥内参照基因
RT-actin7-R TTCCCGTTCTGCGGTAGTGG Reference gene as control in Arabidopsis

1.6 ZmbZIP81 转基因拟南芥纯合株系的获得与
验证
将植物表达载体转化农杆菌菌株 GV3101
(pMP90RK), 得到的阳性菌克隆经 PCR 验证后采用
浸花法侵染野生型拟南芥(Col)植株, 收获成熟 T0代
种子。T0代种子经消毒后, 点播在 MS 选择培养基
(含 100 μg mL−1 草甘膦)上筛选抗性植株, 种植收
种。在相同选择培养基上筛选 T1代种子抗性与非抗
性植株符合 3∶1分离比例的单株, 经一代种植后选
择在相同选择培养基上不发生分离的 T2代抗性株系
种子进行进一步分析。
为分析转基因株系中 ZmbZIP81 的表达量, 将
各转基因株系与野生型种子播于 MS 培养基上, 4℃
春化 3 d后, 在 22℃、16 h/8 h光周期条件下培养 10 d,
取整株幼苗如前述方法提取总 RNA, 并合成第一链
cDNA, 进行 RT-PCR扩增, 反应体系为 cDNA 1 μL、
2×Taq Mix 5 μL、引物 (10 pmol μL−1) 各 0.5 μL、
ddH2O 3 μL。以拟南芥 Actin7 为内参 , 用引物
qRT-ZmbZIP81-F 和 qRT-ZmbZIP81-R、RT-actin7-F
和RT-actin7-R (表 1)分别扩增 ZmbZIP81基因序列和
内参序列, 反应程序为 94℃预变性 30 s, 之后 94℃
10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 20 s, 共 25个循环。对 PCR产
物进行切胶回收与测序验证。
1.7 ZmbZIP81 转基因拟南芥 ABA 敏感性和抗
盐性分析
参考Ying等[11]的ABA和NaCl处理方法并加以
改进。将 T2代转 ZmbZIP81 基因的拟南芥与野生型
种子以 70%酒精 30 s、7% NaClO 15 min消毒后分别
播于含 5 μmol L−1 ABA及 200 mmol L−1 NaCl的 MS
培养基上, 以未加 ABA 和 NaCl 的 MS 培养基为对
照, 4℃春化 3 d后, 在 22℃、16 h/8 h光周期条件下
培养并于每 24 h统计萌发率, 总共统计 7 d。另将转
基因拟南芥与野生型种子经同样方法消毒后播于
MS培养基上, 4℃春化 3 d后, 在 22℃、16 h/8 h光
周期条件下培养 3 d, 选取长势相同的幼苗分别移至
含有 50 μmol L−1 ABA及 150 mmol L−1 NaCl的 MS
培养基上, 以未加 ABA 和 NaCl 的 MS 培养基为对
照, 生长一段时间后观察转基因植株和野生型植株
的表型差异。
2 结果与分析
2.1 ZmbZIP81序列分析
ZmbZIP81基因位于玉米第 6染色体, 编码区全
长 2492 bp, 具有 4段外显子区和 3段内含子区, 编
1552 作 物 学 报 第 40卷


码 254 个氨基酸(图 1-A)。除亮氨酸拉链结构域外,
ZmbZIP81蛋白还包含 2个保守域Motif 1和Motif 2
(图 1-B), 它们是一些蛋白激酶的结合位点。2 个保
守域中各自包含钙依赖的蛋白激酶(CDPK)等的结
合位点 R-X-X-S/T, 以及酪蛋白激酶 II (CK II)的结
合位点 S/T-X-X-E/D。此外, 对 ZmbZIP81 基因的启
动子区分析发现 2 个分别位于751 bp 和460 bp 的
ABRE元件、1个位于1051 bp的干旱胁迫信号响应
的 DRE 元件和 1 个位于133 bp 的 MYB 类转录因
子特异性识别的 CCAAT-box 元件(图 1-A), 表明该
基因的表达可能受 ABA 与胁迫信号的调控。将
ZmbZIP81 的氨基酸序列与拟南芥中 A 亚族 bZIPs
进行多重序列比对(图 2), 发现它们具有高度保守的
序列和结构域。系统发育分析表明, ZmbZIP81与拟
南芥中GBF4和 bZIP13亲缘关系最近(图 3), 且序列
相似性最高, 均为 42%, 而与 ZmABI5和 ZmbZIP72
亲缘关系相对较远(未列出)。GBF4是一种能与基因
启动子区 G-box 结合的转录因子[4], 但其具体功能
还未见报道。

图 1 ZmbZIP81基因(A)与编码蛋白(B)结构示意图
Fig. 1 Gene structure of ZmbZIP81 (A) and conserved do-
mains of the protein encoded (B)

2.2 玉米苗期ZmbZIP81基因在胁迫条件下的表达
以三叶一心期玉米幼苗为材料, 分析 ZmbZIP81
基因对 ABA、NaCl 和干旱处理的应答表明, 上述处
理均可诱导 ZmbZIP81 的表达, 并且随处理时间的延
长和程度的加重表达量逐渐升高(图 4)。经 ABA 和
NaCl分别处理 12 h和 6 h后, ZmbZIP81基因表达开
始明显上调, 且两种胁迫处理12 h后, ZmbZIP81表达
量达到对照组的近 2倍(图 4-A, B)。ABA处理 2 h时
表达量虽有下降, 经分析与对照组无显著性差异。干
旱处理下 , 当叶片失水率达到 20%和 40%时 ,
ZmbZIP81表达量上调约 1.5倍; 而失水率达到 60%时,
表达量可达初始水平的 3.65倍(图 4-C)。说明 ZmbZIP
81基因的表达受 ABA、NaCl和干旱胁迫的诱导。
2.3 植物表达载体构建、拟南芥遗传转化与验证
为进一步研究 ZmbZIP81 转录因子的功能, 构
建了 35SS::ZmbZIP81的植物表达载体, 其结构如图
5-A所示, 并采用农杆菌介导法转化拟南芥, 经抗生
素筛选与基因组 PCR 验证获得了纯合单拷贝 T2代
过表达拟南芥株系 OE-5、OE-9 和 OE-11。半定量
RT-PCR验证结果如图 5-B所示, 在 3个过表达株系
中检测到特异目的条带, 而在野生型拟南芥中未检
测到。所用引物的特异性已通过对 PCR产物的切胶
回收与测序进行验证。以上结果表明 ZmbZIP81 确
已转化成功并获得稳定遗传的株系。
2.4 过表达拟南芥对 ABA的敏感性反应
在 B73自交系中, ZmbZIP81基因表达显示出受
ABA诱导上调的特性(图 4)。为验证 ZmbZIP81的功
能是否与 ABA 敏感性存在关联 , 分析了过表达
ZmbZIP81的拟南芥株系的ABA敏感性。如图 6-A, B
所示, 在 5 μmol L−1 ABA处理下, 3个过表达株系种
子萌发率均显著高于野生型 , 如 OE-5、OE-9 和
OE-11转基因株系在第 7天的萌发率分别为 56.5%、
36.6%和 56.9%, 而野生型只有 14.0%; 在对照组培
养基上生长的 3 个转基因株系与野生型种子萌发率
基本一致, 表明过表达株系种子萌发对 ABA的敏感
性降低。另外, 当 3 d 苗龄的拟南芥幼苗移至含有
50 μmol L−1 ABA的MS培养基上 25 d后, 野生型拟
南芥黄化较明显, 且部分植株已死亡, 其平均根长
为 2.8 cm, 存活率为 61.9%; 而 3个转基因株系叶片
相对大而绿, 几乎全部存活, 平均根长分别为 2.9、
3.9和 4.5 cm, 分析表明 OE-9和 OE-11两株系根显
著长于野生型, 3个株系的存活率分别为 95.2%、
100%和 100%, 同期的对照组幼苗长势始终一致(图
7-A, B)。以上结果说明, 在种子萌发期与幼苗期, 与
野生型相比, ZmbZIP81过表达拟南芥的ABA敏感性
降低。因此推测 ZmbZIP81可能作为 ABA信号途径
的负调控因子参与植物抗逆调控网络。
2.5 过表达拟南芥的抗逆性
植物的抗逆性与 ABA信号途径密切相关。在逆
境胁迫下, 植物体可以通过改变内源 ABA水平调控
逆境胁迫相关基因的表达, 从而提高对逆境胁迫的
适应性。种子萌发期耐盐性分析表明, 在含有 200
mmol L−1 NaCl的 MS培养基上, 各植物株系的萌发
率在第 7天均可达到 100%, 但过表达株系种子萌发
明显快于野生型, 如第 4 天 OE-5、OE-9 和 OE-11
三个株系萌发率分别为 68.4%、84.9%和 75.0%, 而
野生型只有 54.2%, 经检测差异达到显著水平; 在
只含有 MS 的对照组培养基上生长的 3 个转基因株
系与野生型种子萌发率基本一致, 第 2 天即可达近
第 9期 王 策等: 玉米 A亚族 bZIP转录因子基因 ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析 1553



图 2 ZmbZIP81和拟南芥 A亚族 bZIP转录因子的多重序列比对
Fig. 2 Alignment of ZmbZIP81 and A subfamily bZIP transcription factors in Arabidopsis
1554 作 物 学 报 第 40卷



图 3 ZmbZIP81和拟南芥 A亚族 bZIP转录因子的系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of ZmbZIP81 and A subfamily bZIPs
in Arabidopsis
100% (图 6-A, C)。而对过表达株系的幼苗期抗盐胁
迫能力检测表明, 在 150 mmol L−1 NaCl处理 30 d后,
各转基因株系拟南芥幼苗长势与野生型无明显差异,
抗盐性基本一致(图 7-A, C)。以上结果说明, 与野生
型相比, ZmbZIP81过表达拟南芥对盐胁迫的抗性有
一定程度的提高, 而这种抗性的提高只体现在种子
萌发期, 不体现于幼苗期。因此推测 ZmbZIP81基因
可能并不参与植物幼苗期的盐胁迫反应, 而只在种
子萌发期发挥抗盐作用。我们还同时采用 40%
PEG-8000 模拟的渗透胁迫分析了转基因拟南芥萌
发期与幼苗期的抗旱性 , 结果显示 , 渗透胁迫下 ,
转基因拟南芥与野生型在种子萌发期以及幼苗期的
长势基本一致(未列出), 表明 ZmbZIP81 基因在植物
抗旱性方面可能无明显作用。

图 4 ZmbZIP81基因在 ABA、NaCl和干旱处理条件下的表达
Fig. 4 Expression of ZmbZIP81 in maize under ABA, salt, and drought treatments
A: ABA处理(100 μmol L−1); B: NaCl处理(150 mmol L−1); C: 干旱处理。各处理条件下, ZmbZIP81基因的相对表达量是对照的倍数。
A: Treatment of MS+ABA (100 μmol L−1); B: Treatment of MS+NaCl (150 mmol L−1); C: Drought treatment. The relative expression level of
ZmbZIP81 under each treatment represents fold change towards the control.


图 5 ZmbZIP81过表达载体示意图(A)和 35SS::ZmbZIP81转基
因株系的 RT-PCR结果(B)
Fig. 5 Structure of ZmbZIP81-overexpressed vector (A) and
analysis of 35SS::ZmbZIP81 transgenic lines (B)
p35SS: ZmbZIP81基因启动子; pA35S: ZmbZIP81基因终止子; Pat:
草甘膦抗性基因; Nos-p: 草甘膦抗性基因启动子; Nos-T: 草甘
膦抗性基因终止子; attB1和 attB2: LR反应重组位点; LB: 载体
左边界; RB: 载体右边界。
p35SS: promoter of ZmbZIP81; pA35S: terminator of ZmbZIP81; Pat:
glyphosate resistance gene; Nos-p: promoter of glyphosate resistance
gene; Nos-T: terminator of glyphosate resistance gene; attB1 and
attB2: LR recombination sites; LB: left border; RB: right border.
3 讨论
在干旱、高盐等逆境条件下, 植物细胞能够迅
速合成 ABA。在内源 ABA诱导下, 大量胁迫相关基
因被表达, 从而参与植物抗逆反应。拟南芥中的 A
亚族 bZIP转录因子多数已被较为深入地研究, 它们
对于植物对 ABA和外界胁迫响应具有重要作用[17]。
已报道的几个拟南芥中的A亚族 bZIP转录因子表达
受 ABA诱导, 且其编码蛋白作为正调控因子参与植
物逆境胁迫响应[4], 具有代表性的基因包括 ABI5、
ABI5-like、ABF1-4等。已报道的 2个玉米A亚族 bZIP
转录因子基因 ZmABI5和 ZmbZIP72均受 ABA与逆
境胁迫诱导上调, 且参与植物逆境胁迫响应[11-12]。
其中 ZmbZIP72过表达使转基因植物对 ABA的敏感
性增强, 且抗旱、抗盐, 但 ZmABI5是作为负调控因
子参与逆境下植物对盐、旱、高温和低温等非生物
胁迫的响应[12]。
本研究从玉米中克隆到另一个A亚族 bZIP转录
因子基因 ZmbZIP81, 并通过序列分析证明其编码蛋
白与拟南芥中A亚族 bZIP转录因子具有相似的序列
特征, 它们都有 1段保守的 bZIP结构域和 2个保守
性较高的基序, 在系统进化上与拟南芥中的 GBF4
第 9期 王 策等: 玉米 A亚族 bZIP转录因子基因 ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析 1555



图 6 ABA和 NaCl处理条件下 35SS::ZmbZIP81转基因拟南芥种子萌发率统计
Fig. 6 Germination assays of 35SS::ZmbZIP81 transgenic lines of Arabidopsis under ABA and salt treatments
A: MS培养基; B: ABA处理 (5 μmol L−1); C: NaCl处理 (200 mmol L−1)。
A: MS medium; B: MS+ABA (5 μmol L−1); C: MS+NaCl (200 mmol L−1).


图 7 ABA和 NaCl处理条件下 35SS::ZmbZIP81转基因拟南芥
幼苗期生长表型
Fig. 7 Photographs of 35SS::ZmbZIP81 transgenic lines in
seedling stage under ABA and salt treatments
A: MS培养基; B: ABA处理 (50 μmol L−1); C: NaCl处理
(150 mmol L−1)。
A: MS medium; B: MS+ABA (50 μmol L−1); C: MS+NaCl
(150 mmol L−1).

和 bZIP13构成一个分支, 而与 ZmABI5和 ZmbZIP72
亲缘关系相对较远。我们的实验数据也证明 ,
ZmbZIP81虽与 ZmABI5和 ZmbZIP72具有类似的胁
迫诱导表达模式, 但与它们在植物逆境胁迫抗性中
的作用却有所不同。ZmbZIP81转基因拟南芥对外源
ABA敏感性降低, 抗NaCl胁迫能力增强, 表明它可
能是 ABA信号途径的负调控因子, 但可提高植物抗
逆性。这与 Liao等[18]报道的几个负调控模式的大豆
bZIP转录因子 GmbZIP44、GmbZIP62和 GmbZIP78
相似。这 3 个大豆转录因子分别属于 S、C 和 G 亚
族, 它们对 ABA 敏感性降低, 对 NaCl 胁迫抗性增
强, 并且 3个基因表达均受 ABA、NaCl和干旱胁迫
诱导, 说明 ZmbZIP81 可能与 3 个大豆 bZIP 转录因
子具有类似的调控模式。另外, 在本实验中虽未发
现 ZmbZIP81 基因对植物抗渗透胁迫能力的显著影
响, 但基于 ZmbZIP81基因的表达受干旱诱导, 且较
大幅度的表达量上调出现在植株失水量达到 60%时,
推测 ZmbZIP81 基因可能主要参与严重干旱胁迫的
反应, 或者在干旱胁迫反应中的功能需要其他调控
形式、或其他调控因子的协同作用。此研究中, 我
们的主要目的是对比 ZmbZIP81 与 ZmABI5 和
ZmbZIP72在基因表达和功能上的差异。由于过表达
ZmABI5和 ZmbZIP72两基因的植物表型主要出现在
种子萌发期和幼苗期, 所以我们也重点关注这两个
阶段。后续对植物生育后期的表型分析, 尤其是在
土壤干旱和盐渍条件下植物的抗性以及利用关键
bZIP转录因子缺失且对盐害敏感的突变体进行互补
突变体表型验证, 将有助于更加全面、深入地说明
ZmbZIP81基因的功能。
玉米作为单子叶作物, 其逆境响应信号网络可
能与双子叶植物拟南芥存在较大差异。目前有关玉
米 bZIP转录因子的报道还较少见, 进一步研究其各
成员的功能对阐明它们参与依赖于 ABA 的逆境胁
迫响应信号通路的机制具有重要意义。盐渍化土壤
环境制约了玉米出苗时间与发芽率, 并影响其产量[9]。
因此, 找到能提高玉米抗盐性的关键基因对于提高
玉米产量至关重要。本文报道的玉米 bZIP转录因子
基因 ZmbZIP81 可明显提高转基因植物种子在盐胁
迫下的萌发速率, 对通过分子育种手段改善玉米抗
1556 作 物 学 报 第 40卷


逆性进而提高盐渍化土壤种植玉米的产量具有参考
价值。
4 结论
从玉米中克隆了一个编码A亚族 bZIP转录因子
ZmbZIP81的基因。该基因的表达受 ABA、NaCl和
干旱胁迫诱导, 而且过表达该基因的拟南芥株系具
有对 ABA敏感性下降和对 NaCl胁迫抗性增强的表
型。推测 ZmbZIP81 基因编码的蛋白可能作为 ABA
信号途径的负调控因子参与植物逆境胁迫下的基因
表达调控。
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