全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 966975 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由浙江省自然科学基金项目(LQ15C130005)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2014AA10A603-15)资助。
This study was supported by the Natural Science Foundation of Zhejiang Province (LQ15C130005) and the National High-tech R&D Program
of China (2014AA10A603-15).
* 通讯作者(Corresponding author): 吴建利, E-mail: beishangd@163.com
第一作者联系方式: E-mail: 1409882837@qq.com
Received(收稿日期): 2015-12-29; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160511.1551.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00966
一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位
郭 丹 施勇烽 王惠梅 张晓波 宋莉欣 徐 霞 贺 彦
郭 梁 吴建利*
中国水稻研究所 / 水稻生物学国家重点实验室 / 国家水稻改良中心, 浙江杭州 310006
摘 要: 通过 EMS (ethane methyl sulfonate)诱变籼稻品种 IR64获得一个稳定遗传的显性斑点叶突变体 HM113。在大
田环境下, 突变体褐色斑点在播种后 3周的叶片上产生, 始穗期扩散至叶鞘。与野生型 IR64相比, 突变体 HM113的
株高、结实率和千粒重等农艺性状显著下降, 光合色素含量、净光合速率和可溶性蛋白含量显著降低。同时突变体
CAT和 SOD活性显著降低, POD活性显著上升。组织化学分析显示, 突变体叶片中积累了大量活性氧, 且斑点处细
胞坏死。白叶枯病菌接种结果显示, HM113是一个广谱抗性增强的突变体。实时定量 PCR分析表明 HM113中防卫反
应基因 AOS2、PAL4、PR10 和 PR1b 等的表达大幅上调。遗传分析表明, 突变体褐斑性状受单显性基因(SplHM113)控
制, 利用图位克隆法将该基因定位在第 7 染色体长臂 RM21605 和 RM418 之间, 物理距离约为 308 kb。本研究为褐
斑基因 SplHM113的克隆与功能分析奠定了基础。
关键词: 水稻; 斑点叶突变体; 白叶枯病抗性; 活性氧; 基因定位
Characterization and Gene Fine Mapping of a Rice Dominant Spotted-leaf
Mutant
GUO Dan, SHI Yong-Feng, WANG Hui-Mei, ZHANG Xiao-Bo, SONG Li-Xin, XU Xia, HE Yan, GUO
Liang, and WU Jian-Li*
State Key Laboratory of Rice Biology / Chinese National Center for Rice Improvement / China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006,
China
Abstract: A stable inherited rice spotted-leaf mutant HM113 was isolated from an EMS-induced IR64 mutant bank. Under natural
conditions, brown lesions were observed on the leaves in three weeks after sowing and spread to the sheaths at the initial heading
stage. Agronomic traits including the plant height, panicle length, number of panicles, number of filled grain/panicle, seed-setting
rate and 1000-grain weight were decreased significantly in HM113. In addition, the photosynthetic pigment contents, net photo-
synthetic rate and soluble protein content in the mutant were significantly lower than those in the wild type IR64, while the MDA
content was similar to that in the wild-type. Activities of CAT and SOD were significantly lower and activity of POD was signifi-
cantly higher in the mutant than in IR64. Histochemical analysis showed that cell death and ROS accumulation were occurred in
and around the lesions in HM113. Furthermore, disease resistance to bacterial blight pathogens was significantly enhanced in the
mutant in contrast to that in the wild type IR64. Expression of defense-related genes including AOS2, PAL4, PR10, and PR1b was
apparently up-regulated in the mutant. Genetic analysis indicated that the mutant trait was controlled by a novel single dominant
nuclear gene, tentatively termed as SplHM113, which was detected to be located in a region around 308 kb flanked by RM21605 and
RM418 on the long arm of chromosome 7. The data and populations obtained in the present study would facilitate the isolation
and functional analysis of SplHM113.
Keywords: Rice; Spotted-leaf mutant; Bacterial blight resistance; Reactive oxygen species; Gene mapping
第 7期 郭 丹等: 一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位 967
自然界条件下, 为抵御病原菌的侵害, 植物形
成了一系列复杂的信号传导途径和抗性机制。其中
最有效的是过敏性反应(hypersensitive response, HR),
HR 是一种程序性细胞死亡(programmed cell death,
PCD)[1-2]。在 HR 过程中, 细胞产生大量活性氧 (re-
active oxygen species, ROS), 能引起膜功能紊乱, 致
使植物遭受病原菌感染部位细胞死亡以阻止病原菌
的进一步侵染。HR 通常会激活病程相关蛋白
(pathogenesis-related, PR)的表达 , 并使植物产生系
统获得性抗性(systemic acquired resistance, SAR)[1,3]。
许多斑点叶突变体在无病原菌侵染条件下产生
与HR相似的表型, 并伴随斑点部位细胞坏死, 因此
这类突变体又被称为类病斑或类病变突变体。许多
已经鉴定的斑点叶突变体比其野生型对病原菌的抗
性有不同程度的提高, 如玉米突变体 LES22 对白粉
病菌的抗性提高[4], 拟南芥突变体 hlm1 对毒性丁香
假单胞杆菌番茄致病变种的抗性增强 [5], 水稻斑点
叶突变体 HM47[6]、HM143[7]和 hm197[8]对水稻白叶
枯病具有广谱抗性, blm对稻瘟病具有较强的抗性[9],
spl17和 Spl26对白叶枯病和稻瘟病均有较强的抗
性 [10]。因此可利用斑点叶突变体研究植物的过敏性
反应以及针对不同病原菌的抗性机制。
目前, 已对水稻中的 80多份斑点叶突变体完成
了遗传鉴定, 斑点性状主要受单隐性基因控制, 少
数受单显性基因或双基因控制。已经克隆的 19个斑
点叶基因, 则分别编码不同的酶/蛋白质, 参与植物
体内不同的代谢途径, 如基因 sl编码细胞色素 P450
单加氧酶, 可催化色胺生成 5’-羟色胺[11]; OsLSD1编
码锌指蛋白, 调控植物的程序性细胞死亡和愈伤组
织分化[12]; RLIN1[13]和 FGL[14]分别编码粪卟啉原 III
氧化酶与原叶绿素酸酯氧化还原酶 B, 参与四吡咯
代谢以及叶绿素的合成; Spl7 编码一个热激转录因
子, 在高温胁迫下诱导产生热激反应并形成类病斑[15];
OsSSI2 编码脂肪酸脱氢酶, 参与合成脂肪酸衍生物[16];
SPL28 编码网格受体蛋白的复合亚基 μ1, 参与高尔
基体上有关物质的运输[17]; LMR 编码 AAA-ATP 酶,
参与植物的过敏性反应[18]。斑点叶基因编码的产物
种类众多, 广泛参与各种生理生化代谢途径, 预示
着斑点形成的机制十分复杂, 加强对斑点突变体的
发掘鉴定与功能的深入研究, 有利于阐明斑点叶介
导的抗性分子机制, 也有助于探讨该类抗性在作物
育种中的应用。
我们从 EMS 诱变籼稻 IR64 的突变体库筛选到
一个褐色斑点叶突变体 HM113。本文针对突变体的
农艺性状、生理生化、白叶枯病抗性、基因定位等
进行了研究。明确了 HM113是一个广谱增强的白叶
枯病抗性突变体, 该斑点叶性状受一对新的显性基
因控制。本研究为该基因的克隆、功能分析和白叶
枯病抗性机制的阐明奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
籼稻品种 IR64经 EMS诱变获得的斑点叶突变体
HM113, 经过连续多代自交, 斑点叶性状在海南陵水
和浙江富阳均能稳定遗传。2014 年, 在成熟期随机选
取突变体和野生型各 3 株分别考查株高、穗长、有效
穗数、每穗实粒数、结实率和千粒重, 取其平均值。
1.2 遮光处理
参照 Feng等[6]的方法, 在分蘖盛期用宽约 1 cm
锡箔纸对突变体 HM113 剑叶的无斑部位和野生型
IR64 相同部位叶片遮光处理, 跟踪观察斑点的发生
情况, 同时观察去除锡箔纸 7 d后斑点的变化。
1.3 生理指标测定
分蘖盛期 , 取突变体和野生型相同部位叶片 ,
参照 Arnon[19]和 Wellburn[20]的方法测定叶绿素含量
和类胡萝卜素含量; 赵世杰等[21]的方法测定可溶性
蛋白含量(soluble protein content, SP)和丙二醛含量
(malonaldehyde content, MDA)。在抽穗期, 晴天上午
10:00—11:00 利用便携式光合测定仪 Li-6400
(LI-COR, USA)测定突变体和野生型剑叶光合作用,
按 Huang等[22]的方法设定光合参数。对每个生理指
标重复测定 3次, 取平均值。
1.4 组织化学分析
取突变体和野生型分蘖盛期剑叶, 采用苔盼蓝
染色法检测细胞死亡状况 [23], 利用二氨基联苯
(diamino benzidine, DAB)和氮蓝四 唑 (nitroblue
tetrazolium, NBT)染色法[17]分别检测过氧化氢(H2O2)
和超氧阴离子(O2܋ )沉积情况, 将以上脱色后的叶片
用 70%的甘油封片并照相记录。
1.5 活性氧清除相关酶活性测定
参照赵世杰等[21]的方法分别测定突变体HM113
和野生型 IR64 在分蘖盛期剑叶中的过氧化氢酶
(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶 (superoxide dis-
mutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)和抗坏
血酸氧化酶(ascorbate peroxidase, APX)的活性。重复
测定 3次, 取平均值。
968 作 物 学 报 第 42卷
1.6 白叶枯病抗性鉴定
选取国内外 8 个水稻白叶枯病菌(Xanthomonas
oryzae pv. oryzae)小种的 10个代表菌株, 包括菲律
宾菌株 PXO71 (Race 4)、PXO112 (Race 5)、PXO339
(Race 9a)、PXO347 (Race 9c)和 PXO349 (Race 9b)
以及中国菌株 JS97-2 (I)、HB17 (II)、Zhe173 (IV)、
GD1358 (V)和 OS-225 (VII), 利用WF-P灭菌培养基
在 28℃培养箱中活化 3~4 d, 再转移至新的培养基
中继续培养 3~4 d后, 用灭菌水稀释配制成 OD600约
为 1.0的悬浮液。在分蘖盛期, 采用剪叶法[24]对感病
对照 IR24、野生型 IR64和突变体 HM113的全展叶
接种, 以灭菌的手术剪每蘸取一次菌液仅剪去一片
叶的约 2 cm叶尖, 每个小种接种 3个单株, 每株 3~4
片叶。21 d后测量病斑的长度, 取 10片叶病斑长度
的平均值。
为明确突变体对白叶枯病的抗性增强是否与斑
点相关, 选用突变体和野生型对白叶枯病抗性存在
显著差异的菌株 PXO349, 接种 HM113/IR64回交 F2
群体的 184个有斑植株和 65个无斑单株, 21 d后测
量病斑的长度。
1.7 抗病相关基因表达分析
分蘖盛期, 参照 TRIzol Reagent试剂盒(Aidlab,
China)的方法分别提取 HM113 和 IR64 的剑叶总
RNA, 利用 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with
gDNA Remover (Toyobo, Japan)试剂盒将 RNA反转
录为 cDNA。采用 SYBR Premix Ex Taq II (Tli
RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa, Japan)和 Thermal Cy-
cle Dice Real Time System (TaKaRa, Japan)进行实时
定量 PCR分析。以水稻 Actin1为内参基因, 相关基
因的特异性引物序列见表 1。
表 1 实时定量 PCR引物
Table 1 Primers used in Real-time PCR
基因
Gene
正向引物
Forward primer (5−3)
反向引物
Reverse primer (5−3)
登录号
Gene ID
Actin1 CAGCACATTCCAGCAGAT GGCTTAGCATTCTTGGGT LOC_Os03g50885
AOS2 CTCGTCGGAAGGCTGTTGCT ACGATTGACGGCGGAGGTT LOC_Os03g12500
PAL4 CTTCACAACAGCTAATCGAG CGCACTCCATTTCAGTACCA LOC_Os02g41680
NH1 GGCGAAGAGAGCCTAAAAT TAACCCCAAAGTAATCCCCT AY923983
PR10 CACCATCTACACCATGAAGC AGCACATCCGACTTTAGGAC D38170
PR1B GTGTGCGGGCACTACACG CGGCTTATAGTTGCATGTGA B1096D0
LOX GATGGCGGTGCTCGACGTGCT GCACCTGTTCTTGAGCTTTCTAT D14000
1.8 突变体 HM113的遗传分析与基因定位
以 HM113 为母本, 分别与 4 个正常叶色品种
02428、Moroberekan、Nekken 1和 CPSLO17配制杂
交组合, 观察 F1 表型; 并利用来源于 HM113/Mor
oberekan、HM113/Nekken 1 和 HM113/CPSLO17 的
F2 群体进行性状分离分析。此外 , 利用来源于
HM113/CPSLO17的 2个 F3分离株系进行遗传验证。
采用简易法 [25]提取亲本及定位群体 (HM113/
02428, HM113/Moroberekan, HM113/CPSLO17)中无
斑 F2单株的 DNA。用分布于 12条染色体上的 1014
对 SSR 引物进行亲本间的多态性标记筛选, 将筛选
到的多态性标记用于 HM113/02428 F2群体的 106个
无斑单株的基因型鉴定, 初步确定与斑点叶基因连
锁的标记。根据初定位的结果 , 进一步利用
HM113/Moroberekan 和 HM113/CPSLO17 两个群体
的 698个 F2无斑单株精细定位。其中 SSR引物序列
来源于 Gramene 数据库 (http://www.gramene.org/),
引物由上海生工生物工程有限公司合成。参照 Shi
等[26]的 PCR和产物检测方法。
2 结果与分析
2.1 突变体 HM113的表型
在杭州大田自然条件下, 播种后约 20 d, 突变
体老叶上开始出现模糊的褐色斑点, 而后斑点变大
颜色变深, 逐渐连接成线状, 抽穗期扩散至整个叶
片(图 1-A, B, C), 始穗期叶鞘处也有褐色斑点产生
(图 1-D)。除始穗期比野生型晚约 9 d外, 突变体的
有效穗数显著低于野生型, 株高、穗长、每穗实粒数、
结实率和千粒重则极显著低于野生型(表 2)。而突变
体株高变矮, 是由第五节间显著缩短所致(图 2)。
第 7期 郭 丹等: 一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位 969
图 1 突变体 HM113的表型
Fig. 1 Phenotype of the mutant HM113
A: 苗期叶片; B: 分蘖期叶片; C: 抽穗期叶片; D: 抽穗期叶鞘。
A: leaves at seedling stage; B: leaves at tillering stage; C: leaves at heading stage; D: sheaths at heading stage.
表 2 野生型 IR64和突变体 HM113的主要农艺性状表现
Table 2 Performance of agronomic traits between IR64 and HM113
材料
Material
株高
Plant height (cm)
穗长
Panicle length (cm)
有效穗数
No. of panicles
每穗实粒数
No. of filled grain/panicle
结实率
Seed-setting rate (%)
千粒重
1000-grain weight (g)
IR64 104.45±5.51 27.00±1.28 14.25±1.50 109.98±2.65 86.49±0.02 24.36±0.59
HM113 83.67±2.06** 20.60±1.73** 11.33±0.58* 30.76±2.89** 50.41±0.01** 19.25±0.35**
*显著差异(P≤0.05); **极显著差异(P≤0.01)。
* Significantly different at P≤0.05; ** Significantly different at P≤0.01.
图 2 野生型 IR64和突变体 HM113的节间长度
Fig. 2 Length of internode of the wild type IR64 and the
mutant HM113
*显著差异(P≤0.05)。* Significantly different at P≤0.05.
2.2 突变体 HM113的褐斑产生受光照诱导
在大田条件下为明确光照对斑点产生的影响 ,
对突变体和野生型叶片遮光处理。7 d后突变体遮光
部位没有产生褐色斑点, 未遮光部位产生褐色斑点
(图 3-C); 去除锡箔纸后 7 d 后, 突变体原来遮光部
位开始产生褐色斑点(图 3-D)。表明突变体叶片褐斑
的产生受自然光的诱导。
图 3 光照对突变体 HM113产生斑点的影响
Fig. 3 Effect of sun-light on lesion initiation in HM113
A: IR64; B: HM113; C: HM113无斑叶遮光处理 7 d后; D: HM113
遮光部位恢复光照 7 d后。黑框内为遮光部位。
A: IR64; B: HM113; C: non-spotted leaf of HM113 shaded for seven
days; D: HM113 shaded leaf re-lit for seven days. Rectangular box
indicates the shaded area.
970 作 物 学 报 第 42卷
2.3 突变体 HM113的生理指标变化
与野生型 IR64相比, 突变体 HM113的叶绿素 a
含量、叶绿素 b 含量、叶绿素 a/b 比值和类胡萝卜
素含量均极显著降低(表 3), 说明突变体斑点的产生
可能影响了光合色素的代谢。且突变体的净光合速
率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间 CO2 浓度(Ci)和蒸腾速
率(Tr)极显著降低(图 4-A, B, C, D), 可能与单位面积
内斑点的产生减少了叶片的有效光合面积有关。
HM113中 SP含量比 IR64极显著降低, MDA含量有
所上升但并无显著差异(图 4-E, F), 表明分蘖盛期斑
点的产生并未引起突变体的早衰。
2.4 突变体 HM113的细胞坏死与 ROS沉积
为检测突变体叶片斑点处的细胞是否已经死亡,
利用苔盼蓝染色法进行鉴定。结果显示野生型叶片
呈均一的蓝色(图 5-B), 突变体叶片斑点处呈深蓝色
(图 5-D), 表明突变体斑点处细胞已经死亡。活性氧
(ROS)的大量累积对细胞具有明显的毒害作用, DAB
和 NBT能够分别与植物中的 H2O2和 O2܋ 反应, 以检
测组织中是否有 ROS的累积。DAB染色后, 仅突变
体叶片上沉积了大量的红褐色物质(图 5-H); NBT染
色后, 野生型叶片有少数蓝色染斑(图 5-J), 而突变
体叶片产生了大量蓝色染斑(图 5-L), 说明活性氧
H2O2和 O2܋ 的积累导致了突变体叶片的死亡。
2.5 突变体 HM113的活性氧清除酶活性变化
正常植物体内活性氧(ROS)的产生与清除处于
动态平衡中, 若该平衡遭到破坏, 就会引起 ROS 的
大量累积并对细胞造成氧胁迫, 引起细胞损伤甚至
死亡。为探究突变体中积累大量 ROS的机制, 测定
表 3 野生型 IR64和突变体 HM113的光合色素含量
Table 3 Photosynthetic pigment contents of IR64 and HM113
材料
Material
叶绿素 a
Chlorophyll a (mg g–1)
叶绿素 b
Chlorophyll b (mg g–1)
叶绿素 a/b
Chlorophyll a/b
类胡萝卜素
Carotenoid (mg g–1)
IR64 3.66±0.11 1.11±0.03 3.30±0.17 0.58±0.01
HM113 2.05±0.13** 0.65±0.05** 3.18±0.20** 0.43±0.03**
**极显著差异(P≤0.01)。**Significantly different at P≤0.01.
图 4 野生型 IR64和突变体 HM113的生理指标
Fig. 4 Physiological parameters of wild type IR64 and the mutant HM113
A: 净光合速率(Pn); B: 气孔导度(Gs); C: 胞间 CO2浓度(Ci); D: 蒸腾速率(Tr); E: 可溶性蛋白(SP)含量; F: 丙二醛(MDA)含量。
**极显著差异(P≤0.01)。
A: net photosynthetic rate (Pn); B: stomatal conductance (Gs); C: intercellular CO2 concentration (Ci); D: transpiration rate (Tr); E: soluble
protein content (SP); F: malonaldehyde content (MDA). ** Significantly different at P≤0.01.
第 7期 郭 丹等: 一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位 971
图 5 突变体 HM113的组织化学染色
Fig. 5 Histochemical analysis of the mutant HM113
A: IR64苔盼蓝染色前; B: IR64苔盼蓝染色后; C: HM113苔盼蓝染色前; D: HM113苔盼蓝染色后; E: IR64 DAB染色前; F: IR64 DAB
染色后; G: HM113 DAB染色前; H: HM113 DAB染色后; I: IR64 NBT染色前; J: IR64 NBT染色后; K: HM113 NBT染色前; L: HM113
NBT染色后。
A: IR64 before trypan blue staining; B: IR64 after trypan blue staining; C: HM113 before trypan blue staining; D: HM113 after trypan blue
staining; E: IR64 before DAB staining; F: IR64 after DAB staining; G: HM113 before DAB staining; H: HM113 after DAB staining; I: IR64
before NBT staining; J: IR64 after NBT staining; K: HM113 before NBT staining; L: HM113 after NBT staining.
了分蘖盛期叶片中抗氧化系统重要酶的活性。与野
生型相比, 突变体的 CAT 活性极显著降低, SOD 活
性显著降低, POD活性极显著上升, 而 APX活性没
有显著变化(图 6), 以上结果表明突变体的活性氧清
除系统遭到破坏。
2.6 突变体 HM113对白叶枯病菌的抗性增强
与野生型相比, 突变体对菌株 HB17、PXO71、
JS97-2、PXO112、Zhe173、PXO339、PXO347 和
PXO349 抗性极显著增强 ; 对菌株 GD1358 和
OS-225 的抗性则无明显差异(图 7-A)。选用菌株
图 6 突变体 HM113活性氧清除酶活性变化
Fig. 6 Activities of reactive-oxygen-scavenging enzymes in the mutant HM113
A: 过氧化氢酶(CAT)活性; B: 超氧化物歧化酶(SOD)活性; C: 过氧化物酶(POD)活性; D: 抗坏血酸氧化酶(APX)活性。*显著差异
(P≤0.05); **极显著差异(P≤0.01)。
A: CAT activity; B: SOD activity; C: POD activity; D: APX activity. * Significantly different at P ≤ 0.05; **Significantly different at P ≤ 0.01.
972 作 物 学 报 第 42卷
图 7 突变体 HM113的白叶枯病抗性
Fig. 7 Resistance of mutant HM113 to Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)
A: IR64和 HM113的白叶枯病抗性反应; B: HM113/IR64的 F2群体对 PXO349的抗性反应。NO-SPL: 无斑单株; SPL: 有斑单株。
**极显著差异(P≤0.01)。
A: reaction of IR64 and HM113 to Xoo; B: reaction of F2 individuals derived from IR64/HM113 to PXO349. NO-SPL: no-spotted plant;
SPL: spotted-plant. ** Significantly different at P ≤ 0.01.
PXO349接种 HM113/IR64回交 F2群体, 其中 184个
有斑植株的病斑平均长度为 6.96 cm ± 2.04 cm, 极
显著低于 65个无斑植株的 13.58 cm ± 1.07 cm (图
7-B)。说明突变体对白叶枯病菌的抗性普遍增强, 且
抗性增强与褐斑的存在高度相关。
2.7 突变体 HM113的防卫反应基因表达增强
为了解突变体对白叶枯病的抗性机制, 利用实
时定量 PCR检测突变体和野生型中 6个防卫反应基
因的表达, 这些基因分别编码丙二烯氧化物合酶 2
(alleneoxide synthase 2, AOS2) 、 脂 氧 合 酶
(lipoxygenase, LOX)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanin
ammonia lyase, PAL4)、病程相关蛋白(pathogenesis-
related protein) PR10 和 PR1b 以及病程相关因子
NPR1的同源物(NPR1 homolog, NH1)。结果表明, 突
变体中这 6 个基因的表达水平均比野生型极显著上
升(图 8), 说明褐斑的产生激活了突变体相关防卫反
应基因的表达。
2.8 突变体 HM113 的褐斑表型受单显性基因控
制
来源于 HM113/02428、HM113/Moroberekan、
HM113/Nekken 1和 HM113/CPSLO17组合的所有 F1
植株均呈现褐色斑点表型, 但褐斑的数量较突变体
少, 说明突变体的褐斑性状受显性基因控制, 但存
在剂量效应(也有学者称为半显性)。HM113/Morob
erekan、HM113/Nekken 1和 HM113/CPSLO17的 F2
群体的有斑单株与无斑单株数均符合 3∶1 (χ20.05 =
3.84)的分离比(表 4), 来源于 HM113/CPSLO17的
2个 F3分离株系的有斑单株数与无斑单株数的分
离比也都符合 3∶1 (数据未发表)。说明突变体褐
斑性状受单显性基因控制 , 暂将该基因命名为
SplHM113。
为定位该显性基因, 挑选出均匀分布于 12条染
色体上 HM113 和 02428 间的多态性 SSR 标记 139
对, 用 HM113/02428的 F2群体的 106个无斑单株初
定位, 将斑点叶基因定位在第 7 染色体 RM1135 和
RM432 之间。进一步利用来自 HM113/Moroberekan
和 HM113/CPSLO17 F2群体的 698 个无斑植株进行
精细定位 , 将基因 SplHM113 定位在 RM21605 和
RM418之间, 物理距离约 308 kb (图 9)。
图 8 突变体 HM113中防卫反应基因的表达分析
Fig. 8 Expression level of defense-related genes in HM113
**极显著差异(P ≤ 0.01)。** Significantly different at P ≤ 0.01.
第 7期 郭 丹等: 一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位 973
表 4 斑点叶突变体 HM113的遗传分析
Table 4 Genetic analysis of HM113
F2 组合
Cross
F1 总植株数
Total No. of plants
有斑单株数
No. of spotted plants
无斑单株数
No. of normal plants
χ2 (3:1)
HM113/Moroberekan 斑点叶 Spotted plant 865 672 193 3.33
HM113/Nekken 1 斑点叶 Spotted plant 408 298 110 0.84
HM113/CPSLO17 斑点叶 Spotted plant 2076 1563 513 0.09
图 9 斑点叶基因 SplHM113的定位
Fig. 9 Physical location of SplHM113 on chromosome 7
3 讨论
自第一个水稻斑点叶突变体被报道以来, 越来
越多的水稻斑点叶突变体得到鉴定。斑点叶突变体
在无明显逆境或病原菌侵染条件下, 在叶片上自发
产生斑点 , 并伴随农艺性状的改变 , 如 spl31[27]、
spl21[28]和 lmm6[29]。本研究的突变体 HM113播种后
20 d 左右, 老叶上出现褐色斑点, 抽穗期扩散至整
个叶片, 同时叶鞘处也有褐色斑点产生。与 IR64相
比, HM113的植株变矮, 穗变短, 有效穗数和每穗实
粒数减少, 结实率和千粒重下降。坏死性斑点的产
生降低了叶片中单位面积的光合色素含量、气孔导
度和胞间 CO2 浓度, 导致突变体净光合速率降低 ,
进而影响突变体的农艺性状。
ROS是植物细胞内部氧化还原反应的产物。正
常情况下, 植物内部多余的 ROS能够被抗氧化剂及
时清除; 在胁迫环境下, 当植物细胞内的 H2O2浓度
瞬时达到 1 mol L–1时, 活性氧清除系统就会遭到破
坏[30]。活性氧清除系统包括 CAT、SOD和 POD等。
与 CAT和 SOD的清除活性氧的功能不同, POD是一
种多功能酶, 既能协助清除叶绿体中 H2O2[31], 又能
直接或间接催化形成 H2O2和 O2܋ , 研究报道细胞壁
上的 POD 参与了植物体内 ROS 迸发[32-34]。本研究
中, 突变体 HM113 叶片中活性氧的瞬时大量产生,
以及 CAT和 SOD活性显著降低, POD活性显著上升
可能是导致叶片产生大量 ROS的主要原因。
许多水稻斑点叶突变体对白叶枯病或稻瘟病具
有较强的抗性。加强对斑点叶突变体的研究有利于
揭示植物的抗性机制。如 spl28对白叶枯病和稻瘟病
的抗性增强可能与防卫反应基因 PR1、PR2 的激活
以及胼胝质、酚类物质和植物抗毒素的累积有关[17];
类病变突变体 spl5 对白叶枯病抗性增强与接种后的
保护酶 POD和 PAL活性提高、OsPR1和 OsPR8基
因表达水平提高具有紧密的联系[35]。研究报道 ROS
大量累积会影响植物的水杨酸(SA)或茉莉酸(JA)抗
性途径 , 增强对病原菌的抗性; 此外 , 引起的氧化
胁迫对细胞具有毒害作用, 引起细胞死亡, 并使植
物产生获得性免疫抗性 [36-37]。本研究中 , 突变体
HM113对 8个水稻白叶枯病菌小种的抗性均明显增
强, 该抗性与褐斑的产生高度相关。推测褐斑发生
过程中, 叶片中积累了大量的 H2O2 和 O2܋ , 引起褐
斑部位及其周围细胞坏死, 阻止了病原菌的进一步
侵染; 同时激活防卫反应基因 AOS2、PAL4、PR10
和 PR1b等的表达, 提高了突变体的抗病性。
迄今为止, 水稻中已经鉴定了 10个显性斑点叶
突变体, 其中仅 NH1[38]、OsAT1[39]和 Spl32(t)[40] 3个
显性斑点叶基因被鉴定, 分别位于第 1、第 10 和第
11染色体。NH1是与拟南芥 NPR1同源的病程相关
因子, 能拮抗调控 SA 和 JA 响应基因, NH1 的过表
达能提高植株对白叶枯病的抗性[41-42]; OsAT1 编码
974 作 物 学 报 第 42卷
一个酰基转移酶, 其突变体中 PR基因表达上调, 植
保素(稻壳酮和樱花素)含量升高, 对稻瘟病的抗性
增强[39]。目前在第 7 染色体上鉴定了 3 个斑点叶基
因, 其中 lems1[43]位于长臂 RM1364和 RM420之间,
spl5[44]位于短臂 SSR7和 RM7121之间, splNF4050-8[45]
位于短臂 NBARC1和 RM8262之间, 可能与 spl5等
位或紧密连锁 , 这些斑点性状均由单隐性基因控
制。本研究的斑点叶基因 SplHM113被定位于第 7染色
体长臂 RM21605 和 RM418 之间, 该区间内未有显
性斑点叶基因的报道, 因此 SplHM113是一个新的斑点
叶基因。
4 结论
斑点叶突变体HM113褐色斑点的产生受光照的
诱导并影响光合色素含量、光合作用以及主要农艺
性状。突变体的 ROS 清除系统的失衡包括 CAT 和
SOD活性显著降低及 POD活性显著上升, 可能是引
起 ROS沉积与细胞坏死的主要原因。此外, 突变体
HM113 对白叶枯病抗性的显著增强可能与 ROS 的
累积及防卫反应基因的激活表达有关。新型显性斑
点叶基因 SplHM113的鉴定, 为该基因的克隆与功能研
究奠定了基础, 有利于进一步解析类病斑介导的植
物抗性机制和探讨该类型抗性在作物育种中的应用
前景。
References
[1] Heath M C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol
Biol, 2000, 44: 321–334
[2] 夏启中, 吴家和, 张献龙. 与植物超敏反应(HR)相关的细胞编
程性死亡. 华中农业大学学报, 2005, 24: 97–103
Xia Q Z, Wu J H, Zhang X L. Review on hypersensitive re-
sponse-related PCD in plant. J Huazhong Agric Univ, 2005, 24:
97–103 (in Chinese with English abstract)
[3] Durrant W E, Dong X. Systemic acquired resistance. Annu Rev
Phytopathol, 2004, 42: 185–209
[4] Hu G, Yalpani N, Briggs S P, Johal G S. A porphyrin pathway
impairment is responsible for the phenotype of a dominant dis-
ease lesion mimic mutant of maize. Plant Cell, 1998, 10:
1095–1105
[5] Balague C, Lin B, Alcon C, Flottes G, Malmstrom S, Kohler C,
Neuhaus G, Pelletier G, Gaymard F, Roby D. HLM1, an essential
signaling component in the hypersensitive response, is a member
of the cyclic nucleotide-gated channel ion channel family. Plant
Cell, 2003, 15: 365–379
[6] Feng B H, Yang Y, Shi Y F, Shen H C, Wang H M, Huang Q N,
Xu X, Lv X G, Wu J L. Characterization and genetic analysis of a
novel rice spotted-leaf mutant HM47 with broad-spectrum resis-
tance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae. J Integr Plant Biol,
2013, 55: 473–483
[7] Shen H C, Shi Y F, Feng B H, Wang H M, Xu X, Huang Q N, Lv
X G, Wu J L. Identification and genetic analysis of a novel rice
spotted-leaf mutant with broad-spectrum resistance to Xantho-
monas oryzae pv. oryzae. J Integr Agric, 2014, 13: 713–721
[8] 李小红, 施勇烽, 张晓波, 奉保华, 宋莉欣, 王惠梅, 徐霞, 黄
奇娜, 郭丹, 吴建利. 水稻斑点叶突变体 hm197的鉴定及其基
因定位. 中国水稻科学, 2015, 29: 447–456
Li X H, Shi Y F, Zhang X B, Feng B H, Song L X, Wang H M,
Xu X, Huang Q N, Guo D, Wu J L. Identification and gene map-
ping of a spotted leaf mutant hm197 in rice. Chin J Rice Sci, 2015,
29: 447–456 (in Chinese with English abstract)
[9] Jung Y H, Lee J H, Agrawal G K, Rakwal R, Kim J A, Shim J K,
Lee S K, Jeon J S, Koh H J, Lee Y H, Iwahashi H, Jwa N S. The
rice (Oryza sativa) blast lesion mimic mutant, blm, may confer
resistance to blast pathogens by triggering multiple defense-
associated signaling pathways. Plant Physiol Biochem, 2005, 43:
397–406
[10] Wu C, Bordeos A, Madamba M R, Baraoidan M, Ramos M,
Wang G L, Leach J E, Leung H. Rice lesion mimic mutants with
enhanced resistance to diseases. Mol Genet Genomics, 2008, 279:
605–619
[11] Fujiwara T, Maisonneuve S, Isshiki M, Mizutani M, Chen L,
Wong H L, Kawasaki T, Shimamoto K. Sekiguchi lesion gene
encodes a cytochrome P450 monooxygenase that catalyzes con-
version of tryptamine to serotonin in rice. J Biol Chem, 2010, 285:
11308–11313
[12] Wang L, Pei Z, Tian Y, He C. OsLSD1, a rice zinc finger protein,
regulates programmed cell death and callus differentiation. Mol
Plant Microbe Interact, 2005, 18: 375–384
[13] Sun C, Liu L, Tang J, Lin A, Zhang F, Fang J, Zhang G, Chu C.
RLIN1, encoding a putative coproporphyrinogen III oxidase, is
involved in lesion initiation in rice. J Genet Genomics, 2011, 38:
29–37
[14] Sakuraba Y, Rahman M L, Cho S H, Kim Y S, Koh H J, Yoo S C,
Paek N C. The rice faded green leaf locus encodes protochloro-
phyllide oxidoreductase B and is essential for chlorophyll synthe-
sis under high light conditions. Plant J, 2013, 74: 122–133
[15] Yamanouchi U, Yano M, Lin H, Ashikari M, Yamada K. A rice
spotted leaf gene, Spl7, encodes a heat stress transcription factor
protein. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 7530–7535
[16] Jiang C J, Shimono M, Maeda S, Inoue H, Mori M, Hasegawa M,
Sugano S, Takatsuji H. Suppression of the rice fatty-acid desatu-
rase gene OsSSI2 enhances resistance to blast and leaf blight dis-
eases in rice. Mol Plant Microbe Interact, 2009, 22: 820–829
[17] Qiao Y, Jiang W, Lee J, Park B, Choi M S, Piao R, Woo M O,
Roh J H, Han L, Paek N C, Seo H S, Koh H J. SPL28 encodes a
clathrin-associated adaptor protein complex 1, medium subunit
micro 1 (AP1M1) and is responsible for spotted leaf and early
senescence in rice (Oryza sativa). New Phytol, 2010, 185:
258–274
[18] Fekih R, Tamiru M, Kanzaki H, Abe A, Yoshida K, Kanzaki E,
Saitoh H, Takagi H, Natsume S, Undan J R, Undan J, Terauchi R.
The rice (Oryza sativa L.) LESION MIMIC RESEMBLING,
which encodes an AAA-type ATPase, is implicated in defense
response. Mol Genet Genomics, 2015, 290: 611–622
[19] Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplasts poly-
第 7期 郭 丹等: 一个水稻显性斑点叶突变体的鉴定和基因精细定位 975
phenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol, 1949, 24: 1–15
[20] Wellburn A R. The spectral determination of chlorophyll a and b,
as well as total carotenoids, using various solvents with spec-
tro-photometers of different resolution. Plant Physiol, 2015, 144:
307–313
[21] 赵世杰, 史国安, 董新纯. 植物生理学实验指导. 北京: 中国
农业科学技术出版社, 2002. pp 134–143
Zhao S J, Shi G A, Dong X C. Plant Physiology Experiment In-
struction. Beijing: China Agricultural Science and Technology
Press, 2002. pp 134–143 (in Chinese)
[22] Huang Q N, Shi Y F, Zhang X B, Song L X, Feng B H, Wang H
M, Xu X, Li X H, Guo D, Wu J L. Single base substitution in
OsCDC48 is responsible for premature senescence and death
phenotype in rice. J Integr Plant Biol, 2016, 58: 12–28
[23] Yin Z, Chen J, Zeng L, Goh M, Leung H, Khush G S, Wang G L.
Characterizing rice lesion mimic mutants and identifying a mu-
tant with broad-spectrum resistance to rice blast and bacterial
blight. Mol Plant Microbe Interact, 2000, 13: 869–876
[24] Kauffman H E, Reddy A P D, Ksiek S P V, Marca S D. An im-
proved technique for evaluating resistance of rice varieties to
Xanthomonas oryzae. Plant Dis Rep, 1973, 57: 537–541
[25] 卢扬江, 郑康乐. 提取水稻 DNA 的一种简易方法. 中国水稻
科学, 1992, 6: 47–48
Lu Y J, Zheng K L. A simple method for isolation of rice DNA. Chin
J Rice Sci, 1992, 6: 47–48 (in Chinese with English abstract)
[26] Shi Y F, Chen J, Liu W Q, Huang Q N, Shen B, Leung H, Wu J L.
Genetic analysis and gene mapping of a new rolled-leaf mutant in
rice (Oryza sativa L.). Sci China Ser C: Life Sci, 2009, 52:
885–890
[27] 代高猛, 朱小燕, 李云峰, 凌英华, 赵芳明, 杨正林, 何光华.
水稻类病斑突变体 spl31 的遗传分析与基因定位. 作物学报,
2013, 39: 1223–1230
Dai G M, Zhu X Y, Li Y F, Ling Y H, Zhao F M, Yang Z L, He G
H. Genetic analysis and fine mapping of a lesion mimic mutant
spl31 in rice. Acta Agron Sin, 2013, 39: 1223–1230 (in Chinese
with English abstract)
[28] 宋莉欣, 黄奇娜, 奉保华, 施勇烽, 张晓波, 徐霞, 王惠梅, 李
小红, 赵宝华, 吴建利. 水稻斑点叶突变体 spl21 的鉴定与基
因定位. 作物学报, 2015, 41: 1519–1528
Song L X, Huang Q N, Feng B H, Shi Y F, Zhang X B, Xu X,
Wang H M, Li X H, Zhao B H, Wu J L. Characterization and
gene mapping of a spotted-leaf mutant spl21 in rice (Oryza sativa
L.). Acta Agron Sin, 2015, 41: 1519–1528 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[29] Xiao G Q, Zhang H W, Lu X Y, Huang R F. Characterization and
mapping of a novel light-dependent lesion mimic mutant lmm6 in
rice (Oryza sativa L.). J Integr Agric, 2015, 14: 1687–1696
[30] Jacks Thomas J, Davidonis Gayle H. Superoxide, hydrogen per-
oxide, and the respiratory burst of fungally infected plant cells.
Mol Cellular Biochem, 1996, 158: 77–79
[31] Asada K. Ascorbate peroxidase-a hydrogen peroxide-scavenging
enzyme in plants. Physiol Plant, 1992, 85: 235–241
[32] Minibayeva F, Beckett R P, Kranner I. Roles of apoplastic per-
oxidases in plant response to wounding. Phytochemistry, 2015,
112: 122–129
[33] Kawano T. Roles of the reactive oxygen species-generating
peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant
Cell Rep, 2003, 21: 829–837
[34] Whitaker C, Beckett R P, Minibayevab F V, Kranner I. Produc-
tion of reactive oxygen species in excised, desiccated and cryo-
preserved explants of Trichilia dregeana Sond. S Afr J Bot, 2010,
76: 112–118
[35] 金杨. 水稻类病变突变体 spl5 细胞坏死机制及其抗病性的研
究. 浙江师范大学硕士学位论文, 浙江金华, 2009
Jin Y. Mechanisms of Cell Death and Its Resistance in Rice Le-
sion Mimic Mutant spl5. MS Thesis of Zhejiang Normal Univer-
sity, Jinhua, China, 2009 (in Chinese with English abstract)
[36] Kaurilind E, Xu E, Brosche M. A genetic framework for H2O2
induced cell death in Arabidopsis thaliana. BMC Genomics, 2015,
16: 837–853
[37] Kariola T, Brader G, Li J, Palva E T. Chlorophyllase 1, a damage
control enzyme, affects the balance between defense pathways in
plants. Plant Cell, 2005, 17: 282–294
[38] Chern M, Fitzgerald H A, Canlas P E, Navarre D A, Ronald P C.
Overexpression of a rice NPR1 homolog leads to constitutive ac-
tivation of defense response and hypersensitivity to light. Mol
Plant Microbe Interact, 2005, 18: 511–520
[39] Mori M, Tomita C, Sugimoto K, Hasegawa M, Hayashi N, Dub-
ouzet J G, Ochiai H, Sekimoto H, Hirochika H, Kikuchi S. Isola-
tion and molecular characterization of a Spotted leaf 18 mutant
by modified activation-tagging in rice. Plant Mol Biol, 2007, 63:
847–860
[40] 钟振泉, 罗文龙, 刘永柱, 王慧, 陈志强, 郭涛. 一份新的水
稻斑点叶突变体 spl32的鉴定和基因定位. 作物学报, 2015, 41:
861–871
Zhong Z Q, Luo W L, Liu Y Z, Wang H, Chen Z Q, Guo T.
Characterization of a novel spotted leaf mutant spl32 and map-
ping of Spl32(t) gene in rice (Oryza sativa). Acta Agron Sin, 2015,
41: 861–871 (in Chinese with English abstract)
[41] Hwang S H, Hwang D J. Isolation and characterization of the rice
NPR1 promoter. Plant Biotechnol Rep, 2010, 4: 29–35
[42] Yuan Y X, Zhong S H, Li Q, Zhu Z R, Lou Y G, Wang L Y, Wang
J J, Wang M Y, Li Q L, Yang D L, He Z H. Functional analysis of
rice NPR1-like genes reveals that OsNPR1/NHI is the rice
orthologue conferring disease resistance with enhanced herbivore
susceptibility. Plant Biotechnol J, 2007, 5: 313–324
[43] Li Z, Zhang Y X, Liu L, Liu Q E, Bi Z Z, Yu N, Cheng S H, Cao
L Y. Fine mapping of the lesion mimic and early senescence 1
(lmes1) in rice (Oryza sativa). Plant Physiol Biochem, 2014, 80:
300–307
[44] Chen X F, Pan J W, Cheng J, Jiang G H, Jin Y, Gu Z M, Qian Q,
Zhai W X, Ma B J. Fine genetic mapping and physical delimita-
tion of the lesion mimic gene spotted leaf 5 (spl5) in rice (Oryza
sativa L.). Mol Breed, 2009, 24: 387–395
[45] Babu R, Jiang C J, Xu X, Kottapalli K R, Takatsuji H, Miyao A,
Hirochika H, Kawasaki S. Isolation, fine mapping and expression
profiling of a lesion mimic genotype, spl(NF4050-8) that confers blast
resistance in rice. Theor Appl Genet, 2011, 122: 831–854