全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(6): 861871 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划 (863计划 )项目 (2012AA101201), 国家自然科学基金项目 (31200250)和广东省科技计划项目
(2011A020102004)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 郭涛, E-mail: guo.tao@vip.163.com; 陈志强, E-mail: chenlin@scau.edu.cn
第一作者联系方式: 钟振泉, E-mail: zhongzhq1990@163.com; 罗文龙, E-mail: lovenlong@163.com
**同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-11-06; Accepted(接受日期): 2015-03-19; Published online(网络出版日期): 2015-03-30.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150330.1614.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00861
一份新的水稻斑点叶突变体 spl32的鉴定和基因定位
钟振泉** 罗文龙** 刘永柱 王 慧 陈志强* 郭 涛*
华南农业大学 / 国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东广州 510642
摘 要: 从 F2 (粤晶丝苗 2号/H4) 群体中, 鉴定出一份显性斑点叶突变体 spl32 (spotted leaf 32)。其叶片褐色斑点受
自然光诱导, 在幼穗分化期从叶尖逐渐扩散至叶鞘, 台盼蓝染色表明斑点并非由细胞死亡引起。以从 F5杂合个体分
离出的正常叶色植株为对照, 斑点叶植株的穗粒数、结实率显著降低。斑点出现后, spl32的 POD活性和 MDA含量
均显著高于对照; 同时, spl32叶片光合色素含量降低, 但荧光动力学参数并无显著变化。抽穗期人工接菌表明, spl32
对水稻白叶枯病菌抗性较对照显著提高。遗传分析表明 spl32 斑点性状由一个显性基因 Spl32(t)控制 , 利用 F2
(02428/spl32)群体将其定位在第 11染色体 Ind-c和 RM206之间, 推测该基因为一个新的水稻斑点叶基因。
关键词: 水稻; 斑点叶突变体; 白叶枯病抗性; 遗传分析; 基因定位
Characterization of a Novel Spotted Leaf Mutant spl32 and Mapping of Spl32(t)
Gene in Rice (Oryza sativa)
ZHONG Zhen-Quan**, LUO Wen-Long**, LIU Yong-Zhu, WANG Hui, CHEN Zhi-Qiang*, and GUO Tao*
National Engineering Research Centre of Plant Space Breeding / South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: A dominant spotted-leaf mutant of rice was isolated from F2 (Yuejingsimiao 2/H4) population. The mutant, designated
as spl32 (spotted-leaf 32), initiated brown spots on leaf apex at the panicle differentiation period, and then gradually spread them
to whole leaf and sheath. Trypan blue staining indicated that the formation of spots was not caused by cell death. Taken normal
green leaf plants segregated from heterozygous F5 as control (CK), we found seeds per panicle and seed setting rate of spotted leaf
plants were significantly lower than these of CK. After appearance of spots, the POD activity and MDA content of spl32 were
significantly higher than these of CK, while photosynthetic pigment content in spl32 was reduced, without significant changes in
chlorophyll fluorescence parameters. The resistance to rice bacterial blight in spl32 was greatly improved by inoculation of Xan-
thomonas oryzae pv. oryzae at heading period. The spotted-leaf trait of spl32 was verified to be controlled by a dominant gene that
temporarily designated as Spl32(t). The novel rice spotted-leaf gene was mapped between markers Ind-c and RM206 on chromo-
some 11 with a F2 (02428/spl32) population.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Spotted-leaf mutants; Bacterial blight resistance; Genetic analysis; Mapping
植物斑点叶(spotted leaf)突变体是指植物在没
有遭受病原物浸染或明显逆境条件下在叶片或叶鞘
上自发形成斑点的一类突变体[1-2]。突变体产生的斑
点类似于病原菌侵染时产生的病斑, 因此又称为类
病变突变体 (lesion mimic mutants, lmm)或类病斑
(lesion simulating disease)突变体[3]。除少部分突变体
斑点的形成可能由色素积累外, 大部分是由植物本
身细胞死亡引起。这类斑点叶突变体的表型多与病
原菌侵染后的过敏反应(hypersensitive response, HR)
症状类似 [4], 而且许多斑点叶突变体对某些植物病
原物表现出了一定的抗性[5-7], 能激发病程相关蛋白
的表达[2,8-9], 可以提高植株的持久、广谱抗病性。
斑点叶突变体或类病变突变体广泛存在于各种
植物, 包括水稻、玉米、大麦和小麦等[6]。到目前为
862 作 物 学 报 第 41卷
止, 在水稻中至少已经发现了 50多个斑点叶突变体[6],
其中 spl5[10]、spl7[11]、spl11[12]、spl18[13]、spl28[7]、
OsLSD1[14]、NPR1[15]、OsPtila[16]、OsACDR1[17]、OsSSI2[18]、
OsSL[19]、RLIN1[20]、RLS1[21]、NLS1[22]、lms1[23]、lm[24]
和 CHL1[25]等斑点叶或类病变相关基因已经被克隆。
这些基因的作用机制各不相同, 且突变体性状大多
是由局部细胞死亡引起的。如第一个被克隆的水稻
类病变突变基因 spl7负向调控细胞死亡[11]; Zeng等[12]
克隆到的 SPL11 蛋白可能在控制植物细胞死亡及防
御反应的泛素系统中起作用 ; Mori 等 [13]克隆的
SPL18 编码一个酰基转移酶, 与防卫反应基因 PR1
和 PBZ1 的表达相关, 且显著提高对稻瘟病和白叶
枯病的抗性; OsLSD1 编码一个锌指蛋白, 负向调控
细胞死亡[14]; spl5 编码 1 个转录剪接因子 3b 亚基 3
(SF3b3), 与细胞坏死和抗性反应中的 RNA 成熟前
体的剪接相关[10]。可见斑点产生过程非常复杂, 涉
及许多生化代谢途径。因此, 这类突变体对植物过
敏反应激活机制和植物抗病反应机制的研究具有重
要意义。
斑点叶突变体是植物育种中一类重要的抗病种
质资源, 尤其是突变表型对产量、品质等重要农艺
性状无明显影响时 , 有可能在育种中得到直接应
用。在大麦中发现的类病变突变体 mlo, 对几乎所有
已知的白粉病(Erysiphe graminis f. sp. Hordei)生理
小种都具有持久抗性[26]。自 1979 年以来, 带有 mlo
基因的大麦品种一直保持高抗性, 在欧洲许多国家
已经大面积种植[27]。已报道的水稻斑点叶突变体中,
大多数对病原菌抗性出现不同程度增强, 如 spl10、
spl11、spl17、spl28和 spl26等对稻瘟病和白叶枯病
表现出广谱抗性[7,12,28-29]。然而, 大部分突变体在类
病变往往会伴随细胞坏死、植株矮小、产量减少等
不良的农艺性状, 如 spl30、spl31等会导致结实率和
千粒重降低[30-31], spl28、RLS1、lms1等会引起植株
早衰 [13,21,23], 这限制了它们在水稻育种实践中的直
接应用。因此, 不断挖掘和鉴定新的水稻斑点叶突
变体, 对水稻抗病机制研究和抗病育种实践都有重
要意义。
从 2 个正常绿叶品种籼稻粤晶丝苗 2 号和 H4
的 F2群体中, 我们鉴定出了一份新的斑点叶突变体,
暂命名为 spl32 (spotted leaf 32)。通过连续 2年 4代
的观察, 在田间种植条件下, spl32 的突变表型能够
稳定遗传。本研究从形态学、生理生化、遗传机制
等方面对 spl32开展研究, 以期为突变基因的克隆、
功能分析及应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
斑点叶突变体 spl32的 2个亲本中, 粤晶丝苗 2
号系广东省农业科学院水稻研究所选育的优质、高
产、抗病水稻品种, H4是本实验室从中二软占的空
间诱变后代中获得的水稻高抗稻瘟病株系。
以从斑点叶突变体 F5杂合个体分离出的正常叶
色植株为对照, 用于农艺性状、酶活性及抗病性的
对比; 以粳稻日本晴和 02428分别与 spl32杂交, 构
建遗传分析和基因定位的 F2群体。
1.2 表型鉴定
2013年晚季和 2014年早季, 将突变体 spl32和
对照种植于华南农业大学科研教学实验基地, 小区
种植、管理与一般大田相同。全生育期观察田间突
变体的表型, 包括突变体斑点出现的时期、颜色及
分布情况等。成熟后随机选取 10株, 考查株高、单
株穗重、每株有效穗数、每穗粒数、每穗实粒数、
结实率和千粒重等。
1.3 光照对斑点形成的影响
通过遮光试验[32]了解光照对斑点发生的影响。
在大田条件下, 用宽度约为 1 cm的锡箔纸对突变体
spl32叶片已有斑点和无斑点部位进行遮光处理, 7 d
后观察斑点发生及变化情况。
1.4 突变体的组织化学分析
在突变体 spl32 出现斑点后, 取抽穗期突变体
spl32 植株上表现斑点的剑叶及其对照相同部位叶
片进行台盼蓝染色[33]。将叶片浸泡在 70℃的台盼蓝
溶液中, 缓慢真空渗透 5 min, 浸泡 10 min, 然后加
热沸腾 2 min, 室温放置 12 h后于 2.5 g mL–1的水合
氯醛中脱色 3~4 d, 用体视镜观察细胞死亡情况并照
相记录。
1.5 抗活性氧化酶活性测定
分别测定突变体 spl32 和对照在分蘖期、抽穗
期、灌浆期和成熟期的超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、过
氧化氢酶 (catalase, CAT)活性和丙二醛 (malondial-
dehyde, MDA)的含量。
SOD 活性采用 SOD (WST-1 法)测试盒(南京建
成生物工程研究所生产)测定, 该试剂盒采用黄嘌呤
氧化酶法; POD 活性采用愈创木酚法[34]测定, 以每
分钟内 OD470nm变化 0.01 为一个过氧化物酶活性单
第 6期 钟振泉等: 一份新的水稻斑点叶突变体 spl32的鉴定和基因定位 863
位(U); CAT活性采用高锰酸钾滴定法[35]测定; MDA
含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法[36]
测定。
1.6 光合色素含量测定
采用 95%丙酮-乙醇法[37]分别测定突变体 spl32
及其对照抽穗期、扬花期和成熟期的叶片光合色素
含量。将 0.2 g待测样品剪碎, 浸泡于 25 mL的 95%
的丙酮∶乙醇=2∶1 的水溶液中 , 黑暗环境浸泡
48 h, 利用 PE分光光度计测定浸提液的光吸收值, 3
次重复。按 Lichtenthaler 等[38]修正的 Arnon 法计算
叶片叶绿素含量。
1.7 叶绿素荧光动力学参数测定
测定突变体 spl32和对照在抽穗期、扬花期、灌
浆期和成熟期的叶绿素荧光动力学参数。随机选取
长势相对一致的单株各 7 株, 利用 MINI-PAM 型便
携式光合作用测定仪在凌晨时分测定剑叶固定部
位。荧光程序设置为暗处理 30 min, 光强为 6000
μmol m−2 s−1饱和光处理 45 s。光系统 II (PSII)最大
量子产量 Fv/Fm = (FmFo)/Fm; PSII的实际量子产量
∆F/Fm′ = (Fm′F)/Fm′; 光化学猝灭系数 qP = (Fm′Fs)/
(Fm′Fo′); 非光化学淬灭 NPQ = (FmFm′)/Fm′。
1.8 突变体 spl32对水稻白叶枯病的抗性鉴定
用水稻白叶枯病菌 (Xanthomonas oryzae pv.
oryzae, Xoo)分别接种突变体 spl32、对照和 F2 (spl32/
日本晴)及 F2 (02428/spl32)群体。在田间条件下, 选
取播种 60 d后的水稻单株, 每个单株选 3张全展新
叶, 剪叶接种。其中对照和突变体分别接种全展倒
一叶、倒二叶和倒三叶, 3组重复; 2个 F2群体分别
接种有斑点植株和正常绿叶植株各 50 株, 3 周后测
量病斑长度, 并统计分析。
1.9 遗传分析及作图群体的构建
2013 年早季, 以 spl32 为母本、日本晴为父本,
以及以 02428为母本、spl32为父本, 各配制杂交组
合获得相应 F1种子。2013年晚季种植 F1, 2014年早
季种植 F2, 利用 F2分离群体进行斑点叶性状的遗传
分析和基因初步定位。
1.10 基因定位
采用Michelmore等[39]提出的近等基因池分析法
定位目标基因, 即根据 F2表型, 分别选取 15株正常
植株和 15 株突变植株, 剪取等量叶片, 构建正常基
因池和突变基因池。按 CTAB 法[40]提取亲本、基因
池和 F2 群体 DNA。参照 http://www.gramene.org/
microsat/SSR 引物序列 , 根据粳稻日本晴和籼稻
93-11 的序列差异比对设计 Indel 引物, 并由上海生
工生物工程有限公司合成。PCR扩增体系含 2×PCR
Reaction Mix 10 µL (含 100 mmol L–1 KCl、20 mmol
L–1 Tris-HCl、3 mmol L–1 MgCl2、400 mmol L–1
dNTP)、Taq DNA聚合酶(5 U μL–1) 0.2 µL、引物(10
μmol L–1)各 1 µL、模板 DNA 1 µL, 超纯水补至 20
μL。反应条件为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s,
72℃ 30 s, 35个循环; 72℃ 7 min。PCR产物经 8%
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色后读胶。
1.11 图谱构建
F2定位群体中, 将具有 spl32突变亲本带型的单
株记为 A, 具有 02428带型的单株记为 B, 具有杂合
带型的单株记为 H。根据公式[(H+2A)/2n]×100计算
遗传距离并构建连锁图谱, 其中 H 表示定位群体中
出现杂合带型单株的数量, A表示出现 spl32突变带
型的单株数, n表示用于定位的隐性群体总株数。
2 结果与分析
2.1 突变体的表型鉴定和真实性鉴定
田间生长情况下, 早季播种约 45 d后(幼穗分化
期) 突变体 spl32开始在叶尖出现褐色斑点, 此后斑
点由叶边缘向叶片内部扩散, 呈连续状分布; 灌浆
后在叶鞘也逐渐出现斑点(图 1)。spl32 的斑点从幼
穗分化期开始持续到成熟, 属于全生育期扩散型斑
点叶突变体。
田间观察发现, spl32 在成熟期没有明显的早衰
现象。晚季农艺性状分析表明, 与对照相比, spl32
突变体在株高、单株穗重和千粒重等方面无明显差
异; 但每穗粒数显著低于对照, 每穗实粒数和结实
率极显著低于对照(表 1)。
利用均匀分布于 12 条染色体上的 617 个 SSR
标记分析 spl32及其双亲粤晶丝苗 2号和H4的DNA
多态性, 只有 2个标记在 spl32与双亲间存在多态性,
其余位点均与至少一个亲本的条带大小相同。证明
斑点叶突变体 spl32 的确是来源于粤晶丝苗 2 号和
H4, 很可能是自然突变产生的新种质。
2.2 光照对斑点叶突变体 spl32的影响
在自大田条件下, 分蘖盛期无斑点的新叶经遮
光 7 d后, 除遮光部位外, 其余部位正常产生褐色斑
点; 去除锡箔纸 7 d后, 遮光部位重新出现斑点。对
于已经出现斑点的叶片部位, 经遮光处理后, 斑点
没有消失(图 2)。由此可知, spl32突变体的斑点产生
受自然光的诱导。
864 作 物 学 报 第 41卷
图 1 斑点叶突变体 spl32的表型
Fig. 1 Phenotypes of spl32
A: 灌浆期 spl32的田间表型; B: 对照(左)和 spl32 (右)乳熟期的植株表型; C: 对照(左)和 spl32 (右)灌浆期叶片; D: 成熟期 spl32的叶
鞘; E: 灌浆期 spl32的叶片和穗部。
A: field phenotype of spl32 during the filling stage; B: phenotypes of CK (left) and spl32 (right) during the milky stage; C: leaves of CK (left)
and spl32 (right) during the filling stage; D: sheath of spl32 during the mature stage; E: phenotypes of leaf and panicle during the filling stage
in spl32.
表 1 对照(CK)和 spl32的农艺性状分析
Table 1 Agronomic traits of the control (CK) and spl32
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
单株穗重
Panicle weight per
plant (g)
有效穗数
Number of
panicles
每穗粒数
Grain number
per panicle
每穗实粒数
Filled grain number
per panicle
结实率
Seed setting
rate (%)
千粒重
1000-grain
weight (g)
CK 93.60±1.69 22.43±2.83 6.33±0.21 235.80±7.22 217.90±6.73 92.41±0.48 19.68±0.29
spl32 95.08±1.02 20.37±1.41 7.33±0.61 214.87±4.81* 183.20±5.54** 85.13±1.45** 19.24±0.15
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上显著差异。
* Significantly different at P<0.05; ** significantly different at P<0.01.
图 2 遮光对突变体 spl32叶片的影响
Fig. 2 Effects of shading on spl32 leaves
A: 对照; B: 成熟期 spl32叶片; C: 未发生斑点部位遮光 7 d后;
D: 遮光部位恢复光照 7 d后; E: 已有斑点部位遮光 7 d后。
A: CK; B: spl32 during the maturity stage; C: part of non-spotted
leaf after shading for seven days; D: leaf shaded for seven days then
under normal light for seven days; E: spotted leaf after shading for
seven days.
2.3 突变体的组织化学分析
经台盼蓝染色后的对照叶片(图 3-B)和 spl32 叶
片(图 3-D)斑点部位均未出现深蓝色, 表明突变体斑
点部位不存在细胞坏死。对照植株叶片和突变体
spl32 叶片上虽然没有深蓝色斑但有蓝色点分布, 这
些点在整张叶片上分布比较均匀, 这可能是水稻植
株在正常生长过程中的细胞更新。
图 3 spl32突变体的组织化学分析
Fig. 3 Histochemical analysis of spl32
A: 对照叶片; B: 对照叶片染色后; C: 突变体 spl32斑点叶片;
D: 突变体 spl32叶片染色后。
A: control; B: control stained; C: spotted spl32 leaf; D: stained
spl32 leaf.
第 6期 钟振泉等: 一份新的水稻斑点叶突变体 spl32的鉴定和基因定位 865
2.4 抗活性氧化酶活性比较
突变体 spl32和对照在 4个时期的 SOD和 CAT
活力均无显著差异(图 4-A 和 C); 而 POD 活力在抽
穗期和成熟期均显著高于对照, 在灌浆期达到极显
著水平(图 4-B), 由此推测突变体植株体内可能积累
了大量的 H2O2。此外, spl32的 MDA含量在分蘖期、
灌浆期和成熟期与对照无显著差异, 但在抽穗期显
著高于对照(图 4-D); 说明 spl32 在抽穗期积累了更
多的 H2O2, 导致膜系统受损程度高于对照。推测斑
点叶突变体 spl32比对照有更强的抗氧化能力。
图 4 突变体 spl32与对照(CK)各时期的生理学特性比较
Fig. 4 Physiological characteristics of the control (CK) and the spl32 mutant during different growth stages
A: 超氧化物歧化酶(SOD)(U g−1); B: 过氧化物酶(POD)(U min−1 g−1); C: 过氧化氢酶(CAT)(µmol g−1 min−1); D: 丙二醛(MDA)
(µmol g−1); *在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
A: superoxide dismutase (SOD) (U g−1); B: peroxidase (POD) (U min−1 g−1); C: catalase (CAT) (µmol g−1 min−1); D: malondialdehyde (MDA)
(μmol g−1). * Significantly different at P<0.05; ** significantly different at P<0.01.
2.5 光合色素含量比较
在抽穗期(斑点快速扩散), 突变体和对照各色
素指标差异不大; 在扬花期(斑点已大量形成), spl32
的叶绿素、类胡萝卜素、光合色素总量和 Chl a/Chl b
都极显著低于对照; 至成熟期, 突变体的叶绿素 a
和总叶绿素含量显著低于对照, Chl a/Chl b 极显著
低于对照(图 5)。由此可知, spl32斑点的出现可能导
致突变体光合色素含量降低。
2.6 叶绿素荧光动力学参数分析
图 6 表明 spl32 和对照在 4 个时期的 Fv/Fm、
∆F/F′差异都不显著 , 说明 spl32 植株叶片的 PSII
反应中心的能量捕捉效率和实际光合效率与对照
无差异 , 光能转化正常。spl32 和对照在抽穗期和
灌浆期的 qP和 NPQ均差异不显著 , 说明其光合活
性和光保护能力并无显著差异。由此可知 , 突变体
spl32 斑点症状的出现 , 并不会显著影响植株的光
合作用。这可能是突变体在成熟期没有出现早衰
的原因之一。
2.7 突变体 spl32对白叶枯病的抗性
如图7-B, spl32全展倒一叶、倒二叶和倒三叶的
病斑长度均小于对照, 其中倒一叶和倒二叶达到极
显著水平, 说明斑点症状的出现显著提高了植株对
白叶枯病的抗性。抗性差异源于不同功能叶上斑点
面积不同。接菌时斑点面积为倒一叶>倒二叶>倒三
叶(图7-A), 而感病程度为倒一叶<倒二叶<倒三叶 ,
说明植株抗病性与叶片斑点多少有关。
图7表明 , 斑点叶个体对白叶枯病病菌的抗性
明显高于正常绿叶个体。其中, F2(spl32/日本晴)中斑
866 作 物 学 报 第 41卷
点叶个体的病斑平均长度2.28 cm, 极显著低于正常
绿叶的12.49 cm; 约85%的斑点叶植株的病斑小于
3 cm, 而超过60%的正常绿叶植株的病斑长度大于
10 cm (图7-C)。在 F2 (02428/spl32)群体中也得出类
似的结果, 斑点叶植株的病斑平均长度4.69 cm, 极
显著低于正常绿叶植株的14.63 cm (图7-D)。此外, 2
个 F2群体中斑点叶植株的病斑长度也有所不同, 这
可能与两个群体的生育期差异所致。F2 (02428/spl32)
群体的抽穗期要比 F2(spl32/日本晴)群体的迟, 在接
种时 F2(02428/spl32)中斑点叶个体上的斑点面积也
图 5 突变体 spl32和对照(CK)各时期叶片光合色素含量分析
Fig. 5 Pigment content in leaves of spl32 and control (CK) during different growth stages
A: 叶绿素 a含量(mg g–1); B: 叶绿素 b含量(mg g–1); C: 类胡萝卜素含量(mg g–1); D: 总叶绿素含量(mg g–1); E: Chl a/Chl b; *在 0.05水
平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
A: chlorophyll a content (mg g–1); B: chlorophyll b content (mg g–1); C: carotenoid content (mg g–1); D: total chlorophyll content (mg g–1);
E: Chl a/Chl b. * Significantly different at P<0.05; ** significantly different at P<0.01.
图 6 突变体 spl32与对照(CK)的叶绿素荧光动力学参数比较
Fig. 6 Chlorophyll fluorescence kinetic parameters of the spl32 mutant and control (CK)
A: CK和 spl32在各时期叶片的 Fv/Fm比较; B: CK和 spl32在各时期叶片的∆F/Fm比较; C: 抽穗期 CK和 spl32的 qP和 NPQ值比较;
D: 灌浆期 CK和 spl32的 qP和 NPQ值比较。
A: Fv/Fm of spl32 and check during different growth stages; B: ∆F/Fm of spl32 and check during different growth stages; C: the qP and NPQ
of spl32 and check during heading stage; D: the qP and NPQ of spl32 and check during filling stage.
第 6期 钟振泉等: 一份新的水稻斑点叶突变体 spl32的鉴定和基因定位 867
图 7 斑点叶性状与白叶枯病抗性的相关性分析
Fig. 7 Association analysis of the spotted-leaf trait and bacterial blight resistance
A: 接菌时 3片功能叶的斑点情况; B: 3片功能叶的病斑调查; C: F2(spl32/日本晴); D: F2(02428/spl32)。
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
A: spots on the three functional leaves when inoculated; B: lesion length of the three functional leaves in CK and Spl32(cm);
C: F2 (spl32/Nipponbare); D: F2 (02428/spl32). * Significantly different at P<0.05; ** Significantly different at P<0.01.
小于后者, 因此其斑点叶个体对白叶枯病的抗性相
对低于后者。由于粤晶丝苗 2号、H4、日本晴和 02428
都对白叶枯病表现高感, 病斑长度均大于 10 cm; 推
测突变体的白叶枯病抗性是由斑点变异引起的, 即
两者呈共分离。
2.8 Spl32(t)基因的遗传分析与分子定位
spl32分别与日本晴和02428配制的 F1均表现为
斑点叶表型, 说明突变表型由显性基因控制。分别
统计 F2 (02428/spl32)群体和 F2 (spl32/日本晴)群体中
的斑点叶和正常绿叶个体数, 调查其分离比例(表2)
表明, 该斑点叶性状受1个显性核基因控制, 暂命名
为 Spl32(t)。
选用02428×spl32杂交的 F2群体为定位群体, 共
获得505个 F2隐性单株(即正常叶表型)。利用本实验
室均匀分布于12条染色体上的617对 SSR 标记对亲
本 spl32和02428进行多态性分析 , 其中共185个标
记表现出明显的多态性, 多态率为30.08%。进一步
利用在两亲本间表现出多态的引物, 扩增正常基因
池和突变基因池, 发现第11染色体的标记 RM21和
RM206与突变体表型有明显的连锁。在定位区间周
围, 进一步开发 Indel 分子标记13个, 其中4个有多
态性(表3)。利用 RM21、RM206以及4个 Indel 标记
对505个正常绿叶的 F2单株进行分析 , 结果标记
RM21、Ind-c、RM206和 Ind-g分别有51、37、35及
48个交换株, RM21交换株包含 Ind-c 交换株, Ind-g
交换株包含 RM206交换株, 且 RM21、Ind-c交换株
与 RM206、Ind-g 交换株互不重叠, 因此将 Spl32(t)
基因初步定位在 Indel 标记 Ind-c 与 SSR 标记
表 2 斑点叶突变体 spl32的遗传分析
Table 2 Genetic analysis of spotted leaf mutant spl32
F2表型 Phenotype of F2
组合
Cross
F1表型
Phenotype of F1
斑点叶单株数
No. of spotted plants
无斑点单株数
No. of normal plants
总数
Total
比例
Ratio
χ2(3:1) χ20.05
spl32/Nipponbare 斑点叶 Spotted plant 683 261 944 2.62︰1.00 3.391
02428/spl32 斑点叶 Spotted plant 1960 613 2573 3.20︰1.00 1.835
3.841
868 作 物 学 报 第 41卷
RM206之间, 与2个标记间的遗传距离分别为3.4 cM
和3.2 cM (图8)。该区间内没有已知可产生斑点叶表
型的基因, 推测 Spl32(t)是一个新的斑点叶基因。进
一步的定位工作正在进行中。
表 3 定位基因 Spl32(t)所用的 4个 Indel引物序列
Table 3 Four Indel primer sequences used for Spl32(t) mapping
标记
Marker
引物
Primer (5′3′)
扩增产物长度
Length of the amplificated products (bp)
物理位置
Location (bp)
退火温度
Annealing temperature (℃)
Ind-a F: GATGGATGGAAGGTCCAACTC
R: CAACAGCGTACACACACACAAG
Japonica, 197; indica, 211 19282003 60
Ind-b F: GGCTATTGGCTAGGCGTTTTAG
R: GTCCTTTACTCCTGAGCATGT
Japonica, 226; indica, 237 19576926 60
Ind-c F: TTCACTACTTGCGTTTCATGTCA
R: GATACGGGTCCTATGTTTCAA
Japonica, 185; indica, 198 19840743 60
Ind-g F: ACCCCAGATTGTCCAGTCCT
R: AAACAGCGTGATGAAGGTGA
Japonica,151; indica, 142 22645403 60
物理位置是以引物序列在日本晴基因组(IRGSP–1.0)进行 BLAST获得。
Physical coordinates of primers were identified through BLAST searching in the Nipponbare rice genome (IRGSP–1.0).
图 8 突变体基因 Spl32(t)的初步定位
Fig. 8 Primary mapping of Spl32(t)
3 讨论
在植物中已发现的大量斑点叶或类病斑突变体
中, 斑点或者类病斑的出现往往还伴随着其他农艺
性状的改变。如突变体 spl28和 RLS1基因会引起植
株早衰[7,21]。HM47突变体株高、分蘖数、穗长、每
穗粒数、结实率和千粒重都显著低于其野生型[41]。
本研究的斑点叶突变体 spl32 从幼穗分化期开始出
现褐色斑点, 属扩散型斑点叶突变体。与对照相比,
突变体 spl32的每穗粒数显著降低, 每穗实粒数和结
实率极显著降低。梁颖等[42]研究表明, 叶绿素含量
是影响油菜生物产量的主导因素。本研究中突变体
光合色素含量在斑点出现后极显著降低, 说明斑点
的出现影响了突变体色素合成, 进而影响植株光合
产物的积累, 这可能是引起突变体每穗实粒数和结
实率下降的主要原因。斑点出现后的叶绿素荧光动
力学参数无明显变化, 说明 Spl32(t)基因突变对植株
光合作用途径影响不大, 这也可能是整体农艺性状
下降幅度不显著的原因之一。
斑点叶形成的原因很复杂, 它是由植物自身的生
理原因和外界环境中的众多因素共同作用决定的[43]。
大部分斑点或者类病斑的出现是由于植物本身细胞
死亡引起的, 如 Frye 等在番茄过量表达 Pto 基因导
致了斑点叶的产生[44]; 水稻斑点叶突变体 spl5 是因
为活性氧产生的途径被突变而加强, 使得细胞内 O2܋
大量积累, 导致叶片上形成斑点性状[45]。部分突变
体斑点的形成则推测是色素的积累。Huang等[30]研
究表明斑点叶突变体 spl30 的红棕色斑点为某种未
知色素积累造成的。本研究鉴定的 spl32经台盼蓝染
色, 未发现有细胞死亡的情况, 说明突变体斑点的
产生不是由于细胞死亡引起的, 具体原因还有待进
一步的研究。同时, 本研究中的突变体 spl32斑点表
型的出现受自然光照的诱导, 且其斑点形成信号不
能系统传递。
许多斑点叶突变体出现也伴随抗逆性和抗病性
的增强。虞锦玲等[46]研究一份经日本晴诱变的类病
斑突变体发现, 突变体植株的 SOD、POD、CAT 活
性和 MDA 含量均明显高于野生型植株, 说明类病
变的出现增强了突变体的抗逆性。一些水稻斑点叶
突变体如 spl10、spl11、spl17、spl28 和 spl26 等对
稻瘟病和白叶枯病表现出广谱抗性[7,12,28-29]。本研究
发现突变体 spl32 的 SOD 和 POD 活力均高于对照,
说明突变体较对照有更强的抗氧化能力, 抗逆性更
强。同时本研究中突变体 spl32对白叶枯病抗性极显
著增强, 且白叶枯病抗性与斑点共分离。水稻中虽
然发现了许多抗病基因, 且其中一些基因如 Xa21、
xa5、Xa7、xa13、Pi-zt、Pi-ks、Pi-sh 等[47-48]已经运
第 6期 钟振泉等: 一份新的水稻斑点叶突变体 spl32的鉴定和基因定位 869
用到抗病育种中去, 但是这些基因存在小种专一化
和抗性不持久等问题。突变体 spl32斑点的出现不会
引起植株的早衰, 不显著影响植株的光合作用, 且
可以提高植株的白叶枯病抗性, 激活植株的整体抗
性, 是水稻抗病育种潜在的种质资源, 对植物抗病
机理及植物抗病育种等相关研究具有重要意义。
迄今, 通过分子标记定位的几十个水稻类病变
基因分布于除第 9染色体以外的其他 11条染色体。
其中在第 11 染色体上鉴定了 2 个斑点叶相关的基
因。一个是叶鞘坏死基因 nls1, 被定位于第 11 染色
体短臂, 已经被克隆, nls1突变体在叶鞘出现自发坏
死斑。nls1 编码一个典型的 CC-NB-LRR类 R蛋白,
其功能获得性突变导致了突变体特定组织细胞的自
主性死亡[22]。另一个是类病斑及早衰基因 lms1[49],
被定位于第 11染色体长臂末端, 其突变体植株在叶
片和茎部出现黄褐色小斑点, 抽穗期后呈现穗、茎、
叶明显干枯, 并快速衰亡。其性状受单隐性核基因
控制。本研究的突变体其斑点性状首先出现在叶片
上, 受单显性核基因 Spl32(t)控制, 初步定位于第 11
染色体长臂标记 Ind-c 和 RM206 之间, 该区间内没
有已知可造成类似表型的基因, 因此 Spl32(t)是一个
新的斑点叶基因。
突变体 spl32 的褐色斑点可能是由于未知色素
积累而形成, 对此类非细胞死亡引起的斑点叶突变
体的相关研究还很少。本研究从形态学、生理生化、
分子遗传学等方面对 spl32 开展研究, 为 Spl32(t)的
克隆和功能验证奠定了基础, 对研究植物斑点叶的
发生机制具有重要意义, 也为水稻抗病种质资源的
创制提供了新的思路。
4 结论
水稻斑点叶突变体 spl32 在幼穗分化期开始
在叶尖出现褐色斑点 , 此后斑点由叶边缘向叶片
内部扩散 , 直至遍布整个叶片 ; 其斑点的出现受
自然光诱导 , 但并非由细胞死亡引起。斑点的出现
会降低其光合色素含量 , 但对荧光动力学参数并
无明显影响 , 不影响植株的 PSII。与对照相比 , 穗
粒数和结实率等部分农艺性状显著下降 , 抗氧化
能力增强 ; 对白叶枯病的抗性增强 , 且白叶枯病
抗性与斑点共分离。该性状受 1个显性基因 Spl32(t)
控制 , 位于第 11 染色体 Ind-c 和 RM206 之间。本
研究结果为 Spl32(t)基因的进一步克隆和功能分析
奠定了基础。
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